酵母双杂交系统的改进与研究进展

酵母双杂交系统是一种新兴的体内研究蛋白质之间相互作用以及筛选cDNA文库的技术手段,自建立以来得到了不断的改进与发展。在此基础上又相继出现了单杂交、三杂交、反向双杂交以及SOS富集系统等多种衍生系统,它们在功能基因组学、蛋白质组学以及药物开发研究中发挥了重要作用。本文拟就双杂交系统的原理、改进、发展及应用做一综述。     

对虾白斑综合症病毒VP37基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测

把对虾白斑综合症病毒(White syndrome spot virus,WSSV)黏附蛋白VP37的基因C末端截去102个碱基后设计了一对引物,通过PCR扩增出目的片段。用其构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用和自激活活性。结果获得截短的VP37基因片段,并成功克隆入酵母双杂交系统PGBKT7 DNA-BD载体中,测序结果表明序列完全正确。把重组载体转化酵母菌AH109并检测自激活作用。结果显示表达的融合蛋白没有激活ADE2,HIS3这2个报告基因,但激活了MEL1,该融合蛋白对酵母菌AH109无毒性。可利用其它2种报告基因将其应用于酵母双杂交系统,筛选cDNA文库中与之相互作用的基因。     

鉴定病毒受体的研究方法

研究病毒受体对了解病毒感染机制、病毒病的预防与治疗、病毒分类等都有重要意义。本文重点就酵母双杂交系统以及病毒蛋白铺覆技术、噬菌体展示、生物芯片、荧光共振能量转移等可用来进行病毒受体鉴定研究的几种方法做了介绍。     

条斑紫菜酵母双杂交文库的构建及PyMAPK5互作蛋白的筛选

为进一步研究条斑紫菜促分裂原活化激酶家族PyMAPK5的下游互作蛋白,理解其生物学功能,本研究通过酵母双杂交的方法进行其相互作用蛋白的筛选。提取不同温度和失水逆境胁迫下的RNA,利用Invitrogen体系构建条斑紫菜酵母双杂交cDNA文库,其库容为1.44×107CFU,重组率为91.8%。以pGBKT7-PyMAPK5为诱饵蛋白载体,利用共转化方法,从文库中筛选得到26个与PyMAPK5互作的候选蛋白。候选蛋白集中在光系统II相关蛋白、捕光蛋白、微管蛋白、ATP酶、GTP结合蛋白及假设蛋白等。微管蛋白、捕光蛋白、光系统II蛋白一对一验证结果为阳性,表明在酵母体内存在互作。本研究为阐明条斑紫菜PyMAPK5与其互作蛋白的关系及解析PyMAPK5下游作用机制奠定了基础。     

利用酵母双杂交研究铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB的自身相互作用

从铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7820中克隆了生物钟基因kaiB,并将其克隆入酵母双杂交系统的两个质粒pGADT7和pGBKT7中。经测序验证后,将重组质粒pGADT7-kaiB和pGBKT7-kaiB转化酵母菌AH109进行自激活性和自身相互作用的检测和验证。结果表明,铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB无自激活性,KaiB蛋白自身能发生相互作用。因此,可用KaiB蛋白为诱饵利用酵母双杂交系统筛选文库钓取与KaiB发生相互作用的蛋白。     

藻类基因转录调控研究进展

转录调控是基因表达调控的重要方式。转录调控的研究主要集中在启动子的克隆与分析、反式作用因子(即DNA结合蛋白)的检测及转录量的检测三方面。介绍了基因组步移、凝胶阻滞、酵母双杂交系统、cDNA微阵列等基因转录调控的常用研究方法,并对藻类基因转录调控的最新研究进展进行了评述。     

锯缘青蟹(Scylla serrata)呼肠孤病毒5个结构蛋白互作分析

采用酵母双杂交系统,对青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus)5个结构蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)间的双向互作进行了分析。将5个结构蛋白对应的ORF分别亚克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7,成功构建了10个酵母双杂交重组载体。将重组诱饵载体或重组捕获载体转化至酵母菌Y2H Gold中进行自激活检测,结果显示5个结构蛋白均不能激活酵母菌报告基因HIS3的表达,表明5个病毒蛋白均不具有自激活活性。通过酵母双杂交实验,从5个结构蛋白25个可能性互作对中,共筛选出2个双向互作对(VP11VP6,VP11VP12)和3个自身互作对(VP3VP3,VP11VP11,VP12VP12)。本研究是有关Ss RV结构蛋白互作的首次报道。     

