马氏珠母贝B型清道夫受体PmSR-B基因克隆与表达性分析

采用c DNA末端快速扩增技术克隆获得马氏珠母贝清道夫受体基因c DNA全长序列(Pm SR-B);利用荧光定量技术检测Pm SR-B基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm SR-B基因c DNA序列全长1 857 bp,开放阅读框(ORF)长1 443 bp,编码480个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长89 bp,3′UTR长325 bp。预测其分子质量为54.77 ku,等电点为7.94,脂溶性系数92.94,总平均亲水性-0.120,属于疏水性蛋白;不稳定指数26.37,属于稳定蛋白。氨基酸序列同源比对结果,Pm SR-B氨基酸序列与其他物种具有一定的保守性,与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)SR-B的序列的相似度高达47%。荧光定量PCR检测结果,Pm SR-B在肝胰腺中表达量最高,其后依次是鳃、闭壳肌、中央膜,各组织的表达量差异具统计学意义(P0.05)。     

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆马氏珠母贝（Pinctadamαrtensii）热休克蛋白HSP60基因 cDNA全序列。序列全长2495坤,开放阅读框（ORF） 1734坤,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79阳, 理论等电点为5.4905＇非翻译区（ 5＇UTR）长150坤, 3＇非翻译区（3＇UTR）长611 bp。同源性比对分析结果,马 氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡妨（Crωsos仰a gIgω）和光滑双蹄螺（Biomphalaria glabrata）的同源性较 高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的rnt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套腹、血淋巴、肝膜腺、性腺、躁、等6个组织中具有表达,在肝膜腺中表达量最高,腮中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖剌激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意 义（P〈0.05）。     

马氏珠母贝载脂蛋白-2基因的克隆与表达分析

以RACE技术克隆获得马氏珠母贝载脂蛋白-2(Pm-ApoL2)基因cDNA全长序列,以传统萃取法提取黄色与白色闭壳肌个体的类胡萝卜素,以荧光定量技术检测Pm-ApoL2基因在各个组织中的表达量及黄与白闭壳肌个体的Pm-ApoL2表达量。结果表明,Pm-ApoL2基因cDNA序列全长1 328 bp,开放阅读框(ORF)长705 bp,编码234个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长342 bp,3′UTR长281 bp。Pm-ApoL2在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃、闭壳肌,其中肝胰脏表达量显著大于其它3个组织(P0.05)。黄、白色闭壳肌个体之间的类胡萝卜素含量和Pm-ApoL2的表达量都存在显著性差异(P0.05),且二者的类胡萝卜素含量与Pm-ApoL2表达量呈显著正相关。Pm-ApoL2基因为马氏珠母贝类胡萝卜素代谢候选基因。     

马氏珠母贝PmFAMeT基因的克隆及表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。     

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。     

马氏珠母贝DNA甲基化转移酶Dnmt1的克隆及表达

【目的】对马氏珠母贝(Pinctada martensii)DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)的基因全长及组织表达作分析,探究马氏珠母贝甲基转移酶Dnmt1(PmDnmt1)参与贝壳矿化调控机理。【方法】利用RACE技术获得PmDnmt1的c DNA序列全长,并对PmDnmt1的序列特征进行分析,同时利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术检测马氏珠母贝不同组织中PmDnmt1的表达情况。【结果与结论】PmDnmt1基因c DNA长4 818 bp,其中,开放阅读框为4 623 bp,编码1 540个氨基酸。预测分子质量约为174.55 ku、理论等电点为5.89。结构域分析显示,PmDnmt1具有DMAP结合结构域、DNMT1-RFD结构域、锌指结构、BAH结构域和C5胞嘧啶DNA甲基化酶结构域等。多序列比对结果发现,Dnmt1在不同物种间具有较高保守性。实时荧光定量PCR分析显示PmDnmt1在所有检测组织中均有表达,在外套膜中央膜部分的表达量最高(P 0.05)。PmDnmt1可通过调控外套膜的DNA甲基化修饰参与贝壳的形成。     

马氏珠母贝选系F_2早期选择反应和现实遗传力估计

对马氏珠母贝基础群体进行持续选择建立选系F2,比较了选系F2与对照群体早期生长差别,并估计了选择反应和现实遗传力。结果表明,在第8、14、21和35天,选系F2的平均壳长显著大于对照群体(P<0.05)。在第8、14、21和35天,选择反应和现实遗传力变化范围分别为0.63～0.89和0.36～0.51。本研究表明利用群体选择可以明显改良马氏珠母贝养殖群体的生长性状。     

