利用同源重组质粒pUTK转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942及胸腺素α1的表达

采用本实验室构建的丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601基因整合平台系统供体质粒pUTK转化单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942,通过抗性筛选获得了具卡那霉素抗性的转化藻株.经Southem杂交证实pUTK部分序列已整合到Synechococcussp.7942染色体DNA上;红光诱导后通过蛋白质SDS-PAGE电泳,Westernblot证实pUTK的胸腺素α1基因得以有效表达,表达量达到总蛋白的4.8%.结果表明,基因整合平台系统供体质粒pUIK不仅可转化丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601,还可转化单胞蓝藻SynechococcussP.PCC7942.     

利用同源重组质粒pUTK转化蓝藻Synechococcus sp.PCC9742及胸腺素α1的表达

采用本实验室构建的丝状蓝藻Wynechococcus sp.PCC7601基因整合平台系统供体系粒pUTK转化单胸藻Syenchococcus sp.PCC7942，通过抗性筛选了具卡那霉素抗性的转化藻株，经Southern杂交证实pHTKUK部分序列已整合到Synechococcus sp.7942染色体DNA上，红光诱导后通过蛋白质SDS－PAGE电泳，Westem blot证实pUTKpUTK的腺素a1基因得以有效表达，表达量达到总蛋白的4．8％，结果表明，基因整合平台系统供全质粒pHT不仅可转化丝状蓝灌Calothrix sp.PCC7601,还可转化单蓝藻Synechococcus sp.PCC7942.     

整合鲈鱼生长激素基因的蓝藻7942

利用载体pAMll46与烟草花叶病毒35S启动子，鲈鱼生长激素基因GH连接，构建携带鲈鱼生长激素基因的整合型表达载体pAMGH，用自然转化方法将pAMGH导入蓝藻7942，筛选到6株抗壮观霉素，氨苄青霉素敏感的藻落，提取抗性藻落的基因组总DNA，用生长激素基因特异引物进行PCR检测，结果证实鲈鱼生长激素基因已经整合进入蓝藻7942的染色体中。     

耐盐基因转化蓝藻Synechococcus sp. PCC 7942研究

将从极端耐盐的假单胞杆菌中克隆得到的3个基因，即转录调控因子基因，NADH脱氢酶Ⅱ基因和磷酸甘油磷酸酯酶基因转入淡水蓝藻Synechococcus sp.PCC 7942中，使受体藻对NaCl的耐受性从低于2．5％显著提高到4．5％，进一步证明了这3个基因确定与生物的耐盐性密切相关。本实验为进一步培育耐盐经济作物奠定了基础。     

建立螺旋藻转基因体系初报

从钝顶螺旋藻单细胞克隆的制备、重组平台的 克隆、同源重组表达质粒的构建、质粒的电激转化和报告基因的表达等方面对螺旋藻转基因 表达系统进行了研究,初步建立起螺旋藻转基因体系。用次氯酸钠溶液处理获得无菌培养系 ;用钠、钙离子混合液处理,获得了可再生的螺旋藻单细胞。用含EDTA的培养基预培养和用 培养基洗涤可分别去除胞外核酸酶活性和抑制胞内核酸酶活性。以氯霉素乙酰转移酶基因替 换大肠杆菌表达质粒pBV220的抗性选择标记,同时插入系列同源重组片段和萤火虫荧光素酶 基因,构建了同源重组表达载体pBVCS01-04L。电激转化螺旋藻S6-4品系单 细胞,获得了具有稳定氯霉素抗性的培养系,并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了报告基 因的表达。     

聚球藻hox1基因的克隆和序列分析

本实验应用降落PCR方法从聚球藻Synechococcus cedrorum中扩增出717bp的hox1基因全序列,并与从Gen-Bank下载13个蓝藻hox1基因序列比较,用MEGA4.0进行序列同源性分析及蛋白结构特性分析。结果表明,Synecho-coccus cedrorum的hox1基因与聚球藻Synechococcus PCC7942和钝顶节旋藻Arthrospira platensis的hox1基因序列同源性分别为99.9%和99.2%,氨基酸序列同源性分别为99.6%和97.9%。还用邻接法和最大简约法构建了系统树并进行了聚类分析。     

