以斑马鱼为疾病模型的小分子药物筛选研究进展

斑马鱼具有体积小,产卵量多,发育迅速,胚胎透明等特点,目前已成为一种非常重要的发育生物学模式动物。同时,斑马鱼胚胎体外发育,小分子化合物渗透性强,这些优势使其成为大规模小分子药物筛选的理想模型。近年来,随着以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术的兴起,大量的转基因斑马鱼和突变体被构建出来,成为模拟人类疾病的良好模型,这些模型被广泛应用于药物筛选的多个方面。利用斑马鱼进行药物筛选,不仅具备高通量、低成本的优点,还能够比较准确的评估药物效果以及药物毒性。本文主要介绍了斑马鱼的特点以及其作为疾病模型在药物筛选中的应用,旨在帮助人们了解斑马鱼药物筛选的研究进展以及阐明斑马鱼在新药研发中的优势。     

中国科学家首次敲除斑马鱼1号染色体全基因

10月10日，斑马鱼1号染色体全基因敲除计划结题会暨第二届全国斑马鱼PI大会开幕式在武汉召开。会上科学家们宣布，中国科学家基本敲除了斑马鱼1号染色体上的1333个基因，这也是世界上科学家首次完成斑马鱼1号染色体全基因敲除计划，为研究人类疾病演化及治疗奠下科学基石。基因敲除是指针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响.     

鱼类Ⅲ型Myosin基因家族成员的表达和功能研究

Ⅲ型Myosin蛋白在哺乳动物的听觉毛细胞中发挥重要功能,其突变可导致内耳毛细胞功能异常,引起听力丧失,但在鱼类胚胎中的表达及功能仍不清楚。本研究以斑马鱼(Danio rerio)作为研究对象,研究了Ⅲ型Myosin基因家族成员myo3a及myo3b在斑马鱼早期胚胎中的表达及功能。整胚原位杂交结果显示:myo3a及myo3b在早期10体节前均无明显表达;在受精后24 h胚胎中,myo3a基因的表达主要集中在脑部,并在端脑及间脑部位有强烈表达;而myo3b的表达主要集中在神经管腹部神经元细胞中。进一步双荧光原位杂交染色结果显示,myo3b主要在神经管腹部脑脊液接触神经元(CSF-cNs)中表达。此外,与人及小鼠类似,斑马鱼myo3a及myo3b基因在内耳中均有表达,暗示其功能在内耳发育中的保守性。为进一步研究其功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术对myo3a和myo3b基因进行敲除,获得了相应的突变体。对突变体的初步研究表明,myo3a和myo3b的单独缺失对斑马鱼的内耳毛细胞以及神经管的发育均无显著影响,而双突变胚胎出现眼睛变小,鱼鳔不能形成以及毛细胞纤毛变短等表型,表明Ⅲ型Myosin基因家族在斑马鱼的胚胎发育中发挥一定的功能。     

蓝色新事

正1基因中国科学家首次敲除斑马鱼1号染色体全基因10月10日,斑马鱼1号染色体全基因敲除计划结题会暨第二届全国斑马鱼PI大会开幕式在武汉召开。会上科学家们宣布,中国科学家基本敲除了斑马鱼1号染色体上的1333个基因,这也是世界上科学家首次完成斑马鱼1号染     

南极独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)miR-7132对红细胞发生的作用研究

micro RNA为短链非编码RNA,通过与靶基因3′UTR序列互补在转录后水平发挥作用。已有研究表明,micro RNA在红细胞发生过程中起着重要的调控作用。南极冰鱼是目前已知的唯一仅具有无功能性血红细胞的脊椎动物。前期研究提示,独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)头肾中高表达的micro RNAs可能抑制着冰鱼红血球的发生。本研究针对南极冰鱼头肾中高表达的miR-7132,运用斑马鱼显微注射、双荧光素酶报告系统,并结合靶基因预测等手段研究了miR-7132对血红细胞发生的作用机制。结果表明:斑马鱼胚胎注射miR-7132后,固蓝染色显示斑马鱼胚胎红细胞中血红蛋白的表达显著下降,这表明miR-7132的过表达抑制了血红细胞生成。通过转录组数据结合比对冰鱼的全基因组序列,获得了独角雪冰鱼血红细胞生成的血红素生物合成的限速酶(5′-aminolevulinate synthase 2,ALAS2)基因3′UTR序列。构建含ALAS2基因3′UTR序列的双荧光素酶报告质粒,并与miR-7132共转染293T细胞检测荧光素酶活性变化;构建包含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达质粒与miR-7132共同注射斑马鱼胚胎,检测GFP荧光强度与蛋白表达量变化。结果显示,转染miR-7132的293T细胞荧光素酶相对活性显著降低,ALAS2基因是miR-7132的一个靶基因。斑马鱼体内注射miR-7132的GFP荧光强度显著降低,且GFP蛋白表达量显著减少。本研究揭示了miR-7132对血红细胞生成的抑制作用,miR-7132通过抑制ALAS2基因的表达而抑制南极冰鱼血红细胞的发生。     

