尼罗罗非鱼marco基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)胶原样结构巨噬细胞受体(macrophage receptor with collagenous structure,Marco)的结构特征和免疫功能,为揭示尼罗罗非鱼免疫应答机制提供理论基础。【方法】采用聚合酶链式反应从尼罗罗非鱼脾脏克隆marco基因序列,利用生物信息学和亚细胞定位等手段分析其结构特征,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测其表达情况。【结果】尼罗罗非鱼marco基因(Onmarco)的开放阅读框(open reading frame,ORF)长1 071 bp,共编码356个氨基酸,具有跨膜结构域、典型的胶原样结构域和C端富半胱氨酸受体(scavenger receptor cystein-rich,SRCR)结构域;多序列比对和系统进化分析表明,Marco在硬骨鱼类中具有较高的保守性;亚细胞定位显示,尼罗罗非鱼Marco(OnMarco)在HEK-293T细胞中为全细胞分布,主要在细胞膜上表达;qRT-PCR结果显示,Onmarco在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,但在血液中的表达量最高...     

尼罗罗非鱼补体3基因片段的原核表达及条件优化

【目的】补体3(Complement3,C3)在罗非鱼的抗病感染中有重要作用,研究C3基因判断原核表达及表达条件。【方法】根据NCBI中已公布罗非鱼补体C3的基因序列,选取C3基因片段,设计一对带有酶切位点的特异性引物,经连接、转化等后,使用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI对克隆成功的C3基因片段以及原核表达载体pGEX-4T进行双酶切,构建重组质粒pGEX-4T-C3,导入大肠杆菌进行原核表达,并优化表达条件,并对纯化目的蛋白进行Western Blot鉴定。【结果】C3基因片段的重组质粒pGEX-4T-C3构建成功。罗非鱼C3基因片段编码区长度为1 341 bp。获得的目的蛋白分子质量为75 ku,与预期结果相符。最佳诱导时间、浓度以及温度分别为4 h、0.2 mmol/L以及37℃;目的蛋白主要以包涵体的形似存在。重组蛋白可以与GST-Tag单克隆抗体特异性结合,说明成功获得罗非鱼C3片段的重组蛋白。     

尼罗罗非鱼Galectin-3基因的原核表达与条件优化

【目的】对Galectin-3蛋白进行纯化,优化诱导相关表达条件,为大量获取罗非鱼Galectin-3蛋白提供方案。【方法】根据NCBI上已公布的罗非鱼(Oreochromismossambicus)Galectin-3基因序列,设计多对带Eco RI和Xhol酶切位点的引物,筛选出良性扩增引物,对罗非鱼cDNA经进行聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制性快切酶双酶切、T4连接酶连接等步骤,构建罗非鱼Galectin-3基因的原核表达质粒pGEX-4T-Galectin-3,将重组质粒导入大肠杆菌BL21中,进行Galectin-3重组蛋白的表达。并比较不同的诱导温度、诱导时间、IPTG浓度条件下的表达效果,对Galectin-3蛋白表达最优条件进行筛选。【结果】构建了罗非鱼Galectin-3原核表达质粒,进行Galectin-3重组蛋白后发现37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h即可诱导Galectin-3重组蛋白高效表达。免疫印迹结果显示,经蛋白纯化柱纯化后的pGEX-4T-Galectin-3重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼的Galectin-3蛋白。【结论】本研究成功构建了罗非鱼Galectin-3基因的原核表达载体,并确定了Galectin-3融合蛋白最适的表达条件:37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h。     

尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因克隆与表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长,通过生物信息学分析其序列结构特征;利用实时荧光定量PCR检测基因的组织分布特征,以及健康尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后该基因的表达变化,并进一步分离出尼罗罗非鱼非特异性毒性细胞(NCC),检测脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后,On-LTα在NCC中的表达变化。【结果】On-LTα基因序列全长为2699 bp,包含705 bp开放阅读框(ORF),编码234个氨基酸(GenBank登录号:MK770358)。该蛋白属于跨膜蛋白,具有肿瘤坏死因子(TNF)家族保守结构域。实时荧光定量结果表明,On-LTα在健康尼罗罗非鱼11种组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高;无乳链球菌刺激后,该基因在脾脏中的表达量显著升高;LPS与PolyI:C刺激后,On-LTα在NCC中表达量也显著上调。【结论】On-LTα参与了尼罗罗非鱼抗菌抗病毒的免疫应答过程。     

