深海沉积物宏基因组文库构建及淀粉酶筛选

深海环境通常具有高盐,高压,高/低温,无光照等特点,使得海洋微生物存在一套独特的生理代谢机制和分子细胞结构,然而迄今绝大部分深海微生物不能在实验室条件下被分离培养,深海微生物资源开发遇到很大挑战。本研究通过不依赖培养的方法研究海洋微生物的基因资源,构建了南海深海沉积物fosmid宏基因组文库,共获得约39 600个克隆,插入片段范围在24~45 kb之间,平均插入片段大小为33 kb,克隆片段的总库容达到1 320 Mb。通过功能筛选获得3个具有淀粉酶活性的克隆子,选取其中最适温度较低的amy7作为进一步研究对象。构建amy7插入片段的重组质粒文库,获得一个同样有淀粉酶活性的克隆子amy7-6。经测序,克隆子amy7-6含有3 291 bp插入片段,序列比对分析后发现其中一个大小为1 920 bp的ORF,其编码的蛋白质序列(AmyS)与各种来源的糖苷酶有着较高的相似性。     

以宏基因组技术探讨渤海秋冬季节病毒多样性

为研究渤海海域病毒群落总体状况,本文以渤海的B47站表层海水为代表,对两个时间点(2010年9月,2011年12月)的病毒宏基因组做出全面分析。采集海水样品后过滤并经过切相流系统浓缩,提取DNA测序,再进行生物信息学分析,包括病毒组的种群分类、功能基因分析、系统进化分析等。分析结果指明,这两个时间点的病毒群落均由双链DNA病毒(97.75%,scaffold百分比)占据优势地位,其中尤以有尾噬菌体(80.86%,scaffold百分比)居多。按宿主区分,最大的一类病毒为聚球藻噬藻体(10.29%,scaffold百分比)。渤海病毒群落最为丰富的功能基因为复制、结合和修复基因,且冬季(33.77%,ORF百分比)大于秋季(16.39%,ORF百分比)。结果表明:在渤海病毒组中,(1)存在理论上只出现在亚热带海域的原绿球藻噬藻体;(2)物种组成、物种多样性、功能基因比例呈现季节变化;(3)相比远洋病毒组有一定独特性;(4)可能存在未知的T4-like病毒分支。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲虾繁殖期水体微生物多样性

为了揭示凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)繁殖期亲虾养殖水体的微生物多样性,我们比较了雌雄虾养殖水体细菌群落结构差异,采用Illumina HiSeq高通量测序方法对凡纳滨对虾亲虾养殖水体细菌的16S rRNA基因的两个高变区(V3-V4)进行测序分析,并进行了α-多样性指数和β-多样性指数分析。结果表明:雌雄虾养殖水体细菌群落的α-多样性指数中Chao1,ACE和Goods-coverage指数无显著差异(P0.05),而Observed-species,Shannon和Simpson指数有显著性差异(P0.05)。主坐标分析和聚类热图分析表明雌雄虾养殖水体的细菌群落结构不同,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为两者共同的优势菌门,但其相对丰度有一定差异,在雄虾养殖池水体中相对丰度分别为76.15%和21.28%;在雌虾养殖池水体中相对丰度分别为66.01%和29.02%。两者的核心微生物群(属水平)明显不同,雄虾养殖水体的核心属主要包括Glaciecola、Octadecabacter、Methylobacterium、Psychroserpens、Olleya;雌虾养殖水体的核心属主要包括Pseudomonas、Polaribacter、Pseudoalteromonas、Vibrio、Arcobacter、Synechococcus、Hyphomonas、Paracoccus、HTCC、Thalassomonas、Thalassobius、Owenweeksia等,其中包括了Vibrio、Pseudomonas和Owenweeksia等病原相关菌类。该实验结果对凡纳滨对虾育苗阶段亲虾的健康管理、病害诊断及防治具有重要意义。     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆CAPRO2的筛选及酶学性质分析