RNA干扰技术在水生生物研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物体内1种抑制特定基因表达的机制,在果蝇、线虫、真菌和哺乳动物等很多类生物中存在.RNAi也存在于虾、斑马鱼、海鞘等水生生物中,斑马鱼、海鞘等的研究结果证明:RNAi技术是研究水生生物胚胎发育和基因功能的有效方法.众所周知,海水养殖生物病毒病的防治是世界性难题,利用RNAi技术对病毒的特定基因进行干扰,将是1种新型抗病毒治疗方法.为了积极推动该项技术在中国的应用,文中介绍了RNAi在国际水生生物研究中的状况,分析了应用效果与前景.     

斑马鱼GSTM单核苷酸多态性与低温耐受性的相关分析

为分析谷胱甘肽硫-转移酶M基因(glutathione S-transferases M,GSTM)与鱼类低温耐受性的相关性,本实验运用PCR-SSCP技术研究了130尾斑马鱼(Danio rerio)GSTM基因5?UTR、3?UTR和第一内含子序列的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs),同时分析了筛选到的基因型与其低温耐受性状的关联性。结果显示,在其5UTR区域检测到AB、BC、AC 3种基因型个体,共A、B、C 3个等位基因,其观测杂合度和期望杂合度分别是1.000和0.570,多态信息含量为0.472,所检测群体在该座位偏离了Hardy-Weinberg平衡;第1内含子中检测到DD、DE和EE 3种基因型个体,共D、E两个等位基因,其观测杂合度和期望杂合度分别为0.408和0.477,多态信息含量为0.362,群体在该座位符合Hardy-Weinberg平衡。3'UTR区域中没有发现多态性。上述2个SNP座位与斑马鱼低温耐受性状的关联分析结果表明,5'UTR区3种基因型与低温耐受性状均没有显著相关性(χ2=4.029,P0.05)。而第1内含子3种基因型与低温耐受性状显著相关(χ2=8.498,P0.05):DD基因型在耐低温群体中占优势(50.00%),并表现为对受低温胁迫斑马鱼的保护性因素(OR=0.520,95%CI=0.255–1.061),而DE基因型在不耐低温群体中占优势(51.31%),表现为低温胁迫下斑马鱼的危险因素(OR=3.012,95%CI=1.413–6.419)。研究结果为GSTM基因SNPs位点与斑马鱼低温耐受性能关联分析提供了依据,也将为海水经济鱼类抗寒标记筛选育种提供参考。     

久效磷对斑马鱼胚胎期心脏和骨骼发育的毒性效应研究

有机磷农药具有一定的胚胎发育毒性,以往有机磷农药胚胎发育毒性的研究主要集中于个体水平。本研究以斑马鱼(Danio rerio)作为受试生物,采用0.000 4、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷自受精卵暴露斑马鱼胚胎至受精后96h(96hpf)。研究结果表明,久效磷对胚胎的存活率、孵化率均无显著影响,但显著降低了36hpf胚胎的心率,96hpf仔鱼心包囊肿率和脊柱弯曲率显著升高;久效磷暴露胚胎至48hpf显著降低了心脏发育相关基因(Tbx2)的表达水平、显著升高了肌肉发育相关基因(Mef2c)的表达水平。可见,久效磷能够在个体和分子水平上影响斑马鱼胚胎心脏和骨骼的发育,对斑马鱼胚胎心脏和骨骼的发育具有毒性效应。     