马氏珠母贝Su(H)基因克隆与组织特异性表达

Su(H)基因(Suppressor of Hairless gene)对生物体细胞的分化、增殖和凋亡起重要的调控作用。根据马氏珠母贝(Pinctada martensii)转录组数据库中注释为Su(H)的unigene序列设计基因特异性引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝Su(H)[pm-Su(H)]基因cDNA全长序列。结果表明:pm-Su(H)基因全长3 830 bp,其中开放阅读框含有1 920 bp,编码640个氨基酸残基,5'UTR为1 568bp,3'UTR为342 bp,含有27 bp polyA;预测其分子质量为70.6 ku,等电点为7.38;多序列比对显示,pm-Su(H)与其他物种的Su(H)有较高的保守性,与牡蛎(Crassostrea gigas)的同源序列高达80%;荧光定量PCR分析表明,pm-Su(H)在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、珍珠囊、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴等8组织中均有表达,其中以性腺中表达量最高,其次是珍珠囊和外套膜。     

马氏珠母贝PmLec-8基因的克隆与表达分析

Lec-8(C-type lectin 8)属于C-型凝集素超家族,在机体抵抗微生物的感染过程起重要的作用。本研究采用RACE技术克隆出了PmLec-8基因cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了PmLec-8基因在马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)不同组织中的表达模式。结果显示:PmLec-8基因序列全长737 bp,其中5′UTR长为36 bp,3′UTR长为113 bp,开放阅读框(ORF)为588 bp,编码195个氨基酸,预测其分子质量约为22.90 ku,等电点为5.17;PmLec-8具在一个糖类识别结构域(Carbonhydrate-recognition domain,CRD),符合典型的C型凝集素(C-type lectin)家族特征;多序列比对结果表明物种间Lec-8的同源性较低,4个半胱氨基酸残基高度保守;qRT-PCR数据分析表明,PmLec-8在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞和外套膜中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高,其次是鳃,差异具统计学意义(P0.05)。     

马氏珠母贝珍珠囊发育的组织和组织化学研究

按照常规技术进行马氏珠母贝插核育珠,在手术后第1、3、7、15、20、30和60天解剖剪取珍珠囊,利用H E染色等组织化学方法研究马氏珠母贝珍珠囊形成过程中的组织学和组织化学变化。结果表明:珍珠囊表皮细胞来自于移植细胞小片的表皮细胞;在水温27℃条件下,插核后1~3 d来自育珠贝的游走细胞逐渐将细胞小片包围;插核后7~15 d,珠核表面密集来自育珠贝的游走细胞;插核后15～20 d,细胞小片外表皮细胞增殖形成珍珠囊,珍珠囊表皮细胞和细胞核均呈扁平状;插核后20～30 d,扁平状珍珠囊表皮细胞逐渐转变为高柱型,并分泌形成透明的壳皮层物质;在插核后第60天,已形成具有分泌珍珠质功能的扁平状珍珠囊表皮细胞,细胞核呈椭圆形或近圆形。     

马氏珠母贝经济性状对体重决定效应分析

采用通径分析方法研究了不同养殖区马氏珠母贝各分性状对体重的决定效应。结果表明:流沙养殖群体分性状壳长、壳高、壳宽、铰合线长、软体部重和闭壳肌重与体重间呈正相关(P<0.01),对体重的直接决定效应分别为0.091、0.072、0.029、0.002、0.089和0.001,间接决定效应分别为0.319、0.284、0.183、0.03、0.304和0.004,总决定效应分别为0.41、0.356、0.212、0.032、0.393和0.005;6个经济性状与体重间的关系在抽样断面上可用线性回归模型拟合,复相关系数达0.939(P<0.01)。6个性状3类决定效应按大小排列均为壳长>软体部重>壳宽>壳高>铰合线长>闭壳肌重。迈陈养殖群体作为验证群体,各效应值与前者有差异,但3类决定效应大小排序与前者完全相同。基于决定效应大小及性状易测性,育种目标性状的选择策略为首选壳长,二选壳高,三选壳宽。研究还发现壳宽对软体部重具有最大的决定效应,提出加大壳宽选择强度以培育大型珍珠新观点。     