利用选择性筛选培养基从所构建的深海沉积物宏基因组文库中筛选得到一株产蛋白酶的克隆（CAPR0002）,对其进行了酶学性质分析．结果表明该酶的最适作用温度为65cc,最适作用pH值为9．0．该蛋白酶具有较好的热稳定性,在40cC以下的温度中可长期保持稳定,在50℃中处理6h后仍能保持60％的活力,在60℃下保温30rain后仍能保持约60％的活力．Ca^2＋、Mg^2＋、sr^2＋、co^2＋对该蛋白酶有明显的促进作用,而且ca^2＋的存在可明显提高该蛋白酶的热稳定性,ca^2＋、sr^2＋、c0^2＋这3种离子均在3．0mmol／dm^3。浓度时具有最高的促进作用,当浓度高于3．0mmol／dm’时,这3种离子对酶活力的促进作用减弱．Hg^2＋、Fe^2＋、cu¨对酶有明显的抑制作用．CAPR02蛋白酶在pH值为7。5～9．5时活力较高,pH值为7。5时可保持约80％的活力,pH值为9．5时保持60％的活力,而在pH值高于9．5的条件下酶活力下降较快,pH值为10．0时活力降为约15％,表明CAPR02属于碱性蛋白酶．丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、E一64和AEBSF对CAPR02蛋白酶均无抑制作用,显示该酶不属于丝氨酸蛋白酶,而EDTA对酶有明显的抑制作用,表明该酶属于金属蛋白酶．     

基于转录组数据的凡纳滨对虾微卫星标记开发

对虾遗传多样性和育种研究需要大量的分子标记。作者利用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序数据,采用MISA软件进行微卫星序列挖掘,共获得14 767条微卫星序列。统计发现在凡纳滨对虾中微卫星出现的频率为16.76%;在所有的微卫星序列中,2碱基微卫星最多,占59.53%;其次是3碱基微卫星,占35.78%。随机选取其中74条序列设计引物,通过DNA混池扩增和分型的方法进行微卫星标记的开发,PCR扩增的显示有54对(72.97%)能扩增出清晰的目的条带,进一步分型的结果显示27条(36.49%)微卫星显示出多态性,从这些多态性的微卫星位点中选择11个位点在"科海1号"种质库材料中进行个体分型,结果显示在该群体中微卫星标记的等位基因数目为2~11个不等,期望杂合度值为0.256~0.858,观察杂合度为0.213~0.875,多态性信息含量为0.221~0.830,在11个位点中有4个位点显著偏离HWE(P0.05)。本研究结果为后续使用微卫星标记进行对虾遗传学研究,促进对虾的遗传选育和种质资源保护提供了重要基础。     

植物乳杆菌对凡纳滨对虾致病菌抑制及其对肠道菌群结构的影响

本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为对象,通过琼脂扩散法、荧光染色法与分光光度法筛选出对凡纳滨对虾致病菌有抑制作用、对对虾肠黏液有黏附作用且对盐度有耐受性的3株菌(YRL45、KTP(C-2)、QL),经16S rDNA测序比对发现此3株菌均为植物乳杆菌。将其混合饲喂凡纳滨对虾4周,通过高通量测序研究虾肠道菌群变化。研究表明,混合植物乳杆菌的饲喂对凡纳滨对虾肠道菌群的α多样性无显著性影响,变形菌门和拟杆菌门为凡纳滨对虾肠道优势菌门,植物乳杆菌对凡纳滨对虾肠道中放线菌门的丰度有一定的提高。通过LEfSe分析,发现植物乳杆菌处理组中潜在致病菌发光杆菌属减少,而属于光合细菌的赤杆菌属有所增加。研究结果为益生菌在凡纳滨对虾的应用提供了一定的理论指导。     

