鱼干中黄曲霉毒素B1的紫外辐照消减技术参数

【目的】确定最佳紫外消减条件,并探究此条件下紫外辐照对鱼干品质的影响。【方法】在单因素试验基础上,将黄曲霉毒素B1质量浓度、辐照时间、辐照距离因素进行组合,应用Design Expert软件与Box-Behnken试验原则对AFB1降解条件进行优化。【结果】最佳的毒素降解条件:紫外辐照条件为波长365 nm、黄曲霉毒素B1质量浓度109 ng/mL、辐照距离2.11 cm、辐照时间41 min、pH 7,对AFB1的标准溶液降解率为88.1%。该条件下金鲳鱼干与红鱼干中黄曲霉毒素B1的降解率为90.16%、85.32%,拟合性较好,且该最佳紫外辐照降解条件对鱼干品质并不存在显著影响(P>0.05)。【结论】该研究证明紫外辐照适用于鱼干中真菌毒素的消减。     

鱼干曲霉菌分离株鉴定及产毒特性

【目的】探明湛江市售鱼干中曲霉菌(Aspergillus spp.)分离株产AFB₁的特性。【方法】采用马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)对鱼干中的曲霉菌进行分离纯化,根据菌落形态、显微形态观察和ITS序列分析对分离株进行鉴定,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法分析菌株的AFB₁合成量。【结果】鱼干中曲霉菌的分离率高达47.66%,经形态学鉴定发现以黄曲霉(Aspergillus flavus)A03、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)H32、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M23、欧式曲霉(Aspergillus europaeus)M11、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)B21等为主,其中红笛鲷干(Lutjanus sanguinaus)中黄曲霉菌的含量高达1200 CFU/g。黄曲霉A03在红笛鲷干培养基中常温(27~30℃)培养21 d,产AFB₁能力达到3.8 ng/mL。【结论】鱼干中存在产AFB₁的黄曲霉菌,警示鱼干中存在AFB₁污染的风险。     

圆红冬孢酵母高效电转化条件的优化

【目的】建立圆红冬孢酵母的高效电转化方法,为利用圆红冬孢酵母重组表达功能性基因提供方法基础。【方法】以圆红冬孢酵母作为受体菌,将具有潮霉素抗性标记的改造质粒p CAMBIA1301-KCS通过电转化的方式导入到受体菌中,研究酵母细胞培养时间(2、8、14、20、26 h)、电击电压(1、1.5、2.0、2.5、3.0 kV)、前处理剂种类(DTT、LiAc、CaCl2、H2O)对转化效率的影响。【结果】当培养时间为20 h [培养液D(600 nm)约为1.6]、电击电压为2.0 kV、前处理试剂为DTT时,该系统转化率最高可达到20.8×104 cfu/μg。【结论】采用电击法将环状质粒转化入圆红冬孢酵母,能够成功实现外源基因的遗传转化,采用优化的转化条件可以获得较高的转化效率,是过去相关报道最高转化率的100倍。     

基于PCR和TOF-MS海洋源产脂肽芽孢杆菌筛选

【目的】准确高效分离红树林等海洋环境中产脂肽芽孢杆菌。【方法】将前期从红树林环境筛出具有抗菌活性的12株芽孢菌株作为研究菌株,采用溶血活性及排油作用对其中的可能产脂肽菌株进行初步筛选,并基于脂肽合成酶基因PCR扩增法对脂肽合成酶基因携带菌复筛,采用飞行时间质谱(TOF-MS)对所产脂肽进行鉴定。【结果】初步发现6株芽孢杆菌具有溶血活性,其中HY-5、HY-4和HN-9这3株具有排油能力,油层透明圈的直径分别为45、32和3 mm。PCR扩增检测到HY-5含有iturin、surfactin和bacillomycin D合成酶基因,HY-4含有iturin、surfactin合成酶基因,HN-9含有iturin合成酶基因。TOF-MS检测到HY-5和HY-4的发酵液含surfactin、iturin和bacillomycin 3种脂肽,HN-9的发酵液只含iturin。【结论】基于PCR与TOF-MS为核心的级联技术,建立一种海洋源脂肽产生菌快速筛选以及脂肽谱快速鉴定的方法,解决海洋源芽孢杆菌在常规培养基难合成脂肽造成的漏筛情况。     