蓝藻钙信号的研究进展

近年来对钙离子在蓝藻信号传导中的潜在作用进行了研究。大量证据表明,蓝藻能够“感知”与“区分”不同的环境刺激,并以钙瞬变的形式产生反应。这是不同的环境刺激所引起的钙离子的内流或外流的结果。由氮缺乏所引起的钙信号对丝状蓝藻鱼腥藻异型胞的分化非常关键。鱼腥藻PCC7120中钙结合蛋白（CcbP）的发现为钙信号在蓝藻中的作用提供了进一步的证据,CcbP的降解或表达下调是氮缺乏时钙信号产生的主要原因。但是与真核生物相比,蓝藻钙信号的编码与解码机制还不清楚。因此,为了解钙信号如何在蓝藻中发挥作用,还要进行系统的、深入的研究,特别是从细胞水平了解钙信号的动力学特征。     

抑制螺旋藻胞内核酸酶活性的研究

螺旋藻细胞内较高的胞内核酸酶活性是外源基因转化螺旋藻的主要障碍。以供体质粒pEUTISI为酶消化底物，通过多种方法处理螺旋藻细胞，然后检测其内核酸酶粗提液对pEUTISI的降解作用，结果表明，2mmol/L以上的EDTA处理16h或无Mg^2 螺旋藻培养基培养72h以上，都可使处于对数生长期的螺旋藻胞内核酸酶活性显降低；低于28℃（如24℃）培养也可降低螺旋藻的胞内核酸酶活性。根据实验结果，建议在螺旋藻转化前72h开始低温、无Mg^2 培养，转化前16h提高培养基中EDTA的浓度至2mmol/L，就能获得胞内核酸酶活性极低的受体藻，有利于外源基因的转化。     

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表达载体的构建与电转化

海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布的真核浮游植物,该种不仅是海洋碳、硫循环和全球气候变化的重要指示物种,而且能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术领域也具有很好的应用前景。本文通过分析氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素对海洋球石藻生长的影响,确定G418可作为该藻阳性转化藻株的抗性筛选试剂,其对应的抗性基因neo则作为该藻表达载体构建中的抗性筛选标记。在此基础上克隆了绿色荧光蛋白基因gfp、抗性标记基因neo及E. huxleyi BOF92内源性岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白基因的启动子fcp,以pUC18为基础载体,构建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo两个重组表达载体,以电转化方法共转化球石藻细胞并结合选择性固体培养基筛选,成功获得了被转化的球石藻细胞。海洋球石藻遗传转化系统的建立为进一步开展该种相关的基础生物学研究及其在生物技术领域的应用奠定了基础。     

节旋藻和螺旋藻对7种抗生素敏感性的比较研究

对两种丝状蓝藻(钝顶节旋藻和盐泽螺旋藻)在基因工程中常用作选择试剂的7种抗生素——氯霉素、氨苄青霉素、红霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素的敏感性作比较实验.结果表明,两种蓝藻对抗生素的敏感性既有共同的特点,也有明显的差异.它们对红霉素、氯霉素和链霉素最敏感,致死浓度分别为0.1,0.5和5μg/cm3.两种蓝藻对氨苄青霉素比较敏感,1μg/cm3的氨苄青霉素即可抑制Arthrospira.341和Spirulina.351的生长,但6d后生长恢复.Arthrospira.341和Spirulina.351对卡那霉素、庆大霉素和新霉素均有抗性,而且存在很大差异:300μg/cm3的卡那霉素对Arthrospira.341的生长仍然没有影响,但对于Spirulina.351,50μg/cm3的卡那霉素即对其生长有明显抑制作用;200μg/cm3的卡那霉素即可将其全部致死.200μg/cm3的庆大霉素和300μg/cm3的新霉素不能抑制Arthrospira.341和Spirulina.351的生长,但在这两种抗生素环境中两种藻的生长状态有很大差异.并验证了氯霉素、红霉素和链霉素是节旋藻和螺旋藻基因转化过程中的有效的抗性选择剂,也从对抗生素敏感性方面表明节旋藻和螺旋藻两个属的遗传差异.     

海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5的转化及外源基因整合方式

微拟球藻Nannochloropsis被认为是具有作为生物柴油原料开发潜力的微藻。为了能够实现工业化生产,有效地利用基因工程或遗传操作手段改造微藻,提高产量,建立稳定有效的遗传转移方法十分必要。本研究以微拟球藻本源β-tublin基因启动子和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutm fcpA终止子驱动和终止来源于细菌的sh ble抗性选择基因,构建了一个转化载体pHB4857。将pHB4857以电转移的方法转化海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5。结果显示,转化子可以在3μg·mL-1 zeocin的抗性培养基中生长,PCR检测sh ble基因为100%插入率,转化效率为1.25×10-6。DNA印迹杂交结果表明,外源基因是以随机整合的方式一个或多个拷贝插入到宿主核基因组中的,大多数转化子中的外源基因的整合是完整的。转化子在抗性培养基中每10天传一代,连续传代7个月以上,未检测到抗性基因丢失现象,外源抗性基因可以在宿主细胞中稳定存在。     