一种电转染华贵栉孔扇贝基因编辑的应用方法

目前,CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为动植物遗传育种领域研究的热点。为解决CRISPR技术在贝类生产实践中应用难的问题,本文探究了一种电转染的双壳贝类基因编辑方法。利用本方法分别对华贵栉孔扇贝受精卵的SRB-like-3和MSTN进行编辑,并成功地将编辑后的幼虫培养到稚贝。在编辑后5 d和10 d的D-型幼虫及40 d的稚贝中都检测到了荧光,并且编辑MSTN后的10 d幼虫,其壳长显著大于编辑SRB-like-3组和对照组。本研究表明：电转染基因编辑技术在贝类中具有可行性。本方法具有成本低、操作简单、易推广等优点,可以广泛应用于贝类的遗传育种领域。     

斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应: 补体基因在早期胚胎以及LPS 刺激胚胎中的表达

以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象, 使用原位杂交及实时荧光定量PCR 方法, 对 斑马鱼补体基因(C3, C4, C9, Bf1, Bf2, Bf3)及其调节因子(RCA2.1, RCA2.2)在早期胚胎中的时空表达 模式及LPS 刺激后表达量的变化进行了研究。结果表明, 上述基因在胚胎早期(卵裂期至体节期)均 为泛表达, 从受精后24h 至幼鱼阶段特异性表达于肝脏及消化道等器官。对胚胎显微注射LPS 后, C3、C9、Bf1、Bf2、Bf3 基因在早期胚胎中表达上调, RCA2.1 基因表达下调, 这与斑马鱼成鱼受到 革兰氏阴性菌感染后补体分子(C3, C9, B 因子等)的反应类似, 表明其参与补体激活途径、溶膜途径 及补体调节, 提示斑马鱼可在胚胎发育早期构建补体系统, 参与急性期反应等免疫反应。     

双酚S长期暴露对雌性斑马鱼视觉系统的影响

为探究双酚S(BPS)长期暴露对雌性斑马鱼的视觉毒性效应,本研究采用半静态暴露试验方法,以1、10、100和1 000μg/L BPS暴露斑马鱼胚胎至性成熟(120d),检测了BPS对雌性斑马鱼视觉行为——眼动反应和视动反应、视网膜结构及视蛋白基因(zfrho、zfblue、zfgr、zfred和zfuv)转录水平的影响。结果表明,BPS长期暴露降低了雌性斑马鱼视觉追踪能力;1 000μg/L BPS增加了视网膜及其各层厚度;BPS显著上调了眼中视蛋白基因zfuv、zfred、zfgr和zfblue的表达,增强了斑马鱼对紫外、红、绿和蓝光的光谱敏感性。本研究从分子、组织学和个体等不同水平,首次证实了BPS长期暴露能影响雌性斑马鱼的视蛋白基因表达,损伤视网膜结构,并导致其视觉行为异常,为进一步研究BPS的视觉毒性机制提供了理论基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进展

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。目前,该技术已经在少数几种水生甲壳动物中得到成功应用,但是由于显微注射技术在应用上的局限性,该技术在许多重要海水养殖经济物种如对虾中的应用受到限制,导致其基因编辑效率低下,难以广泛开展。本文对CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进行了综述和展望,为今后海水养殖虾蟹类的基因功能研究以及遗传育种研究提供参考。     

整体原位杂交法研究斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育过程中胸苷酸合成酶(TS)的表达

收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的TS反义RNA探针,采用整体原位杂交方法研究胸苷酸合成酶(TS)基因在斑马鱼胚胎发育各期的时空表达状况.结果表明,在所取样的各个阶段,TS基因均有转录,但其部位不同,中囊胚过渡前后mRNA显现的部位仅存在于受精卵的动物极,10hpf时存在于整个胚胎的外围,至24hpf后集中...     

斑马鱼卵黄原蛋白的纯化鉴定及其2种ELISA的开发

斑马鱼卵黄原蛋白(Vitellogenin,VTG)是检测环境雌激素活性的重要生物标志物。为了确定最佳的斑马鱼VTG检测方法,本研究利用纯化的斑马鱼VTG及其多克隆抗体同时建立了竞争ELISA与夹心ELISA,并比较了2种方法对VTG的敏感度与精确度。采用凝胶过滤与离子交换层析相结合的方法从17β-雌二醇暴露后的斑马鱼整体匀浆液中纯化获得了2种高分子量的糖磷脂蛋白,SDS变性电泳显示分子量为180与143kDa的两条主带,证实纯化的蛋白为斑马鱼VTG。Western blot结果表明制备的抗血清对斑马鱼VTG具有很高的特异性,利用纯化的VTG及其多克隆抗体建立了定量斑马鱼VTG的竞争ELISA和夹心ELISA。与竞争ELISA相比,夹心ELISA不需要抗原抗体共孵育的过程,操作更加省时、简便,其工作范围为3.9~250ng/mL,检出限约为2.2ng/mL,组内与组间变异系数则分别为2.1~5.7和3.0~7.3,表现出更高的敏感度与精确度,推荐该方法用于环境雌激素活性的检测。     

