碱湖高产碱性蛋白酶菌的选育和产酶条件研究

以分离自碱湖的产碱性蛋白酶菌V．metschnikovii DL33为出发株,经紫外线、硫酸二乙酯多次复合诱变,获得一高产突变株V．Metschnikovii DL33—51,其产生的碱性蛋白酶活力是出发菌株的5．74倍,48h发酵液酶活由350U／mL提高至2010U／mL。同时对菌株DL33—51的产酶培养基和条件进行了优化,以最适产酶培养基26℃对V．metschnikovii DL33—51进行摇瓶发酵,发酵40h,酶活达3268U／mL。     

对海洋来源放线菌无活性野生株HLF-43的微波诱变结合新霉素抗性与抗肿瘤活性组合筛选

以海洋来源放线菌无活性野生株HLF-43为出发菌,通过微波诱变结合新霉素抗性筛选,得到新霉素抗性突变株共128株,其中微波诱变新霉素抗性株117株、自发突变抗性株11株。经活性筛选,8株微波诱变新霉素抗性突变株对K562细胞有一定抑制作用,100μg/mL发酵样品对K562细胞的抑制率20%。经对不同微波辐照时间和不同浓度新霉素组合筛选实验结果的比较分析,初步确定对HLF-43的微波辐照诱变最佳时间为120 s。     

基于全基因组重测序对ARTP诱变的一株高产淀粉酶韩国普李斯特氏菌的关键基因研究

为提高一株海洋来源的韩国普李斯特氏菌（Priestia koreensis FS 1）产淀粉酶的能力,对该株菌采用常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma, ARTP）技术进行了诱变选育。结果显示：经过诱变选育后得到一株产淀粉酶活力较原始菌株提高了90%且稳定遗传的突变菌株P. koreensis FS 103。为解析该突变菌株酶活力增加的分子机制,对突变菌株P. koreensis FS 103进行了全基因组重测序及比对分析研究。相关分析显示：首先,P.koreensis FS 103的基因组中乙酰化修饰、抗氧化作用以及同义突变相关的基因发生了遗传变异;其次,对COG（clusters of orthologous groups）功能和变异基因进行富集分析,P. koreensis FS 103转录、翻译和翻译后修饰过程相关基因均上调。经过ARTP诱变以后的突变菌株P. koreensis FS 103淀粉酶活力提升的原因是以上功能基因发生上调效应。     

产壳聚糖酶菌株选育及培养条件优化

以假单胞菌Y8．0为出发菌株,分别通过亚硝基胍(NTG),Co^60,UV(紫外)诱变,采用透明圈法筛选,获得了产壳聚糖酶较好的突变菌株假单胞菌Y8,其所产酶活力达到3．0U／mL,酶活力提高近6倍,并具有较好的遗传稳定性。3种诱变方法中,UV诱变效果最好。对假单胞菌Y8产壳聚糖酶培养条件进行研究,得到1个比较优化的培养条件为：pH值6．5,温度32℃,壳聚糖3g／L,酵母膏0．3％,培养时间3d。不同金属离子及不同诱导物对酶合成的影响表明：Fe^2 ,Mg^2 激活作用显著。而Zn^2 ,Mn^2 则具有一定的抑制作用,壳聚糖和氨基葡萄糖对壳聚糖酶的产生都有较好的诱导作用。     

三角褐指藻紫外线诱变及高产EPA藻株选育

利用紫外诱变法对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)进行诱变育种。实验得到三角褐指藻的最佳紫外辐射剂量为18 W的紫外灯距离藻液35 cm照射15 min。通过单细胞分离技术获得1株突变株UP1,与出发藻株相比,突变株UP1的EPA产量提高10.2%。研究了诱变株的最适生长及产EPA的条件,结果表明UP1在NaNO_3 75 mg/L,p H 7.5,昼夜温度17~15℃,接种量为10%时培养7天,具有最大的生长速率和EPA产量。探讨了诱变株的遗传稳定性,结果表明诱变株可稳定遗传。     

陆地与海洋来源放线菌次级代谢能力的核糖体工程改造

以3株抗肿瘤活性新化合物产生菌放线菌野生株YN17707(陆地)、18522(陆地)和007(海洋)为出发菌,用核糖体工程抗生素抗性筛选技术,改造次级产物代谢生产能力。通过链霉素抗性筛选,得到突变株212株,经发酵产物的TLC和HPLC分析,高产原始菌所产化合物的突变株87株(41%),可产新产物的突变株22株(10%)。在18522的108株突变株中,高产突变株达53.7%(58株),产新产物突变株达11.1%(12株),链霉素抗性筛选对18522的效果较为理想。     