条斑紫菜丝状孢子体cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定

经过微量总 RNA抽提、c DNA合成、c DNA扩增和克隆等步骤 ,构建了微量条斑紫菜丝状孢子体 c DNA文库 ,并进行了小规模表达序列标签分析。从 1 70条标签序列中鉴定出 6条抗病相关基因序列。这些序列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记 ,辅助紫菜抗性遗传改良。     

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导培育富含叶黄素的基因工程小球藻(Chlorella vulgaris)的研究

采用基因克隆技术构建双元载体pCAMBIA2301-idi,通过电转转入农杆菌LBA4404中.利用根癌农杆菌介导的转化方法,将pCAMBIA2301-idi质粒的T-DNA区转入小球藻,以G418抗性基因(NPTⅡ)作为筛选标记,筛选出阳性转化子.通过PCR扩增表明idi基因和NPTⅡ基因已经整合到小球藻基因组中.测定转化子的生物量,结果表明大部分转化子的生物量与野生型相似.测定转化子小球藻干粉的叶黄素含量,发现转化子叶黄素含量最高达到0.84mg/g,与野生型相比提高了30.95％.进一步分析藻液中叶黄素的产量,发现转化子的叶黄素产量最高达到1.98mg/L,比野生型提高了36.77％.     

钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆、分析及重组表达蛋白荧光活性的研究

为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1 056 bp,由apcA和apcB串联组成,中间间隔84 bp。其中,apcA和apcB基因的全长均为486 bp,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33 kDa,它们分别编码的α和β亚基均属于Globin＿like超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守。将克隆出的亚基基因apcA、apcB分别同前期A.platensis FACHB314中获得的藻蓝胆素合成相关基因ho和pcyA以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS、cpcT)共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E.coli HPEFUSTA、E.coli HPEFUSTB。SDS-PAGE和Western Blot均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基。荧光检测结果显示,在600 nm波长激发下,...     

海洋固氮蓝藻Calothrix sp.与Lyngbya sp.固氮生理的研究

研究盐度、昼夜变化、温度及阿特拉津(光合系统Ⅱ抑制剂)对2种海洋固氮蓝藻Calothrixsp.strain(代号为MCT1)和Lyngbyasp.strain(代号为MCT6)固氮活性的影响。结果表明,MCT1在盐度10—48范围内具有相对较高的固氮活性,在盐度为30时固氮活性最高,达到0.687 2μmolC2H2.(g.h)-1;而MCT6随盐度改变固氮活性变化幅度较大,盐度为24时具有最高固氮活性,其活性为0.876 8μmolC2H2.(g.h)-1。MCT1和MCT6固氮活性的昼夜变化明显不同,具有异型胞的海洋固氮蓝藻MCT1白天的固氮活性明显高于夜晚;而无异型胞的MCT6最高固氮活性发生在晚上,白天固氮活性较低。一定浓度的阿特拉津通过抑制光合作用阻断能量和还原剂的提供,使藻体在较短时间内丧失固氮能力。加入阿特拉津后2种藻体的固氮活性与对照组相比有明显的变化,实验第3天开始MCT1的所有经阿特拉津处理的样品固氮活性丧失;MCT6经(50—1 000)×10-6阿特拉津处理的样品从实验第3天开始固氮活性完全消失。     

两种蓝细菌中7对毒素-抗毒素系统的分析和鉴定

蓝细菌(cyanobacteria)是一类能进行放氧光合作用的原核生物。蓝细菌生长速度较快, 几乎存在于所有的陆地和水生环境中。毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系统在原核生物中分布十分广泛, 在细菌的生命活动中扮演了重要的角色, 如维持水平基因转移元件的稳定性以及应对环境胁迫压力等。已有的基因组分析表明, 蓝细菌基因组中含有大量潜在的毒素-抗毒素系统, 但是目前对蓝细菌毒素-抗毒素系统的实验鉴定仍较少。本文分别以淡水和海水代表菌株集胞藻PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803)和聚球藻WH7803(Synechococcus sp. WH7803)为研究对象, 对二者基因组上的毒素-抗毒素系统进行预测, 并选取预测结果中的7对潜在的毒素-抗毒素系统进行实验验证。结果表明, 集胞藻PCC6803的两对毒素-抗毒素系统BAD01932-1933 和 BAA18559-New ORF7中的毒素具有明显的细胞毒性。本文的研究结果有助于后续对蓝细菌毒素-抗毒素系统及其生态和生物学功能的研究。     

