长牡蛎碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

本文以长牡蛎为酶源提取材料,用正丁醇抽提,硫酸铵分级分离,DEAE-52和Sephadex G-100柱层析,得到一定纯度的碱性磷酸酶,提纯倍数为61.96,比活力达1.326U/mg.该酶的最适pH值9.6,最适温度38℃,初速度6.8μmol/(dm~3·min),米氏常数Km值为1.30mmol/dm~3.实验结果表明,Mg~(2+)对该酶有明显的激活作用;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)对该酶有明显的抑制作用.     

一株源于红树林根际土壤产纤维素酶芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质分析

从红树林根际土壤中筛选出一株产纤维素酶的革兰氏阳性菌,通过形态、生化特征及16S r RNA基因序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对其产纤维素酶能力进行分析,发现该菌株所产纤维素酶的最适反应温度为55°C,最适p H为6。酶学性质分析发现,在反应温度为55°C时,该菌株产生的纤维素酶稳定性最好,保温120min后仍具有80%以上的相对酶活力;在p H为5—7时,酶活性相对稳定,相对酶活力均维持在80%左右。Cu~(2+)对该酶有一定的抑制作用,Zn~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)和Co~(2+)均对酶有一定的促进作用。本研究显示这株芽孢杆菌具有良好的应用前景,为该菌株在水产饲料添加剂中的进一步研究与应用提供参考依据。     

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶,SDS-PAGE显示为单一条带,提纯倍数为14.42,比活力达到131.08U/mg。酶学性质研究表明:该酶亚基分子量约44kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为9.0,米氏常数Km为0.098mmol/L,最大反应速度Vmax为1.01μmol/(mL·min)。Ca2+、Mg2+对酶活力表现出显著的激活作用。     

中国明对虾体壁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)的分离纯化及其酶学性质,作者以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)体壁为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、SephadexG-100柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂,纯化酶比活力为3938.56U/mg。通过SDS-PAGE凝胶电泳,测得该酶亚基分子量为48.88 kD。酶的最适pH为6.0,最适温度为45℃;该酶在pH 6.0~9.0区域较稳定,温度稳定性范围是20~35℃,45℃下处理1 h酶活力丧失65.04%。酶水解对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的Km为0.229 mmol/L,Vmax为5.00μmol/(L·min)。进一步研究金属离子对酶活力的影响,结果表明:Li+、Na+和Ba2+对酶没有明显影响,Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Al3+对酶均有不同程度的激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb2+对酶呈抑制作用,1.0 mmol/L Hg2+对酶呈激活作用,而10 mmol/L Hg2+使酶活力降低42.37%。     

中国鲎内脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

以中国鲎(Tachypleus tridentatus)内脏为材料,分别通过30%和80%饱和度(NH_4)_2SO_4沉淀分级分离、葡聚糖凝胶柱Sephadex G-200层析、以及离子交换柱DEAE-32层析,从而获得N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase),经PAGE检定达到电泳纯,酶的比活力为505.21 U/mg。SDS-PAGE显示一谱带,测得该酶蛋白亚基分子量为121.5kDa,等电聚焦电泳法测得酶的等电点pI为6.01。以pNP-β-D-GlcNAc为底物,研究NAGase催化反应的动力学参数。结果表明:中国鲎NAGase的最适pH、最适温度、K_m和V_(max)分别为5.4和55℃、0.421 mmol/L和13.158μmol/L·min~(-1);酶在pH=4.5~7.0范围内较稳定,在20~50℃之间具有较好的热稳定性。酶在276nm波长处有紫外吸收峰,在232.2nm波长的内源荧光激发下,酶内源荧光发射光谱峰在330.9nm波长处。Na~+,K~+和Li~+对NAGase活力没有影响,Ca~(2+)、Ba~(2+)和Co~(2+)对NAGase有不同程度的激活作用,Co~(2+)对NAGase的激活作用较大,5mmol/L Co~(2+)能使NAGase活力提高41.67%;Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)、Pb~(2+)、Ag~+、Cd~(2+)和Hg~(2+)等10种金属离子对NAGase活力有不同程度的抑制作用,5mmol/L Cd~(2+)可使酶活力丧失85.60%,而Hg~(2+)对酶的抑制作用最强,0.1mmol/L Hg~(2+)可使酶活力丧失90.10%。EDTA对酶活力没有影响,推断中国鲎NAGase属于非金属酶类。     