凡纳滨对虾烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析

【目的】研究广东湛江地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)烂尾病主要病原及其药敏特征。【方法】从对虾病灶部位分离纯化细菌,用2株代表菌株对健康虾进行创伤浸浴感染试验,分析菌株形态特征、生理生化特征以及16S rRNA和HSP60基因序列,以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和坎氏弧菌(V. campbelli)溶血素基因特异引物扩增菌株基因组DNA,通过纸片扩散法测试菌株对17种药物的敏感性。【结果】从患病亲虾和养殖对虾分别分离获得编号2018B22和2018MZ1的代表菌,两株菌16Sr RNA和HSP60基因序列均与哈维氏弧菌最相似,且均可被哈维氏弧菌溶血素基因引物特异扩增,表型特征亦与哈维氏弧菌相近;两株菌均可引起凡纳滨对虾烂尾病,其中菌株2018B22的致病力较2018MZ1更强,而后者的耐药谱更广。【结论】湛江地区凡纳滨对虾烂尾病主要病原为哈维氏弧菌。     

海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的分离及多样性分析

【目的】分析海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的多样性,并对活性菌株胞外与胞内代谢物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力进行测定。【方法】采用溶钙圈分离培养技术和DPPH自由基清除法,从湛江海域6种海洋动物肠道中分离活性乳酸;通过构建16S rDNA基因序列系统发育树,分析其多样性;利用DPPH自由基清除法,测定其抗氧化活性。【结果】共分离得到16株抗氧化活性乳酸菌,分属于细菌域厚壁菌门(Firmicutes)的4个科(Leuconostocaceae,Streptococcaceae,Lactobacillaceae,Enterococcaceae)、6个属(Weissella,Pediococcus,Leuconostoc,Lactococcus,Lactobacillus,Enterococcus),其中除菌株zy-3、LY-87、ZH-54的16S r DNA基因序列与数据库EzBioCloud中的模式菌相似性100%外,其余13株活性菌株与模式菌存在一定的遗传差异(97.42%～99.93%),菌株zy-I与模式菌株Weissella cibaria(KACC11862T)的相似性仅为97.42%,推测为Weissella cibaria属中的潜在新种;16株活性菌株胞外代谢物对DPPH的抗氧化活性均大于胞内代谢物,且5株乳酸菌株(zy-4、zy-s6、YM-49、ZH-53、ZH-54)的胞外的DPPH清除能力均在45%以上,高于其它11株菌株。【结论】湛江海域动物肠道中存在较为丰富的抗氧化活性乳酸菌,并蕴藏潜在乳酸菌新种。     

波吉卵囊藻对弧菌生长的影响

研究波吉卵囊藻及藻―菌体系对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)生长的影响,结果显示:无菌波吉卵囊藻对创伤弧菌、副溶血弧菌的生长均有显著促进作用(P<0.05),对溶藻弧菌的生长无显著影响(P>0.05);波吉卵囊藻―沼泽红假单胞菌体系对溶藻弧菌有明显抑制作用(P<0.05);无菌波吉卵囊藻―枯草芽孢杆菌体系对溶藻弧菌的生长有显著促进作用(P<0.05),对创伤弧菌、副溶血弧菌的生长无显著影响(P>0.05);带菌波吉卵囊藻对三株弧菌均有明显抑制作用(P<0.05);带菌波吉卵囊藻共栖细菌对三株弧菌均无明显抑制作用(P>0.05);在无菌波吉卵囊藻中回加带菌藻共栖细菌,分析实验10～18d的数据发现的数据发现藻―菌体系对创伤弧菌、副溶血弧菌的生长有显著影响(P<0.05),藻―菌体系逐渐恢复对三株弧菌的抑制作用。     