鲑鱼降钙素基因异源表达研究进展

在不同来源降钙素中,鲑鱼降钙素的活性最高,在钙的代谢和治疗骨质疏松、Paget氏综合症、高钙血症等疾病中有巨大的药用价值.其C末端的酰胺化对它完整的生物活性起重要作用.本文综述了鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌、链霉菌、乳酸杆菌和蓝藻等原核细胞,在酵母、昆虫、动植物等真核细胞中异源表达的研究进展,以及通过基因工程的方法能够改进生物表达系统,提高鲑鱼降钙素活性的动态.     

具荧光活性的节旋藻藻蓝蛋白α亚基在大肠杆菌中的重组表达

为探索节旋藻藻蓝蛋白的生物合成机理,以钝顶节旋藻(Arthrospira platensisFACHB314)基因组DNA为模板克隆了藻蓝蛋白α亚基基因cpcA、催化脱辅基蛋白与色基结合的裂合酶基因cpcE和cpcF,以及催化色基合成的铁氧蛋白氧化还原酶基因pcyA;以Synechocystissp.PCC6803基因组DNA为模板克隆了亚铁血红素氧化酶基因hox1。然后分别将cpcA、cpcE和cpcF基因构建到质粒pACYCDuet-1中,将hox1和pcyA基因构建到质粒pET-24a(+)中,用电击法将二者共同转化E.coliBL21(DE3),经诱导表达得到具有荧光活性的节旋藻藻蓝蛋白α亚基。在590 nm激发波长下,荧光发射峰为637.8 nm,证实了节旋藻自身的裂合酶CpcE和CpcF能够催化色基PCB与藻蓝蛋白脱辅基结合产生有荧光活性的藻蓝蛋白α亚基,为表达有荧光活性的藻蓝蛋白提供理论和实验基础。     

凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白Fortilin的毕赤酵母表达及其对血细胞免疫反应的影响

翻译控制肿瘤蛋白Fortilin是1种多功能蛋白,参与重要的细胞活动.并且,对虾fortilin通过抑制病毒复制干扰病毒感染.参照Genbank中fortilin基因序列设计引物,PCR扩增得到凡纳滨对虾fortilin目的基因片段,EcoR I/XbaI双酶切插入表达载体pGAPZαA,转化大肠杆菌,经博来霉素(Zeocin)抗性筛选及测序分析,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-F.酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33,经Zeocin抗性筛选,得到阳性转化子.表达产物的上清液经SDS- PAGE电泳和质谱分析,表明在酵母中成功表达fortilin.以体外原代培养的对虾血细胞检测重组蛋白的免疫活性,结果显示重组蛋白显著提高了血细胞酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性.该结果为下一步研究重组fortilin 在对虾养殖中的应用奠定了基础.     

西沙群岛海产蓝藻的研究 Ⅴ

本文继续报道我国西沙群岛海产色球藻目 Chroococcales 的十种蓝藻,隶于三科六属，有八种是我国海产蓝藻的新记录,它们是:铜锈微囊藻 Microcystis aeruginosa Kuetzing,小形色球藻 Chroococcus minor ( Kuetzing) Naegeli,湖沼色球藻盐泽变种 C. limneticus Lemm.var. subsalsus Lemm,易变色球藻 C.varius A.Braun,膜状色球藻C. membraninus ( Meneghini) Naegeli,圆胞束球藻 Gomphasphaeria aponina Kuetzing,附钙管鞘藻 Hormathonema epilithicum Ercegovic 和透明拟丝藻 Johannesbaptistia pellucida ( Dickie) Taylor at Drouet。其中透明拟丝藻形态特征独特,这对于蓝藻类的研究,特别是研究从色球藻目进化到丝状蓝藻类的系统演化具有重要价值,早已为藻类学家们所重视。该种也是我国海产蓝藻属的新记录。 迄今为止,藻类学家们一致认为色球藻目是蓝藻门 Cyanophyta 中最原始、最低级的类群,其植物体最简单,大都是单细胞或简单的群体,而且都十分微小,常被肥厚的胶质鞘所包埋,这就使该目蓝藻能适应复杂的自然环境。所以,在地质学和古生物学的研究中它已引起许多学者的注意。有关该目海产种类的分类研究,我国仅有少数报道,这方面的工作还有待深入。