僧帽牡蛎碱性磷酸酶性质的研究

从僧帽牡蛎分离纯化出一种碱性磷酸酶,采用Sephadex G-200凝胶过滤柱层析法测得该酶分子量为1.57×10~5.以对硝基苯磷酸为底物,该酶的最适温度为43℃,最适pH值为10.0.在37℃和pH值为10.0的条件下,酶催化反应的米氏常数(K_m)为9.68×10~(-4)mol/dm~3,活化能(E_a)为45.85kJ/mol,温度系数(Q_(10))为1.80(30～40℃).对该酶的热稳定性研究表明:其在45℃以下较为稳定,50℃以上明显失活,并测定了该酶的热失活速度常数.金属离子对酶活力的效应研究结果表明:Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Co~(2+)对酶有激活作用,Ag~+、Hg~(2+)、Zn~(2+)表现为抑制作用,Cd~(2+)几乎没有影响.Mg~(2+)是较有效的激活剂,表现为部分非竞争性效应,激活常数(K_a)为2.48×10~(-4)mol/dm~3,有Mg~(2+)存在时该酶活性中心的转换数量是无Mg~(2+)时的4.0倍.几种效应物对酶的抑制机理研究表明:HPO_4~(2-)、HAsO_4~(2-)、Cys为竞争性,其抑制常数分别为1.61、1.18和0.15mmol/dm~3;L-Phe为反竞争性,抑制常数为3.26mmol/dm~3.     

嗜琼胶华美菌芳基硫酸酯酶的克隆表达及在琼胶脱硫中的初步应用

芳基硫酸酯酶具有断裂硫酸酯键的功能,并可应用于酶法脱除琼胶上的硫酸基,提高凝胶强度,改善琼胶性能.为了发掘能用于琼胶脱硫的新型芳基硫酸酯酶,本研究根据嗜琼胶华美菌(Formosa agariphila)KMM 3901的基因组注释信息,筛选出了一段芳基硫酸酯酶编码序列OUC-FARS6,并在大肠杆菌中对其进行异源表达,研究该酶的酶学性质,初步探究其在琼胶脱硫中的作用.研究表明,该酶的分子量大小为63 kDa,以对硝基苯硫酸酯(pNPS)为底物反应90 min时的最适温度为45℃,最适pH为9.0.Na+和K+对酶活有促进作用,大部分金属离子、SDS和Na2 EDTA都可抑制该酶酶活.动力学结果显示,该酶的Km值为32.63μmol/L,Vmax值为9.25μmol/(L·min).将琼胶与该芳基硫酸酯酶共同孵育后,琼胶内部空隙变小,呈现出较好的空间网状结构.本研究成功发掘了一个新型芳基硫酸酯酶,该酶具有应用于琼胶脱硫的潜力,同时建立了利用该酶进行琼胶脱硫的催化体系.     

超嗜热古菌耐热酸性α-淀粉酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp.HJ21)菌株进行了α-淀粉酶发酵条件的优化和酶学性质的研究.该菌株发酵9h后到达产酶高峰,产酶温度范围为60-90℃,其最适产酶温度为80℃.产酶pH范围为5.0-9.0,最适产酶pH为7.5.产酶NaCl浓度范围为0.5-4.0%,2.5%为最适宜NaCI浓度.糖原、淀粉、麦芽糖、酵母膏和蛋白胨促进产酶.该菌株产生的α-淀粉酶的分子量为51.4 kDa,酶的最适作用温度为95℃,在100℃仍有60%的酶活力.酶在90℃的半衰期为5 h,在100℃ 2 h仍有40%的残余酶活,酶的热稳定性不依赖Ca2+.酶的最适作用pH为5.0,pH 4.5仍有80%的酶活力,pH在5.5-7.0较稳定(80℃ 4 h).金属离子1 mmol/L的Mg2+、Co2+、Sr2+、Ba2+、K+、Na+对酶有激活作用,Cu2+、Pb2+、Hg2+、zn2+、Al3+对该酶均有抑制作用.     