应用酵母双杂交系统筛选虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白

FOXL2是脊椎动物的雌性决定基因,在多种无脊椎动物中也被认为是雌性决定与分化的关键基因,但其在无脊椎动物中的作用机制目前尚不清晰。本文利用Clontech酵母双杂交系统筛查虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白。研究首先构建诱饵质粒pGBKT7-FOXL2,并检测诱饵蛋白的毒性及自激活活性,结果显示诱饵蛋白对酵母菌株无毒,也无自激活活性。利用该诱饵质粒,本研究从虾夷扇贝酵母双杂交cDNA文库筛选得到17个阳性克隆,测序验证得到12个读码框正确的阳性克隆,它们来自4种蛋白:COP9信号复合体亚基5、钠/钾ATP酶β3、哺乳动物室管膜相关蛋白1和胰脂肪酶相关蛋白2。研究进一步将诱饵质粒与4种蛋白的猎物质粒进行共转化验证,结果均为阳性,表明这4种蛋白与虾夷扇贝FOXL2都可能存在相互作用。本文为研究FOXL2在无脊椎动物性别决定与分化中的作用提供了参考。     

酵母双杂交系统用于WSSV结构蛋白VP39相互作用的宿主蛋白基因的初步研究

为研究WSSV的结构蛋白VP39相关蛋白的基因,应用酵母双杂交系统筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。将构建好的VP39基因的重组载体pGBKT7-VP39转化酵母Y187后,与含文库质粒的酵母株AH109融合,在营养缺陷培养基上进行反复筛选,得到1个阳性克隆,测序并进行生物信息学分析。结果显示,此cDNA片段在数据库中是新序列,该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。本实验成功筛选了VP39相关蛋白的cDNA片段,为进一步研究WSSV的致病机理奠定了基础。     

Xp11.2区域YAC OAT1中表达顺序筛选

筛选 X染色体 Xp11.2区域的酵母人工染色体 ( YAC)克隆 OAT1所包含的表达序列 ,为该区域疾病相关基因的克隆探索方法。以 YAC克隆 OAT1为探针 ,与胎脑 c DNA文库的噬菌体原位裂解膜进行两轮杂交。所得的阳性克隆经过杂交鉴定剔除假阳性克隆和重复序列 ,并进行测序分析。获得了一个 YAC OAT1编码的表达顺序克隆。该克隆与鸟氨酸转氨酶 ( Ornithine Amino-transferase,OAT)基因同源     

Epsilon-变形菌趋化信号通路中偶联蛋白CheV与趋化受体蛋白的CZB结构域的功能研究

细菌通过趋化系统感知和响应外界环境变化并进行趋利避害, 因此很多细菌进化出了非常复杂多样的趋化系统以适应不同的生态位。Epsilon-变形菌广泛存在于自然界中, 能适应不同的生态环境, 特别是深海Epsilon-变形菌能适应深海热液口和冷泉等极端环境, 其趋化系统可能有其独特之处。通过BlastP和MIST数据库分析, 我们发现大部分深海Epsilon-变形菌拥有F3类型趋化系统且具有单拷贝的双功能域融合蛋白CheV。此外, 一种特殊结构域CZB (C-terminal Zinc-Binding) 存在于深海Epsilon-变形菌的趋化受体蛋白中, 而且在部分深海Epsilon-变形菌的趋化受体中还发现并鉴定了一种新的结构域CZB-like结构域。文章以Epsilon-变形菌的模式菌株空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni 81-176)为研究对象, 用细菌双杂交试验证实了CheV能与所有含MA结构域的趋化受体相互作用。用电感耦合等离子体质谱(ICP-Mass)技术证实了CZB-like结构域不能结合Zn离子, 但细菌双杂交试验证实它能介导趋化受体Tlp9与CheV的互作。     

利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白

采用酵母双杂交技术,对草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)非结构蛋白NS38相互作用的蛋白进行了筛选,并对阳性克隆中的插入序列进行测序与生物信息学分析。结果表明,含有重组质粒pGBKT7-NS38的酵母菌Y2HGold与含有草鱼肾脏细胞(CIK)cDNA文库质粒的酵母菌Y187融合成功,并筛选得到3株阳性克隆;发现两条不同的插入序列,其中一条序列编码的蛋白与40S核糖体蛋白S16亚基的同源性高达99%,而另一序列相应的蛋白不存在匹配的蛋白。该结果为进一步深入研究NS38蛋白在GCRV096复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

油气汇聚体系

油气汇聚体系是一个不同于含油气系统和油气成藏系统的概念,它提出的目的旨在讨论层序格架中油气成藏单元与层序级次之间的关系。油气汇聚体系由储集系统和油气输导系统构成,储集系统可以分为高连通、大容量,中连通、中等容量,低连通、小容量3种类型;油气输导系统分为单一型和综合型两种类型。油气汇聚体系分为大型、中型、小型3种类型,每种类型所对应的储集系统和油气输导系统各不相同。该概念的提出,为研究层序格架中各种规模的油气汇聚体系与层序格架之间的关系提供了理论基础。     

海道测量专家系统开发构想

世界各国已经在许多重要领域研制出了大量实用的专家系统.围绕专家系统构造条件,从海道测量专家系统开发的可能性、合理性和必要性方面进行分析,提出了海道测量专家系统构建设想.     