常压室温等离子体技术诱变选育鲅鱼抗氧化肽发酵菌株

鲅鱼(Spanish mackerel)加工后的废弃物富含蛋白质,为了提高蛋白质的利用率并减少环境污染,可以采用微生物发酵的方法酶解这部分蛋白质制取抗氧化活性肽。本实验室已经筛选出一株芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Hy-2,以其发酵水产加工废弃物得到了具有较高抗氧化性的产物。为了进一步提高产物的抗氧化性,作者以该株产蛋白酶芽孢杆菌Hy-2为出发菌,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变的方法筛选出1株突变菌Hy-23,以鲅鱼加工后的废弃物为原料,接种该突变菌株进行发酵,得到了具有一定抗氧化活性的发酵产物,酶解物总抗氧化活性提高了12.4%。经遗传稳定性测定,该芽孢杆菌突变株在传代8次之后其遗传稳定性仍然良好。     

一株脂肽产生菌发酵参数的响应曲面法优化

从渤海污染土壤中分离的表面活性剂产生菌,经鉴定为Bacillus sp.BO2,该菌在对数生长期产生表面活性剂,至稳定期后可将发酵液的表面张力降低至31.0 mN·m1.初步分析发现其表面活性剂成分为环脂肽,该脂肽在不同温度、盐度、pH条件下有较好的稳定性.进一步采用响应曲面法(RSM),以乳化系数作为响应值来优化菌株BO2产生物表面活性剂培养条件.还通过实验确定碳源(液体石蜡)、NH4NO3、KH2PO4为3个影响表面活性剂产量的显著因素,再进行发酵培养基优化,获得最佳培养基配方.获得的发酵参数为利用该菌株发酵生产生物表面活性剂提供数据,为石油降解菌的应用开发提供了有价值的信息.     

一株海洋几丁质酶产生菌的筛选及其产酶条件的初步研究

从胶州湾的海泥中分离到一株几丁质酶高产菌株。经16SrDNA序列分析,认为该菌属于假交替单胞菌(Pseudoaltermonas),并将其命名为SS01。对该菌产几丁质酶的最佳培养条件进行了研究,发现与其它几丁质酶产生菌相比,SS01菌株的最适产酶温度较低,酶活较高。在Zobell2216E培养基中,SS01菌株培养9h进入稳定期。胶体几丁质可诱导该菌几丁质酶的产生。在几丁质培养基中,SS01菌株产酶的适宜条件是:培养温度24℃,培养基起始pH7.0左右,蛋白胨为N源(5g/L),胶体几丁质为C源(5g/L),170r/min振荡培养130h,酶活可达116.2U/mL。     

舟山海域一株产碱性蛋白酶海洋放线菌的鉴定、选育及发酵条件的初步研究

从舟山海域潮间带海泥筛选到产碱性蛋白酶的海洋放线菌,利用Folin-酚法进行酶活测定,选取酶活最高的菌株进行鉴定,绘制系统进化树。再通过紫外线和DES诱变从而得到高产碱性蛋白酶的海洋放线菌菌株,并进行初步的发酵条件研究。结果表明:分离筛选得到2株菌株,在脱脂奶筛选平板上能产生较大的水解透明圈,通过Folin-酚法进行酶活测定,挑选出酶活较高的菌株A20(初始酶活为104.7U/mL),生理生化试验和16S rDNA试验结果显示该菌株为Streptomyces roseus。对菌株A20进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)诱变,最终得到高产碱性蛋白酶的菌株,酶活为227.5U/mL,酶活提高117.3%,传代试验显示该菌株具有较好的遗传稳定性。单因素试验显示最适发酵温度为50°C、pH值为9.0、培养时间为72h。     

热稳定k-卡拉胶酶产生菌Bacillus sp.Car19的发酵条件优化

对一株分泌热稳定κ-卡拉胶酶印尼热泉菌进行了种属鉴定,并采用响应面法对该菌发酵产酶条件进行了优化。鉴定结果表明,该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus),命名为Bacillus sp.Car19(Gene Bank:KT865196)。发酵条件优化结果显示,9个环境因子影响Bacillus sp.Car19产酶量。其中影响Bacillus sp.Car19产酶量的三个主要因素分别为培养温度、培养基中Cu~(2+)浓度和培养基中Na Cl浓度。综合次要因素对Bacillus sp.Car19产酶影响,Bacillus sp.Car19最佳产酶发酵条件为:培养温度52.31℃、Cu~(2+)浓度6.93 mmol/L、Na Cl浓度37.03 g/L,培养基p H为6,接种量1%,培养时间36 h,半乳糖浓度0.3 g/L,硝酸铵浓度7 g/L,卡拉胶浓度0.5 g/L。优化后发酵上清液酶活力达到15.21 U/m L,与优化前相比提高了1.5倍。     