海洋交替单胞菌（Alteromonas sp. Y-389）普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

以海洋交替单胞菌(Alteromonas sp. Y-389)的基因组为模板,设计普鲁兰酶基因的引物并进行PCR扩增。将目的基因连接到载体pET-28a(+)后进行测序并进行生物信息学分析。结果显示,基因的开放阅读框全长4 347 bp,编码1 449个氨基酸的普鲁兰酶,为Ⅰ型普鲁兰酶,有4个保守的结构域,属于糖苷水解酶家族13;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),成功诱导出了可溶性的目标蛋白;随后对其酶学性质进行测定与分析,结果表明,该酶的比活力为54.53 U/mg,其最适的反应温度为35℃,最适pH为6.0,Na~+和Mn~(2+)对该酶的活性具有明显的促进作用,而Cu~(2+),Zn~(2+)与Fe~(2+)对其活性的抑制作用比较明显;其酶学参数K_m和V_(max)分别为3.12 mg/mL,228.8 U/mg,将为今后的规模化生产提供数据支持。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)肝胰腺内源酶性质的初步研究

内源酶是三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体内重要的酶,往往会导致梭子蟹死后肌肉组织迅速软化,严重影响了蟹肉的贮藏品质。为了探明该酶的基本特性,本试验从三疣梭子蟹肝胰腺中提取了粗酶,优化了提取方法,并对其部分酶学性质进行初步研究。结果表明:三疣梭子蟹肝胰腺内源酶最佳浸提时间段为4～12 h,酶比活显著高于0～4 h和12～14 h;以酪蛋白为水解底物,内源酶作用最适温度为65℃、最适p H范围为7.0～8.0;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂,包括大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和苯甲基磺酰氟(PMSF),对内源酶活力的相对抑制率分别为100%、70.46%±6.27%,显著高于其他抑制剂的相对抑制率,推测丝氨酸蛋白酶为主要内源酶;在硫酸铵分级沉淀中,分别以酪蛋白和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,前者最适盐析浓度为0～70%,后者为30%～70%,酶比活显著高于其他盐浓度;当硫酸铵浓度为40%～60%时,盐析蛋白质含量、粗酶酶活和丝氨酸蛋白酶活均显著高于其他盐浓度。     

基于脂质组学的海洋颗石藻病毒甾醇去饱和酶及脂肪酸去饱和酶基因功能分析

赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)宿主-病毒(E.huxleyi virus,EhV)的互作过程是影响海洋碳、硫生物地球化学循环及气候变化的重要环节。在共进化过程中,Eh V通过基因水平转移从宿主基因组中“劫获”了一组鞘脂从头合成相关酶基因,重构宿主脂代谢网络以支持病毒的特殊需求。目前,对病毒这组相关酶基因的生物学功能尚不十分清楚。以颗石藻病毒Eh V-99B1基因组中的甾醇去饱和酶(EhV-SD)和脂肪酸去饱和酶(Eh V-FAD)基因为研究对象,构建酿酒酵母重组表达载体p YES2/CT-SD和p YES2/CT-FAD,转化相应的基因缺陷型酵母菌株YMR015C和YGL055W获得重组酵母细胞株,进一步采用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向脂质组学技术,比较分析重组酵母和缺陷型酵母细胞脂质的组成和含量变化。结果显示,Eh V-SD与Eh V-FAD基因在酿酒酵母中成功表达并具有生物学活性。Eh V-SD过表达显著改变了重组酵母细胞脂质代谢,含多不饱和酰基链的磷脂酰胆碱(PC,20︰4/20︰5/20︰6)和甘油三酯(TAG,12︰3)种类的丰度显著升高;而部...     