Dynamics of large-truncated mooring systems coupled with a catenary moored semi-submersible

With the floating structures pushing their activities to the ultra-deep water,model tests have presented a challenge due to the limitation of the existing wave basins.Therefore,the concept of truncated mooring system is implemented to replace the full depth mooring system in the model tests,which aims to have the same dynamic responses as the full depth system.The truncated mooring system plays such a significant role that extra attention should be paid to the mooring systems with large truncation factor.Three different types of large truncation factor mooring system are being employed in the simulations,including the homogenously truncated mooring system,non-homogenously truncated mooring system and simplified truncated mooring system.A catenary moored semi-submersible operating at 1000 m water depth is presented.In addition,truncated mooring systems are proposed at the truncated water depth of 200 m.In order to explore the applicability of these truncated mooring systems,numerical simulations of the platform’s surge free decay interacting with three different styles of truncated mooring systems are studied in calm water.Furthermore,the mooring-induced damping of the truncated mooring systems is simulated in the regular wave.Finally,the platform motion responses and mooring line dynamics are simulated in irregular wave.All these simulations are implemented by employing full time domain coupled dynamic analysis,and the results are compared with those of the full depth simulations in the same cases.The results show that the mooring-induced damping plays a significant role in platform motion responses,and all truncated mooring systems are suitable for model tests with appropriate truncated mooring line diameters.However,a large diameter is needed for simplified truncated mooring lines.The suggestions are given to the selection of truncated mooring system for different situations as well as to the truncated mooring design criteria.     

光纤化学/生物传感技术在海洋环境监测中的应用

本文通过光纤溶解氧、 p H、湿度等化学传感探头及发光菌水质毒性监测生物传感探头的研制 ,开发出了一类能用于环境监测的新型传感器。本文的创新之处在于传感探头的设计与包装 ,以及数种可逆性、选择性、稳定性、使用寿命、响应时间、灵敏度等响应特性具佳的化学及生物传感膜的配方和制作技术。利用这些技术 ,通过对光纤探头的设计与包装 ,可以实现在现场及实验室模拟条件下对样品的选择性检测。研制的传感器能广泛应用于海洋污染调查、内河水质评价、水产养殖、工矿企业水气排污自检等诸多方面。     

以GIS为平台的海岛资源环境信息系统

地理信息系统是一种应用范围很广，地理信息管理功能十分强大的计算机应用软件。这种软件的应用与发展目前也得到海岸带科技、管理人员的重视．我们尝试用MAPINFO建立了江苏海岛资源环境信息系统，实践证明了这一系统的实用性和先进水平。本文介绍了该系统的主要功能，并打算以此为基础建立海岸带资源环境信息系统，为江苏的“海上苏东”建设服务。     

深海石油平台及其锚固基础形式评述

随着全球对能源需求量的不断增加,海上石油开发逐渐向深海甚至超深海范围发展,传统的海洋平台已经不能满足海洋油气开发的需要。顺应式塔式平台(CT或CPT)、张力腿式平台(TLP)、迷你张力腿式平台(Mini-TLP)、Spar平台、水下生产系统(Subsea System)、浮式生产系统(FPS)和浮式生产储油装置(FPSO)等各种结构形式被用于深海的开发。随着水深的发展,系泊系统(含锚固基础)成为平台的关键部分。深入了解这些结构各自的特点、使用情况以及锚固方法,将有助于我国深海石油事业的发展。     

沿海区域不同坐标系统转换方法研究

沿海区域的测绘资料主要采用1954年北京坐标系、1980西安坐标系和2000国家坐标系(旧称WGS84坐标系),造成使用不便,需要构建这些系统之间的转换关系。不同方法和不同分区的大量试算表明,1980西安坐标系与WGS84坐标系可以采用7参数转换模型,3个分区和5个分区的精度都能达到0.5 m,其中5个分区的精度较好。由于1954年北京坐标系的特殊性,简单的7参数模型不能确保系统的转换精度,1954年北京坐标系与WGS84坐标系最好采用曲面拟合方法实现坐标转换,整个沿海区域采用6个分区,精度可以达到0.5 m以内的转换要求。