壳聚糖酶高产菌株的筛选和发酵条件的研究

从采集的土样中分离到1株产壳聚糖酶能力较强的菌株OU01,并对OU01进行了16S rDNA序列、形态及生理生化鉴定分析。16S rDNA序列分析表明该菌属于微杆菌属;该菌的形态特征与生理生化鉴定结果表明该菌与Microbacteriumsp.的相似性最高;因此将其初步鉴定为微杆菌属(Microbacterium)。同时对该菌的发酵条件进行了初步研究:该菌的最适培养基组成为(g/L):chitosan 10,(NH4)2SO420,MgSO4.7H2O 1.3,K2HPO4.3H2O 1.4,Glucose 1,Yeast extract 3,NaCl 5,起始pH=6.30。最适发酵温度为30℃,最佳发酵时间为96 h,在上述最优条件下,该菌株产酶达到118 U/mL。Microbacteri-umsp.OU01菌株为壳聚糖酶的研究和应用提供了新的来源。     

海产品中蛋白酶产生菌的选育及产酶条件研究

从海产品虾和蟹中分离出蛋白酶产生菌共37株，其中YM007菌株蛋白酶生产活力较高，为194．6U／mL。以YM007为出发菌株，通过物理和化学方法复合诱变，获得了YM079号菌株。对其产酶条件的研究结果表明：它的最适产酶温度为35℃，最适生长pH为7．0，经过190r／min摇床培养36～40h，其产酶活力为240U／mL，比出发菌株的产酶活力提高了22％。该菌株经发酵的粗酶液最适作用pH为7．0，最适作用温度是45℃，是一种中温型中性蛋白酶。     

裂殖壶菌诱变筛选的研究

首次采用紫外诱变和喹禾灵筛选的方法,选育出2株二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)含量高的裂殖壶菌(Schizochytrium)突变菌株OUC002和OUC007,其中OUC002生物量(6.82g·d-1·L-1)和DHA含量(15.31%),分别比对照菌株OUC168提高8.08%和13.74%;OUC007生物量(7.04g·d-1·L-1)和DHA含量(17.33%),比对照菌株分别提高11.57%和28.75%。通过GC-MS(气质联用)对OUC007脂肪酸组成进行分析,DHA含量达到脂肪酸的37.28%。本研究为裂殖壶菌的发酵生产提供了性状优良的菌种,并为裂殖壶菌菌种选育提供了新方法。     

响应面法优化热泉菌Bacillus sp.Lc50-1的发酵产卡拉胶酶条件

采用响应面法对1株高产卡拉胶酶的印度尼西亚热泉菌Bacillus sp.Lc50-1的发酵条件进行优化。分别以培养温度、pH值、C源、N源、金属离子及接种量作为唯一变量进行单因素实验,筛选出对酶活有显著影响的单因素取值范围;参考单因素实验结果,再利用Box-Behnken设计及响应面分析法进行回归分析以确定最佳发酵条件。结果表明,培养温度、卡拉胶浓度(C源)、蛋白胨浓度(N源)、KCl浓度(金属离子)与酶活存在着显著的相关性,通过求解回归方程得到Bacillus sp.Lc50-1的最佳发酵条件为:培养温度47.5℃、蛋白胨0.25%、卡拉胶0.3%、KCl 21.55mmol·L-1,优化后发酵上清液的酶活达到8.9U·mL-1,比优化前提高了1.5倍。     