无乳链球菌sodA基因的克隆、序列分析及原核表达载体构建

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起我国南方罗非鱼链球菌病的主要病原之一,SodA是无乳链球菌重要的毒力因子之一。根据链球菌sod A基因保守区设计引物,采用PCR扩增sod A基因部分序列,反向PCR和巢式PCR扩增其侧翼序列,成功获得无乳链球菌sod A基因。无乳链球菌sod A基因序列全长为699 bp,含开放阅读框609 bp,可编码202个氨基酸,演绎的SodA蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与犬链球菌(S.canis)及副乳房链球菌(S.parauberis)相应蛋白的氨基酸序列相似性分别高达80%和79%。将sodA基因克隆至原核表达载体pET28a上成功构建了重组质粒p ET28a-sod A,导入Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达的重组蛋白质分子质量约为24 ku,主要以包涵体形式存在于表达菌中。     

罗非鱼干扰素诱导蛋白35基因克隆及表达分析

【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)干扰素诱导蛋白35(interferon induced protein 35,ifi35)在免疫反应中的作用。【方法】克隆获得罗非鱼ifi35基因开放阅读框序列(GenBank登录号:XM_003442606;On-ifi35),采用实时荧光定量PCR技术检测On-ifi35在健康罗非鱼不同组织中的分布,以及不同刺激物刺激后的表达。【结果与结论】On-ifi35基因编码区为1125bp,编码374个氨基酸,理论分子质量为42.79ku,等电点为5.01。On-ifi35含有1个LZD结构域和2个Nmi/IFP 35 domain (NID)。多序列比对发现On-ifi35与其它物种的ifi35氨基酸序列同源性介于35.23%～93.32%之间,且与斑马拟丽鱼同源性最高。系统进化分析发现,On-ifi35与斑马拟丽鱼的ifi35聚为一支。实时荧光定量PCR分析显示,On-ifi35在健康罗非鱼各组织中均有表达,其中在脾脏组织中表达量最高,其次是胸腺、肝脏、心脏、肌肉、肠道、体肾、脑、鳃、头肾,在皮肤中表达量最低。经无乳链球菌和PolyI:C刺激后,On-ifi35表达量在脾脏、肠道、体肾和头肾中均发生显著性变化且呈现出显著的时序性。     

饥饿和再投喂对尼罗罗非鱼蛋白酶活性的影响

测定了饥饿和再投喂的尼罗罗非鱼胃、肠、肝胰脏蛋白酶活性。结果表明:(1)尼罗罗非鱼蛋白酶的活性以胃为最高,肠为最低,且胃蛋白酶的活性极显著高于肠、肝胰脏(P<0.01),肠和肝胰脏之间差异不显著(P>0.05);(2)饥饿后,蛋白酶活性呈降低的趋势,饥饿处理25d后,胃、肠、肝胰脏的蛋白酶活力分别降低到饥饿处理前的42.7%、41.0%、61.5%,均与对照组差异极显著(P<0.01);(3)再投喂后,饥俄15d以内的鱼蛋白酶活性上升迅速,经过15d恢复投喂,基本上就恢复到了正常水平,且消化酶活性甚至高于一直投喂对照组,而饥饿20、25d的鱼蛋白酶活性虽缓慢上升,但仍无法恢复到正常水平,与对照组差异显著(P<0.05)。     

无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果

制备无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)临床分离株ZJ02的灭活疫苗,采用注射和浸泡2种方法,研究疫苗对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的免疫保护效果和血清抗体效价。注射组以4个不同浓度的白油佐剂灭活疫苗免疫罗非鱼,浸泡组以相同免疫剂量的灭活疫苗分别与消旋山莨菪碱、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化钠3种佐剂免疫罗非鱼。结果显示,无乳链球菌疫苗对罗非鱼具有较强的免疫原性,与对照组相比,免疫组血清中的抗体效价水平均显著性提高(p<0.05),注射组和浸泡组的抗体效价最高分别达到1∶256和1∶128;注射组中不同剂量的疫苗免疫组免疫保护率较高,高浓度组可达到95%,浸泡组中使用3种佐剂的免疫组免疫保护率分别为59%、64%、55%。表明无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼具有很好的免疫保护性,免疫剂量在5×108~4×109cfu/mL之间对注射免疫效果有显著性影响,消旋山莨菪碱、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化钠对浸泡免疫效果具有不同的免疫保护率。     