马氏珠母贝Pm-miR-183序列分析及功能研究

用马氏珠母贝基因组序列,通过生物信息学方法获得Pm-miR-183的前体,长度76 bp,具有典型的茎环结构。成熟序列及前体序列的同源性分析均显示较高的种间保守性。Pm-miR-183前体序列(Pm-pre-miR-183)的系统进化树分析,Pm-pre-miR-183与帽贝同源性较高。靶向关系分析,Pm-miR-183与矿化基因及免疫相关基因均存在靶向作用位点。实时荧光定量分析,Pm-miR-183在马氏珠母贝的各组织中均有表达。注射Pm-miR-183mimics进行过表达,Pm-miR-183的表达量在套膜区(MP)中显著上调(P0.05)。扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)检测,Pm-miR-183过表达会导致贝壳珍珠层生长出现紊乱。     

马氏珠母贝胚胎和早期幼虫冷冻的研究

0～4℃下,不同发育时期的马氏珠母贝(Pinctada martensii)胚胎和幼虫在不同浓度的DMSO抗冻保护液中放置30min后,置室温恢复,并以不同浓度的DMSO作为抗冻保护液,通过缓慢降温对不同发育时期的胚胎和早期幼虫进行超低温(-196℃)冷冻、35℃水浴快速解冻。结果表明:低温下DMSO对胚胎和早期幼虫活力影响较弱;马氏珠母贝的囊胚和担轮幼虫存活率较低。当DMSO体积分数为14%时,原肠胚的存活率为10%左右,且部分胚胎能够继续发育至D形幼虫;当DMSO体积分数为14%、16%时,解冻后的D形幼虫存活率超过49.9%,其中大部分存活48h以上。     

马氏珠母贝α2-巨球蛋白受体结合区酵母双杂交系统的构建及自激活检测

【目的】构建马氏珠母贝(Pinctada martensii)酵母双杂交文库及α2-巨球蛋白受体结合区诱饵载体,检测其在酵母细胞中的自激活作用。【方法】利用CLONTECH SMART技术及酵母体内同源重组的方法构建马氏珠母贝酵母双杂交cDNA文库;将α2-巨球蛋白受体结合区克隆至pGADT7载体,并转化AH109酵母感受态细胞,检测自激活作用。【结果与结论】酵母双杂交文库容量为1.11×107克隆/mL,重组率大于90%;菌落PCR结果显示,插入片段长度均在500bp以上;诱饵质粒成功转化至AH109菌株,且无自激活性,符合文库构建指标,可用于文库筛选。     

马氏珠母贝细胞周期分裂基因CDC45基因特征、表达量与性状相关分析

采用RACE技术克隆了马氏珠母贝细胞周期分裂基因45(Pm-CDC45)全长序列,利用荧光定量PCR检测该基因在闭壳肌、鳃、性腺与外套膜组织的表达量,并估计基因表达量与金黄壳色第3代选育群体壳高性状的相关性。结果表明:Pm-CDC45基因序列全长为2 091 bp,5′非编码区(5′UTR)为157 bp,3′非编码区(3′UTR)为34 bp,其中开放阅读框为1 967 bp,编码655个氨基酸;Pm-CDC45在各组织的相对表达量存在显著差异(P0.05),其中闭壳肌表达量最高,鳃和性腺为其次,外套膜最低;Pm-CDC45基因相对表达量与选育群体壳高性状与存在显著的正相关(r=0.531,P0.05);马氏珠母贝Pm-CDC45为影响壳高性状基因。     

马氏珠母贝4种壳色家系遗传差异的SSR分析

采用6对微卫星分子标记,分析了马氏珠母贝(Pinctada martensii)白、黑、黄、红4种壳色家系的遗传结构。结果表明:4种壳色家系在6个位点的平均等位基因数为4.17,有效等位基因数为1.297~1.819;平均观测杂合度为0.083~0.212,平均期望杂合度为0.207~0.341;Shannon多样性指数为0.366~0.616;平均多肽信息(PIC)含量为0.257~0.442;4个壳色家系哈-温平衡指数均发生了极显著的偏离,4个家系间的群体再分效应的固定指数FST值为0.113~0.793;与马氏珠母贝普通养殖群体及壳色选育系F5相比,4种壳色家系之间遗传距离变大,遗传多样性降低。     