基于OSMAC策略的3株海洋真菌发酵条件筛选与优化

【目的】筛选可促进海洋真菌产生代谢产物更丰富的发酵条件,进一步挖掘菌株在抗阿尔茨海默症方面的潜力。【方法】基于OSMAC策略,分别选用马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基、察氏培养基、大米培养基和葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(GPY)培养基,并设置3种盐度(3、30和100),对Talaromyces sp. 001、Penicillium sp. 019和Aspergillus terreus ZN4-5-4等3株海洋真菌进行小规模发酵培养。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化,并根据TLC指纹图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段筛选出代谢产物丰富、毒性小且AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富的发酵培养条件。【结果】菌株001的最优发酵条件是盐度3的GPY培养基,菌株019的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基,菌株ZN4-5-4的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基。【结论】OSMAC策略指导下,改变培养基条件对菌株产生次生代谢产物有显著影响。     

大口黑鲈肠道益生菌的分离与鉴定

【目的】分离鉴定大口黑鲈（Micropterus salmoides）肠道益生菌,评估分离菌用作饲料添加剂的益生潜力。【方法】采集大口黑鲈肠道样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA序列比对和生化试验鉴定种属,并进行抗逆性能、黏附能力、溶血活性和药敏特性等鉴定。【结果】从大口黑鲈肠道分离菌株84株,经测序、blast比对,筛选出3株同源性最高的菌株MS-1、MS-2、MS-3,分别鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。3株分离菌均为γ-溶血,不具有生物膜,疏水性50%～93.3%,自凝集性43.6%～69.2%;可在pH 2.0～12.0环境和5.0 g/L胆盐中存活;经高温处理后仍可生长;3株菌对大多数抗生素敏感。【结论】芽孢杆菌MS-1、MS-2和MS-3抗逆性高,黏附性能及饲料学安全性高,可作为大口黑鲈养殖中潜在益生菌。     

对虾体内4种真菌毒素超声萃取LC-MS/MS检测及其蓄积分布特征

【目的】建立超声辅助萃取高效液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)同步检测对虾各组织及血液中黄曲霉毒素(AflatoxinB1,AFB1)、T-2毒素(T-2)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)。【方法】取对虾肌肉、头胸部、虾壳、肝胰腺、肠道和血液样品,采用乙腈/水(体积比85∶15)为提取溶剂,20℃超声辅助萃取60 min,正己烷脱脂,以MycoSpinTM 400柱净化,采用液相色谱-串联质谱法进行检测,用Hypersil Gold-C18色谱柱分离;以流动相甲醇和5 mmol/L的乙酸铵(含0.1%甲酸)进行梯度洗脱,流速为0.25 mL/min;采用正负离子扫描模式,外标法定量。【结果】4种真菌毒素在各自线性范围内线性良好,相关系数(r~2)均大于0.99,定量限为0.3～3.0μg/kg,回收率为75.0%～105.4%,相对标准偏差(Relative standard deviation, RSD)为2.1%～14.5%,通过超声辅助萃取条件优化,显著提高了对虾组织中真菌毒素的提取率。【结论】LC-MS/MS方法前处理简单、检测速度快、净化效果好、结果准确、可靠,适合对虾各组织中多种真菌毒素的快速检测。真菌毒素在对虾不同组织中的蓄积特征,AFB1、T-2、OTA和DON均主要蓄积于对虾肠道与血液中,蓄积率分别达到43%～52%和31%～45%,头部、肌肉、肝胰腺和外壳蓄积率均低于10%,并非真菌毒素残留的靶向组织。     

溶藻弧菌gr基因缺失株构建及其生物学特性

【目的】研究敲除谷胱甘肽还原酶(GR)基因gr对溶藻弧菌HY9901生物学特性的影响。【方法】通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌HY9901的gr基因缺失株,通过反转录验证并检测其遗传稳定性,绘制该菌的野生株和缺失株的生长曲线,测定该菌野生株和缺失株的生物膜形成能力、抗生素敏感性、胞外蛋白酶活性和泳动能力等生物学特性。【结果】gr基因的缺失几乎不影响溶藻弧菌的生长趋势,但敲除gr基因后溶藻弧菌对呋喃唑酮、头孢唑林、四环素等敏感性增强,该菌的生物膜形成能力增强显著提高。缺失株△gr的胞外蛋白酶活性和泳动能力均低于野生株。【结论】谷胱甘肽还原酶在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、药物敏感性、泳动等方面有重要作用。     