热稳定κ-卡拉胶酶产生菌Bacillus sp. Car19的发酵条件优化

对一株分泌热稳定κ-卡拉胶酶印尼热泉菌进行了种属鉴定, 并采用响应面法对该菌发酵产酶条件进行了优化。鉴定结果表明, 该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus), 命名为Bacillus sp. Car19(GeneBank: KT865196)。发酵条件优化结果显示, 9个环境因子影响Bacillus sp. Car19产酶量。其中影响Bacillus sp. Car19产酶量的三个主要因素分别为培养温度、培养基中Cu²⁺浓度和培养基中NaCl浓度。综合次要因素对Bacillus sp. Car19产酶影响, Bacillus sp. Car19最佳产酶发酵条件为: 培养温度52.31℃、Cu²⁺浓度6.93 mmol/L、NaCl浓度37.03 g/L, 培养基pH为6, 接种量1%, 培养时间36h, 半乳糖浓度0.3 g/L,硝酸铵浓度7g/L, 卡拉胶浓度0.5g/L。优化后发酵上清液酶活力达到15.21 U/mL, 与优化前相比提高了1.5 倍。     

小球藻紫外线诱变及高产藻株筛选

利用单细胞分离技术和紫外诱变育种技术,筛选高产小球藻株。通过单细胞分离技术获得的藻株Chlorella vul-garisQ7,生长速度和蛋白含量均优于其它藻株。以C.vulgarisQ7为出发株,进行紫外诱变,从120株诱变单克隆中筛选出3个株系:M51,M59,M73。与出发株相比,突变株M51,M59,M73的生长速率分别提高了6.23%,3.8%,5.92%。蛋白含量分别提高了2.5%,3.1%,1.9%。研究了诱变株的最适生长条件,结果表明在140μmol.m-2.s-1,25℃时,诱变株具有最大的生长速率和生物量。探讨了诱变株的遗传稳定性,结果表明诱变株可稳定遗传。     

产复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197产酶发酵条件的研究

从南极普利兹湾深海900m的沉积物中筛选到一株同时产多种低温复合酶的菌 株NJ197,作者对其进行碳源、氮源、无机盐、起始pH值、培养时间、接种量等发酵条 件的优化实验．实验结果证明,在以0．5％可溶性淀粉为碳源,以0．5％豆饼粉为氮 源,无机盐:0．424％NH4H2PO4、0．075％K2HPO4、0．02％MgSO4、0．5％CaCO3,起始 pH值8．5,接种36h种龄的种子10％,20℃、250r／min的条件下在旋转摇床中培养 72h,产复合酶菌株产脂肪酶和淀粉酶活性最高．最佳的生理条件下复合酶中的碱性 脂肪酶和淀粉酶的产量分别提高到22．4U／cm3和30．9U／cm3,该产复合酶菌株可以 作为诱变育种、基因工程菌改造的出发菌株,在洗涤和制革工业中有良好的应用前 景．     

产淀粉酶的海洋曲霉菌的分离及酶学特性初步研究

从乐清湾红树林中分离获得2株产淀粉酶的真菌,经初步鉴定为曲霉属菌株,暂命名为曲霉5#和曲霉34#。对它们的生长温度、固体发酵时的产酶条件以及淀粉酶特性进行了初步研究。该研究结果表明,曲霉5#和曲霉34#的最适生长温度分别为30~35℃和25~30℃,最高生长温度分别为40℃和35℃,在10℃下均能生长。对两株菌进行固体发酵时其最佳培养时间为96 h。两株菌所产淀粉酶的最适pH值为7.0,最适反应温度为40℃;淀粉酶在50℃下仍能保持活力,60℃下酶活力开始下降,80℃时酶几乎失活;离子对淀粉酶的激活或抑制作用也相似。     

山口红树林根际土壤可培养细菌多样性及其活性筛选

为探讨广西山口红树林土壤可培养细菌的多样性,采用纯培养分离技术对采集的25个红树林样品进行可培养细菌多样性分析,挑选117株菌株进行16S rRNA基因测序并构建系统发育树分析。结果表明117株菌株分别属于9个纲20个目27个科35个属,9个纲包括α-变形菌纲（21.37%）、β-变形菌纲（1.71%）、γ-变形菌纲（12.82%）、δ-变形菌纲（0.85%）、噬纤维菌纲（0.85%）、鞘脂杆菌纲（0.85%）、黄杆菌纲（2.56%）、放线菌纲（27.35%）、芽孢杆菌纲（31.62%）。优势属为芽孢杆菌属,占所有菌株的28.20%,此外α-变形菌纲、γ-变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲中发现了7株潜在的新物种。分离菌株的产酶活性检测表明,山口红树林根际土壤蕴含丰富的产淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖、纤维素酶和几丁质酶等生物活性酶的菌株,其中芽孢杆菌纲的产酶菌株数最为丰富。初步研究结果表明广西山口红树林土壤可培养细菌资源丰富,新物种资源多样,是农业微生物开发应用的重要资源库。