Sdf1-Cxcr4信号在斑马鱼后侧线系统发育中的作用

为了探究Sdf1-Cxcr4信号在斑马鱼(Danio rerio)后侧线系统(Posterior lateral line system, PLLs)发育中的作用,本研究首先通过原位杂交发现斑马鱼cxcr4b在迁移的侧线原基-Ⅰ和原基-Ⅱ中表达,sdf1a在原基迁移路径上表达。进一步构建了由热激启动子控制的cxcr7b过表达转基因斑马鱼,在不同时间点过表达cxcr7b抑制Sdf1-Cxcr4信号。结果表明：相较于野生型斑马鱼,过表达cxcr7b的斑马鱼的原基-Ⅰ和原基-Ⅱ的迁移明显减慢。但体侧中线神经丘的腹部迁移、间生和针脚神经丘的形成不受过表达cxcr7b的影响。本研究为理解鱼类侧线系统发育调控和多样性产生奠定基础。     

miR-430对斑马鱼原始生殖细胞迁移和性腺发育影响的初步研究

为了探究microRNAs(miRNAs)在斑马鱼生殖细胞发育过程中所起的作用,本研究在斑马鱼胚胎期过表达miR-430,结果发现原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)迁移出现紊乱,并且通过qRT-PCR发现nanos3、piwil2及tdrd7等生殖质基因的表达水平显著下调.此外,在斑马...     

热休克诱导斑马鱼异源三倍体的研究

于１９９７年５月在广东省珠海市集斑马鱼和豹纹斑马鱼,采用热休克方法研究阻止第三极体排放诱导异源三倍体斑马鱼的适宜条件。按正交实验方案组合诱导参数,结果表明：在卵受精后２ｍｉｎ,采用３９℃持续处理２ｍｉｎ,三倍化率可达５３．８％,原肠期相对存活率为９１．０％,尾芽期相对存活率为９１％,孵化期相对存活率为９１．１％。本研究分析了热休克处理的参数与三倍体出现率和胚胎相对存活率的关系,并得出诱导参数中起始     

青岛文昌鱼zglp-1基因的进化与表达研究

为了在头索动物文昌鱼中对zglp-1(Zinc finger, GATA-like protein 1)基因进行鉴定,并检测其在青岛文昌鱼(Branchiostomajaponicum)中的组织定位,本文对文昌鱼zglp-1基因的进化及表达进行了研究。同线性分析表明,文昌鱼zglp-1基因是斑马鱼zglp-1和人ZGLP-1基因的同源基因。文昌鱼Zglp-1蛋白的锌指结构域在进化上保守性较高,其三维结构与脊椎动物Zglp-1蛋白的三维结构也高度相似。系统进化分析显示,文昌鱼Zglp-1处于脊椎动物Zglp-1进化的基部,可能代表了脊椎动物Zglp-1进化的原始形式。利用RACE技术克隆得到青岛文昌鱼zglp-1基因完整的ORF序列,其编码389个氨基酸。实时定量PCR技术显示zglp-1基因在文昌鱼性腺中特异高表达,其中在卵巢表达最高;再利用切片原位杂交技术发现zglp-1基因在卵巢、精巢、肝盲囊和鳃等组织中有阳性信号,其中在卵巢中信号最强,与实时定量PCR检测结果基本一致。综上,本研究表明文昌鱼zglp-1为脊椎动物Zglp-1的同源基因,其在文昌鱼性腺高表达,这与该基因在脊椎动物性...     

我国基因编辑海洋生物安全立法建议

随着海洋基因编辑生物技术的发展,基因编辑海洋生物及产品将走入人们的生活。文章针对基因编辑技术在海洋生物中的应用及潜在风险,提出我国基因编辑海洋生物安全法制管理建议。由于海洋生物自身和生活环境的特点,需要制定具有针对性的法律法规,文章从立法原则、立法模式、法律组成和法律制度等方面提出建议。