马氏珠母贝α2-巨球蛋白受体结合区酵母双杂交系统的构建及自激活检测

【目的】构建马氏珠母贝(Pinctada martensii)酵母双杂交文库及α2-巨球蛋白受体结合区诱饵载体,检测其在酵母细胞中的自激活作用。【方法】利用CLONTECH SMART技术及酵母体内同源重组的方法构建马氏珠母贝酵母双杂交cDNA文库;将α2-巨球蛋白受体结合区克隆至pGADT7载体,并转化AH109酵母感受态细胞,检测自激活作用。【结果与结论】酵母双杂交文库容量为1.11×107克隆/mL,重组率大于90%;菌落PCR结果显示,插入片段长度均在500bp以上;诱饵质粒成功转化至AH109菌株,且无自激活性,符合文库构建指标,可用于文库筛选。     

化学诱导对2株海洋真菌次级代谢产物及其生物活性的影响

【目的】以2株海洋真菌为研究对象,探究不同种类及浓度的化学表观遗传修饰剂对其次级代谢产物化学多样性和生物活性的影响。【方法】基于化学表观遗传修饰策略,采用两种不同的化学表观遗传修饰剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azaC)和丁酸钠,分别对Penicillium sp.019和Aspergillus terreus ZN4-5-4两株海洋来源真菌进行表观遗传修饰。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化,并根据薄层层析(TLC)指纹图谱、高效液相色谱(HPLC)图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段,从中筛选出代谢产物丰富、AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富且毒性小的发酵培养条件。【结果】添加1 mmol/mL的丁酸钠诱导剂可使菌株019和ZN4-5-4的次生代谢产物的种类增加,且同时能提高该菌株次级代谢产物的AChE的抑制活性和DPPH自由基清除活性。因此,确定菌株019和ZN4-5-4的最优发酵条件均是添加浓度为1 mmol/mL丁酸钠的PDB培养基。【结论】化学表观遗传修饰策略指导下,添加诱导剂5-azaC或者丁酸钠对2株海洋真菌次生代谢产物的产生有影响。     

2种充气模式中华鳖工厂化养殖水体水质及微生物群落结构

【目的】研究2种充气模式对中华鳖(Pelodiscus sinensis)工厂化养殖水体微生态环境的作用效果。【方法】使用EPDM微孔管(MA)和PVC普通通底管(DG)两种充气模式对该物种工厂化养殖水体进行充气,分析水体的水质状况和微生物群落结构。【结果】1)微孔管的充气效率明显优于通底管。MA组的水体溶解氧含量(DO)显著高于DG组(P <0.05),亚硝态氮含量(NO2--N)显著低于DG组(P <0.05)。2)两种充气模式的微生物群落结构差异显著。在门水平,MA组微生物群落组成为变形菌门(Proteobacteria,44.81%)、髌骨细菌门(Patescibacteria,13.15%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes,10.49%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,9.56%),DG组优势菌门较为集中,66.99%为变形菌门,12.81%为髌骨细菌门。在科水平,MA组的优势菌科为红环菌科(Rhodocyclaccae,34.07%)和芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae,10.48%),DG组的优势菌科为红杆菌科(Rhodoba...     

侧孢短芽孢杆菌对铜绿微囊藻藻际微生物群落的影响

【目的】探究铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)藻际微生物群落组成以及与溶藻细菌侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)Bl-zj共培养对藻际微生物群落的影响。【方法】将侧孢短芽孢杆菌Bl-zj与铜绿微囊藻共培养4 d后(BL组),收集样品,以单独培养的铜绿微囊藻(BG组)为对照,提取样品总基因组DNA后进行16S rDNA扩增、构建文库、测序及生物信息学分析,比较BL组与BG组间藻际微生物群落的差异。【结果】测序平均获得高质量序列85390条,946个OUT(Operational Taxonomic Unit),BL组特有OTU 339个。物种组成分析显示,BG组微生物群落主要以微囊藻属(Microcystis)为主,其余相对丰度由高到低分别为假单胞菌属(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)和红杆菌属(Rhodobacter)。BL组微生物群落主要以短芽孢杆菌属(Brevibacillus)为主。BL组的微生物多样性相较于BG组显著下降(P<0.05)。经预测,BG组微生物功能集中在能量代谢与外源生物降解与代谢,BL组微生物功能集中在碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能。【结论】侧孢短芽孢杆菌Bl-zj与铜绿微囊藻共培养,打破了铜绿微囊藻藻际微生物群落的平衡,与Bl-zj的溶藻进程有关。     