斑节对虾TSG101基因的克隆及表达分析

为探究肿瘤易感基因101(简称TSG101)对斑节对虾(Penaeusmonodon)的免疫应答作用,了解在细菌刺激下斑节对虾的机体发生的变化机制,本研究以哈维弧菌(Vibrioharveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为实验组,以磷酸缓冲液(PBS)为对照组,通过荧光定量分析展开对斑节对虾对菌刺激的免疫应答作用。结果显示,斑节对虾的TSG101在各组织中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高。在金黄色葡萄球菌刺激下,斑节对虾的TSG101在肝胰腺中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第12小时的TSG101 mRNA的表达量达到最大(为对照组的21.60倍);在鳃中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第6小时斑节对虾TSG101的表达量达到最大值(为对照组的3.64倍)。在注射哈维弧菌第9小时,肝胰腺中的PmTSG101 mRNA表达量极显著上调(P0.01)且达到最大(为对照组的2.50倍)。实验结果初步表明,斑节TSG101参与斑节对虾的先天免疫反应,在金黄色葡萄球菌和哈维弧菌的刺激的情况下,该基因RNA水平的表达情况发生明显变化。     

麻痹性贝毒在毛蚶体内的转化过程研究

麻痹性贝毒能够在贝类体内累积,威胁海产品消费者健康。在以往调查中,多次在毛蚶(Scapharca subcrenata)体内发现高含量的麻痹性贝毒,但对于毛蚶体内麻痹性贝毒的转化过程及其食品安全风险还缺乏认识。通过室内模拟实验,选择太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)和链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)作为产毒藻种,研究了两种有毒藻种所产麻痹性贝毒在毛蚶体内的转化过程。结果表明,毛蚶体内主要出现了三种麻痹性贝毒转化过程,一是R1位羟基的还原反应,二是N-磺酰氨甲酰基类毒素R4位磺酸基团的水解反应,三是含羟基苯甲酸(hydroxybenzoate)基团的链状裸甲藻毒素在R4位的水解反应。毛蚶体内麻痹性贝毒的生物转化过程复杂,对毛蚶毒性的影响具有一定的不确定性,未来仍需要进一步深化毛蚶体内毒素累积、代谢、转化过程的研究,同时加强对毛蚶体内毒素含量的全面监测,防范毛蚶可能导致的麻痹性贝毒中毒风险。     

4种常见头足类动物的血细胞分类及比较

以长蛸(Octopus variabilis)、短蛸(Octopus ocellatus)、真蛸(Octopus vulgaris)和曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)的血细胞为研究对象,通过光镜和电镜观察对血液中的血细胞形态结构进行比较。根据观察结果,将头足类血细胞分成3种类型:透明细胞,小颗粒细胞和颗粒细胞,但在真蛸血细胞中有一定数量的血细胞其细胞核呈马蹄形,因此将此类细胞独立划为马蹄形核细胞。通过比较发现,曼氏无针乌贼的血细胞与其它3个种存在明显的差异,其胞质内的颗粒数量与性质均与其它3个种有较明显的区别差异。从总体来看,头足类血细胞内含颗粒数量较少,其颗粒的数量与免疫力的强弱无直接关联。通过对比,推断真蛸血细胞中的马蹄形核细胞为透明细胞到小颗粒细胞的中间类型,从而得出此4个类型细胞有从透明细胞→马蹄形核细胞→小颗粒细胞→颗粒细胞的发育进程。     

经济海藻繁育、养殖及综合利用的回顾与展望

经济海藻繁育、养殖及综合利用是海洋农牧业及工业的重要组成部分。20世纪经过几代人的努力,我国在海带、紫菜、裙带菜及龙须菜的繁育、养殖关键技术等方面成功取得突破,为这些海藻的产业化提供坚实的保障,为我国成为世界海藻大国奠定了基础。海藻养殖产业为人们提供了食品、藻胶及其它丰富的产品,这包括保健品、功能食品、化妆品及药物等。海藻养殖产业也对人类经济、社会的发展起到重要作用,通过吸收环境中的二氧化碳、氮和磷,为海洋生态环境的改善发挥了重要作用。本文对我国海藻繁育、养殖及综合开发的历程进行简要回顾,对当前我国、中国科学院海洋研究海藻研究与应用进行了总结,对海藻研究发展的未来进行了展望;适应海藻产业从量向质的方向转变,同时兼顾生态环境效益,为我国海藻研发及应用提供参考。     

Morphological observation and rbcL gene sequences studies of two new species, Grateloupia dalianensis H.W.Wang et D.Zhao, sp. nov. and G. yinggehaiensis H.W.Wang et R.X.Luan, sp. nov. (Halymeniaceae, Rhodophyta) from China