广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性

从广东省5个罗非鱼主养区患暴发性的罗非鱼中分离到15株菌,挑选其中的5株(不同地域、不同组织分离的菌株)进行人工感染试验,表现出自然发病的症状,确定此5株分离菌为导致罗非鱼暴发病的主要病原。通过形态学观察和生理生化实验,并结合16SrRNA基因序列分析,5株分离菌株均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。5株分离菌在形态学和生理生化实验结果上保持一致,16SrRNA基因序列同源性达98.6%～99.8%,但在致病性和对药物的敏感性上却呈现一定的差异。另外10株分离菌株通过生理生化实验鉴定也为无乳链球菌。研究表明,广东省罗非鱼流行性暴发病的病原菌主要为无乳链球菌。     

运用RAPD技术分析3种罗非鱼的遗传多样性

应用RAPD技术,从7个系列140种随机引物中筛选出15个,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、奥利亚罗非鱼(O.aureus)和星洲银罗非鱼(O.sp.)进行遗传多样性分析。结果表明,尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、星洲银罗非鱼的多态位点比例(P)分别为54.7%、44.4%和56.0%,种内个体间遗传距离分别为0.145 0、0.115 6和0.141 3,种内遗传相似系数分别为0.855 0、0.884 6和0.858 7;种间遗传距离的聚类分析表明,星洲银罗非鱼与尼罗罗非鱼亲缘关系较近,一定程度上验证了星洲银罗非鱼的分类地位。     

注射黄芪多糖对吉富罗非鱼c型溶菌酶基因表达量的影响

将黄芪多糖(APS)用无菌生理盐水配制成2 mg/mL和20 mg/mL针剂,腹腔注射吉富罗非鱼,以注射无菌生理盐水为对照。24 h后分别提取吉富罗非鱼鳃、头肾、肝脏、脾脏等组织中的总RNA并反转录成cDNA,利用Real-time PCR方法对不同组织中基因表达进行定量分析。结果表明:吉富罗非鱼腹腔注射20 mg/mL高剂量APS后,其鳃、头肾、肝脏等三个组织中的Lysozyme-c基因表达量显著高于对照组(P<0.05);注射2 mg/mL低剂量APS后,Lysozyme-c基因表达量仅在脾脏中出现显著上调(P<0.05)。APS可通过诱导Lysozyme-c基因在鳃、头肾、肝脏和脾脏等组织在的表达量,来提高吉富罗非鱼的机体免疫力。     

马氏珠母贝Su(H)基因克隆与组织特异性表达

Su(H)基因(Suppressor of Hairless gene)对生物体细胞的分化、增殖和凋亡起重要的调控作用。根据马氏珠母贝(Pinctada martensii)转录组数据库中注释为Su(H)的unigene序列设计基因特异性引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝Su(H)[pm-Su(H)]基因cDNA全长序列。结果表明:pm-Su(H)基因全长3 830 bp,其中开放阅读框含有1 920 bp,编码640个氨基酸残基,5'UTR为1 568bp,3'UTR为342 bp,含有27 bp polyA;预测其分子质量为70.6 ku,等电点为7.38;多序列比对显示,pm-Su(H)与其他物种的Su(H)有较高的保守性,与牡蛎(Crassostrea gigas)的同源序列高达80%;荧光定量PCR分析表明,pm-Su(H)在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、珍珠囊、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴等8组织中均有表达,其中以性腺中表达量最高,其次是珍珠囊和外套膜。     

尼罗罗非鱼体重与体维可量性状之间的关系

以尼罗罗非鱼为研究对象,通过测量和回归分析,研究体重与体维可量性状之间的相关关系。结果表明:体重与体长、身长、全长、体高、体厚等形态特征性状的相关性均高于0.85,呈较高的正相关关系;多元回归方程lnW=a+b1lnLS+b2lnDB和lnW=a+b1lnLC+b2lnDB对于全体数据的拟合度分别为0.958和0.955,拟合度较高,且在实际检验中效果较好,超过88%的个体误差范围在5.0%之内,可有效反映出不同体维性状对鱼类体重的影响。     