盐酸普鲁卡因诱导下海洋真菌Hypocrea lixii次级代谢化学成分

【目的】通过化学诱导方法从一株海洋真菌Hypocrea lixii中获得多样化的活性小分子化合物。【方法】对菌株在盐酸普鲁卡因的化学诱导作用下进行固体发酵,代谢产物采用硅胶减压柱层析、Sephadex LH-20以及pHPLC等手段分离纯化,对化合物运用NMR、MS等波谱学技术并比对文献进行结构鉴定,采用Ellman比色法及DPPH自由基清除法对化合物进行初步抗乙酰胆碱酯酶(AChE)和抗氧化活性测试。【结果】从海洋真菌Hypocrea lixii在盐酸普鲁卡因诱导下的发酵提取物中分离得到4个异黄酮类化合物,包括6'-O-crotonylgenistin(1)、Genistein(2)、Daidzein(3)和Genistin(4),以及对氨基苯甲酸甲酯(5)、对羟基苯丙酸(6)和胞嘧啶(7),其中化合物1和6为该种中首次报道,化合物5为生物转化来源首次报道,化合物2~4可能源自培养基。在100μmol/L剂量浓度下,化合物1~4对AChE的抑制以及DPPH自由基的清除活性均较弱,化合物5和6显示了相对强的AChE抑制活性,抑制率分别为40%和38%。【结论】盐酸普鲁卡因对该菌次级代谢产生了显著的影响,为深入研究该菌株化学诱导次级代谢产物提供基础。     

酵母培养物对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、肠道形态、免疫功能和抗病力的影响

【目的】研究含非蛋白氮(L)、不含非蛋白氮(N)的2种酵母培养物对珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinepheluslanceolatu♂)生长性能、肠道形态、免疫功能和抗病能力的影响。【方法】在基础饲料中分别添加质量分数0%(对照C0组),2%、4%酵母培养物L(L1、L2组)以及2%、4%的酵母培养物N(N1、N2组),配制成5组等氮等脂饲料,饲喂珍珠龙胆石斑鱼56 d,测定石斑鱼生长性能、体成分、免疫力指标;观察肠道形态结构;用哈维氏弧菌对实验鱼进行攻毒,研究实验鱼抗病力。【结果】养殖实验结束后,N1和N2组珍珠龙胆石斑鱼存活率(SR)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)显著高于对照组(P 0.05),而饲料系数(FCR)显著低于对照组(P 0.05)。N2组的干物质、粗蛋白和灰分含量显著提高(P 0.05),而粗脂肪含量以N1组显著增加(P 0.05)。N1和N2组的消化酶活性显著高于对照组(P 0.05)。N2组鱼血清总蛋白、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和免疫球蛋白活性显著高于对照组(P 0.05),而葡萄糖、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和丙二醛活性显著低于对照组(P0.05)。N2组溶菌酶、甘油三脂和胆固醇与对照组相比无显著差异(P0.05)。N1和N2组肠绒毛高度显著提高,肠绒毛宽度显著增加(P0.05)。攻毒实验表明,珍珠龙胆石斑鱼对哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)的抵抗力增强,N2组的累积存活率最高。【结论】在本研究条件下,以增重率、免疫指标和累积存活率为判据,饲料中添加质量分数4%发酵底物不含非蛋白氮的酵母培养物对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、免疫和抗病能力的促进作用最显著。     