A few species in the genus Grateloupia (Halymeniaceae,Rhodophyta) have been investigated in detail with respect to morphological observations and molecular analyses.In this study,the authors document the vegetative and reproductive structures of two new species of Grateloupia,G.dalianensis H.W.Wang et D.Zhao,sp.nov.and G.yinggehaiensis H.W.Wang et R.X.Luan,sp.nov.They both have the morphological character that carpogonial ampullae and auxiliary cell ampullae are the simple Grateloupia-type.The two species can be distinguished from other species of the genus by their distinctive morphological features respectively.Based on ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (rbcL) gene sequences,the phylogenetic tree obtained in the study indicated that they are both embedded within the Grateloupia clade.G.dalianensis clusters a subclade with G.asiatica,and G.yinggehaiensis forms a single monophyletic subclade with G.hawaiiana.     

中国海洋仙菜科(Ceramiaceae)新记录属——盖氏藻属Gayliella(红藻门)的分类研究

利用生物压片技术,通过形态学和解剖学方法,对采自我国沿岸海洋的仙菜科红藻(Ceramiaceae,Rhodophyta)进行了分类学研究,发现了我国仙菜科新记录属——盖氏藻属(新拟名)Gayliella T.O.Cho,L.McIvor et S.M.Boo。该属目前在我国共有5个种,即短毛盖氏藻(新拟名)Gayliella pmbriatum (Setchell et N. L. Gardner). T. O. Cho et S. M. Boo、优美盖氏藻(新拟名) Gayliella βaccidum (Kützing) T. O. Cho et L. McIvor、泰式盖氏藻(新拟名) Gayliella taylorii (E. Y. Dawson) T. O.Cho et S. M. Boo、马沙盖氏藻(新拟名) Gayliella mazoyerae T. O. Cho, Fredericq et Hommersand和横轴盖氏藻(新拟名) Gayliella transversalis (Collins et Hervey) T. O. Cho et Fredericq,...     

日本对虾(Penaeus japonicus)病原需钠弧菌(Vibrio natriegens)表型与分子特征及LAMP检测方法的建立

采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。     

缢蛏(Sinonovacula constricta)微卫星标记的分离及近缘物种通用性

采用磁珠富集和PCR筛选相结合的方法,得到12对缢蛏(Sinonovacula constricta)的多态性微卫星引物。每个位点的观测等位基因数为2—15个,有效等位基因数为1.0339—8.8063个;观测杂合度(Ho)为0.0333—1.0000,平均观测杂合度为0.7525;期望杂合度(He)为0.0333—0.9020,平均期望杂合度为0.6866;多态信息含量(PIC)为0.0320—0.8680。所有位点中,有8个位点属于高度多态位点(PIC0.5),SC1-5和SC4-6属于低度多态位点(PIC0.25);经Bonferroni校正后,无显著偏离哈迪-温伯格平衡的位点;连锁不平衡检验结果表明,位点间不存在连锁不平衡现象。此外,分析了这些引物在近缘种长竹蛏(Solen strictus)、大竹蛏(Solen grandis)和小刀蛏(Cultellus attenuatus)的通用性情况,结果显示:长竹蛏中,位点SC1-4、SC2-8、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态(PIC0.5);在大竹蛏中,位点SC3-4、SC3-7、SC4-6表现出了高度多态性(PIC0.5),SC2-9为低态位点(PIC0.25);在小刀蛏中,位点SC1-7、SC2-9、SC3-4、SC3-14表现出了高度多态性(PIC0.5),SC4-6为低态位点(PIC0.25)。     

三种贝类的核型分析

采用体内注射PHA和秋水仙素的方法,利用成体的鳃组织,对毛蚶(Scapharca subcrenata)、长竹蛏(Solen strictus)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarus)的核型进行了研究.结果表明毛蚶的2倍体数目为2n=38,核型为18m+16sm+2st+2t,NF=72.长竹蛏的2倍体数目为2n=38,核型为30m+6sm+2t,NF=74.菲律宾蛤仔的2倍体数目为2n=38,核型为28m+10sm,NF=76.