马氏珠母贝TRACP基因的克隆及组织表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)基因,分析该基因在不同组织中的表达模式。【方法】用RACE技术克隆得马氏珠母贝TRACP基因(PmTRACP),用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【结果与结论】PmTRACP基因长度为2 034 bp,开放式阅读框972 bp,编码323个氨基酸,5′UTR长度为27 bp,3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku,理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48%～65%,与长牡蛎(Crassostrea gigas)TRACP的同源性最高,同时D³²、D⁷⁰、Y⁷³、N¹⁰⁸、H²⁰³、H²¹²、H²³⁷、H²³⁹等8个氨基酸活性位点和N¹¹⁴糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。PmTRACP在马氏珠母贝各个组织均有表达,且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。     

马氏珠母贝Perlucin基因序列特征及其SNP与耐低温性状的关系

【目的】克隆马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）新的凝集素分子基因,命名为Perlucin,研究在低温胁迫下马氏珠母贝Perlucin的表达以及与抗低温性状相关的单核苷酸多态性（SNP）位点。【方法】根据马氏珠母贝基因组中Perlucin基因序列设计引物,克隆Perlucin基因全长;用生物信息学方法分析Perlucin的结构和理化特征;设计17和22℃（对照）2个温度组,对马氏珠母贝进行低温胁迫实验,用实时荧光定量PCR检测低温胁迫下Perlucin表达量的变化;筛选和比较分析马氏珠母贝耐低温选育系（R）F3和北部湾野生群体（W）的Perlucin外显子区的SNP位点和单倍型。【结果】马氏珠母贝Perlucin全长631 bp,编码152个氨基酸;包含1个信号肽和1个C型凝集素结构域。同源分析表明,马氏珠母贝Perlucin与紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）Perlucin的亲缘性最近。Perlucin在鳃中表达量最高,其次为足和肝胰腺。低温胁迫时,鳃组织中Perlucin基因在17℃低温组的表达量呈先升高后降低的趋势,在12 ...     

马氏珠母贝生长性状与珍珠质量和珍珠层厚度的相关分析

以马氏珠母贝快速生长选系F3为材料,以常规技术插核操作并进行海区养殖,育珠期结束,测量育珠母贝的壳长、壳高、壳宽、总质量与壳质量共5个生长性状指标,以及商品珍珠质量与珍珠层厚度,分析育珠贝生长性状指标与珍珠层厚度及珍珠质量的相关性。结果表明:马氏珠母贝的生长性状与珍珠层厚度及珍珠质量均存在极显著相关性(p值<0.01);壳长、壳高、壳宽、总质量、壳质量与珍珠层厚度的相关系数分别为0.481、0.412、0.418、0.457、0.456;壳长、壳高、壳宽、总质量、壳质量与珍珠质量的相关系数分别为0.467、0.468、0.380、0.556、0.644。通过改良马氏珠母贝养殖群体的生长性状能够有效提高珍珠的质量。     

马氏珠母贝育珠效果影响因素分析

设立3个实验,分别比较了植核时间、植核贝龄、育珠模式对马氏珠母贝育珠效果影响。实验I,设立A1、A2和A3组,植核时间分别设置4月份、7月份和10月份;实验II,设立B1、B2、B3和B4组,植核贝龄分别设置1.0龄、1.5龄、2.0龄和2.5龄;实验III,设立C1、C2和C3组,育珠模式分别设置海区休养与育珠、池塘休养与育珠和池塘休养与海区育珠。按常规技术植核,经1个月的休养期和15个月的育珠结束后,比较各组间休养与育珠的成活率、留核率、成珠率、优良珠率及育珠绩效值的差异。结果表明:植核时间、植核贝龄、育珠模式对植核贝的成活率和育珠绩效值均存在显著的影响(p值<0.05);对育珠贝的留核率、收珠率和优良珠率无显著性影响(p值>0.05);实验I,A1组(4月份植核)育珠绩效值最高,A2组(7月份植核)育珠绩效值最低;实验II,B2(1.5龄)育珠绩效值最高,B4组(2.5龄)育珠绩效值最低;实验III,C3组(池塘休养与海区育珠)的育珠绩效值最高,C2组(池塘休养与育珠)育珠绩效值最低。马氏珠母贝适宜的植核时间为4月份,适宜的植核贝龄为1.5龄,利用池塘休养结合海区育珠能够有效提高育珠效果。