常用剂量氟苯尼考在罗非鱼肝脏和肾脏中的消除规律及组织学影响

在水温28℃条件下,以12 mg/kg剂量对罗非鱼单次口服给药,采用HPLC方法测定不同时间实验鱼肝脏和肾脏中的药物水平,分析氟苯尼考在罗非鱼肝、肾组织的吸收及消除规律。结果显示,肝脏和肾脏中的药动学参数均符合药动学一室模型,肝脏的药物消除速度快于肾脏,消除半衰期T1/2β分别为4.89 h和15.93 h;药物在肝脏的Tmax为5.43 h,吸收峰值为4.84μg/g;59 h后肝、肾组织中的药物含量均低于0.8μg/g。取12 mg/kg剂量连续给药7 d的实验鱼肝、肾组织,进行组织学观察,结果显示,给药组罗非鱼的肝、肾组织均未出现病理性变化。此外,氟苯尼考对6株罗非鱼常见病原菌的体外抑菌实验中,最小抑菌浓度(MIC)均≤4 mg/L,表明常用剂量氟苯尼考在罗非鱼体内消除快、残留少且不造成组织损伤,对常见病原菌具有良好的抑菌效果。     

持续高温对吉富罗非鱼幼鱼消化酶和溶菌酶活力的影响

通过人工控温,对吉富罗非鱼（GIFT Oreorhromis niloticus）幼鱼实施34℃持续高温处理,研究持续高温对吉富罗非鱼幼鱼消化酶和溶菌酶活力的影响。结果表明：持续高温对吉富罗非鱼幼鱼消化酶活力的影响有统计学意义（P〈0．05）,对溶菌酶活力影响不具统计学意义（P〉0.05）;随着时间的推进,脂肪酶、淀粉酶活力增加,差异有统计学意义（P〈0．05）,溶菌酶活力增加,但差异无统计学意义（P〉0.05）。表明持续高温能一定程度地提高罗非鱼的消化能力和免疫功能。     

罗非鱼鱼鳞胶制备降血压胶原肽的工艺及酶解物活性

以罗非鱼鱼鳞胶为原料,制备对血管紧张素转换酶(ACE)有抑制活性的降血压肽。以水解度(DH)及ACE抑制率为指标,筛选水解鱼鳞胶的最适酶种,并对其水解工艺条件进行优化;采用超滤技术对所制备的降血压肽进行分离纯化,比较不同组分的ACE抑制率,测定高ACE抑制率组分的氨基酸组成,并运用MALDI-TOF-MS法分析其分子质量分布。结果表明,复合蛋白酶是水解鱼鳞胶最适酶种,在50℃、pH7.5、料液质量体积比1∶5、酶与底物质量比(mE/mS)1.5%条件下,酶解6 h,酶解液的ACE抑制作用最强,其水解度DH 73%,ACE的抑制率76.15%。酶解液经超滤分离所获得的分子质量小于2 000 u的组分对ACE抑制率最高,达83.15%;该组分的氨基酸主要含有Gly和Pro,含量分别为22.04%和11.40%;该组分分子质量范围为1 300~2 000 u。     

草鱼白细胞介素6基因克隆与表达分析

白细胞介素6(IL-6)是一个多效的细胞因子,在机体免疫应答、急性期反应以及造血调控等过程中发挥着重要作用。以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象,采用RT-PCR和Smart RACE技术克隆获得草鱼IL-6(CiIL-6)cDNA序列,CiIL-6的cDNA全长为1 145 bp,包含一个长为702 bp的开放阅读框,能编码233个氨基酸,预测CiIL-6的蛋白质分子质量为26.74 ku,等电点为8.72。其中5'和3'非编码区(UTR)分别为86 bp和357bp。氨基酸同源性分析显示,草鱼和斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近,它们的CiIL-6氨基酸同源性高达76%,而与其他物种的同源性均低于30%。RT-PCR的结果显示,CiIL-6在健康草鱼的胸腺、头肾和脾脏表达最高,而在鳃、胃和心脏中的表达量最低。     

马氏珠母贝PmFAMeT基因的克隆及表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。     

荷那龙罗非鱼两种GHSR基因的克隆与序列分析

用RT-PCR和RACE方法,从荷那龙罗非鱼(Oreochromis hornorum)垂体中克隆到生长激素促分泌素受体(GHSR)cDNA全序列。荷那龙罗非鱼GHSR基因具有GHSR-1a与GHSR-1b两个高度保守cDNA序列。GHSR-1a序列全长1 646 bp,包括225 bp的5′非编码区,266 bp的3′非编码区和1 155 bp的开放阅读框,编码384个氨基酸残基,具有7个跨膜结构域结构(transmembrane domains,TM);GHSR-1b序列全长1 877 bp,包括225 bp的5′非编码区,755 bp的3′非编码区和897 bp的开放阅读框,编码298个氨基酸残基,只具有前5个TM,在第6个TM的第4个氨基酸处开始缺失。将GHSR cDNA序列与基因组序列比较发现,这两种cDNA转录本来自同一个基因的不同变体。