波吉卵囊藻遗传转化体系选择标记的筛选

【目的】确定波吉卵囊藻(Oocystis borgei)遗传转化体系中的选择筛选标记。【方法】使用分光光度计法测定藻体生物量、叶绿素含量及观察藻液颜色变化,综合评定波吉卵囊藻对6种抗生素的敏感性。【结果】1)波吉卵囊藻对博来霉素非常敏感,25μg/m L的博来霉素即能完全抑制藻体生长,叶绿素含量极显著低于对照组(P0.01),藻体颜色发黄变白;2)红霉素和氯霉素各浓度的处理都会使藻体生物量和叶绿素含量极显著降低(P0.01),但是溶解红霉素和氯霉素的乙醇溶剂会对藻体生长产生抑制,不适用作筛选试剂;3)氨苄青霉素、遗传霉素和庆大霉素对波吉卵囊藻生长抑制作用不明显,甚至会促进叶绿素含量的增加。【结论】质量浓度为25μg/m L的博来霉素可以作为波吉卵囊藻遗传转化中的筛选试剂。     

乳酸菌发酵法富集辣木叶中γ-氨基丁酸的研究

【目的】利用乳酸菌为发酵菌株,对辣木叶中的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)进行发酵富集。【方法】对2株报道产GABA的商业菌株及两株实验室筛选产GABA的菌株进行筛选,得到最适发酵菌株。对辣木粉添加量、谷氨酸钠(MSG)添加量、初始pH、发酵温度、发酵时间进行单因素实验,并选择MSG添加量、初始pH、发酵温度,发酵时间进行正交实验,得出最佳发酵条件。【结果】4种乳酸菌产GABA能力大小依次为植物乳杆菌LK-1植物乳杆菌S35耐久肠球菌干酪乳杆菌LK-1,利用植物乳杆菌LK-1发酵辣木叶,GABA的含量可高达152 mg/L。经单因素及正交实验,确定GABA的最佳发酵条件为辣木叶粉添加量为质量分数4%,MSG添加量为4g/L,初始pH6.5,发酵温度为35℃,发酵时间72h。在此条件下发酵辣木液GABA质量浓度可高达209mg/L,比未发酵的辣木液提高1.45倍。【结论】利用植物乳杆菌LK-1发酵辣木叶能大大提高GABA的含量。     

噬菌弧菌N1对淡水和海水养殖水体细菌群落影响PCR-DGGE分析

【目的】研究噬菌弧菌Bacteriovorax sp. N1在一个投放周期内对淡水和海水养殖环境中细菌、弧菌总数及细菌群落结构的影响。【方法】自市售微生态制剂分离蛭弧菌N1并进行分子鉴定,测定其裂解效果,制备高浓度N1菌液分别投放至淡水红鲤鱼(red carp)和海水仿刺参(Apostichopus japonicus)养殖水体,采用细菌平板计数法及PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析48 h内水体环境中细菌、弧菌总数及细菌群落结构变化。【结果】经鉴定蛭弧菌N1为噬菌弧菌,其对大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、黄海希瓦氏菌(Shewanella smarisflavi)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均有裂解效果。将噬菌弧菌N1投放进淡水和海水养殖环境的12～24 h,其能显著降低两种环境中弧菌含量(P 0.05)。DGGE分析显示添加噬菌弧菌N1后淡水组优势菌群弧菌属(Vibrio,a1)和不可培养杆菌属(Uncultured bacterium, a5)在12 h以后含量有明显的减少,假单胞菌属(Pseudomonas, a3)和红杆菌科Shimia属(Shimia, a6)菌含量增加。海水组优势菌群不可培养杆菌属(c2)菌在12 h时变成非优势菌群,而白杆菌属(Albirhodobacter,c1)增加成为优势菌群。噬菌弧菌N1在水中含量在24 h时降至最低。【结论】噬菌弧菌N1对海水和淡水环境中的弧菌属和不可培养杆菌属菌群有明显的裂解作用导致其含量下降,但也使假单胞菌属(Pseudomonas),红杆菌科Shimia属和白杆菌属(Albirhodobacter)菌群含量增加,但生物效应不明。为维持噬菌弧菌N1对弧菌的控制,需要24 h左右重新补充投放。