中国对虾成虾肠道微生物区系

对野生健康中国对虾成虾肠道微生物区系进行了研究.从其肠道中分离出47株菌,它们分别属于弧菌属、发光杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属8个属.其中弧菌属和发光杆菌属在整个肠道中为优势菌属,不动杆菌属和假单胞菌属为次优势菌属,黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属为非优势菌属.在对虾的整个肠道中,前肠和中肠的优势菌属为弧菌属,而后肠的优势菌属为发光杆菌属.在弧菌属中溶藻胶弧菌、漂浮弧菌和坎贝氏弧菌为优势菌,哈唯氏弧菌为非优势菌.前肠、中肠和后肠的菌量分别为1.3×105、2.8×105和1.1×104cfu/虾体.     

凡纳滨对虾大量EST的生物信息学分析

凡纳滨对虾是我国乃至世界最重要的对虾养殖种。EST(expressed sequence tags)测序是对没有基因组背景的生物进行功能基因分析最为有效的方法之一。为了研究凡纳滨对虾重要功能基因、以及为筛选分子标记奠定基础,本文集成了一套快速高效的EST信息深度挖掘的方法,并对公共数据库中161 241条凡纳滨对虾EST序列进行分析,获得了20 410 条unigenes,包括14 236条contigs和6 174条singlets。通过与NR数据库比对发现有注释的基因7 984条,并对其余12 426条未知基因中的4 702条进行了功能域注释。对有NR注释的基因的GO 分类分析获得其中2 715条基因的生物学过程、细胞定位和分子功能分类信息。此外,通过与模式生物通路图进行比对和定位,将3738条基因定位到270个KEGG通路图中,发现凡纳滨对虾的9条unigenes与果蝇丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的5个关键基因对应,提示凡纳滨对虾很可能存在类似的重要信号转导通路。另外,通过对6种组织,包括肝胰腺、淋巴器官、血细胞、鳃、眼柄和神经的EST进行比较分析,筛选获得了组织特异性转录本共7 000余条,并对这些特异性转录本进行了功能分类。本研究不仅开发了公共基因资源发掘的方法,也为对虾功能基因的研究利用提供了重要参考数据。     

凡纳滨对虾生长性状的双列杂交分析

以来源于两个不同遗传背景群体的凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei为亲本,设置PP(P♀×P♂)、PH(P♀×H♂)、HP(H♀×P♂)、HH(H♀×H♂) 4个实验组(P代表进口群体,H代表选育群体),进行进口个体(P♂和P♀)与选育个体(H♂和H♀)间的双列杂交实验,分析比较其子一代的生长与存活情况.结果发现,对虾存活由高到低顺序为HH>HP>PH>PP,PH实验组表现出明显的存活杂种优势,其育苗期间的杂种优势平均值为(27.72±11.88)%,下塘90d后成活率的杂种优势为30.50%.在生长前期(30日龄以前)对虾平均体长和体重的顺序是HP>PH>HH>PP,而在生长后期则为PP>HP>PH>HH.HP实验组在整个养成期(10、30、60和90d)均表现出体长和体重上的杂种优势,杂种优势值分别为24.00%、13.71%、2.55%、2.79%和112.46%、54.06%、8.16%、12.48%.结果表明,选育群体为母本、进口群体为父本的对虾杂交后代的生长和存活性状明显提高.     

不同模式凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘沉积物酶活性及其微生物群落结构分析

采用现场测定、磷脂脂肪酸(PLFA)法及基质脱氢酶活性测定等方法,对4种不同养殖模式的凡纳滨对虾池塘的水质、沉积物酶活性及微生物群落结构进行了分析和研究。结果表明:养殖末期,凡纳滨对虾淡水混养和海水混养池塘水质较好,海水集约化池塘水质最差;其中海水集约化池塘沉积物基质中有机质含量、微生物生物量、微生物活性和酶活性都很高,真菌、G+菌的相对含量则很低。主成分分析(PCA)表明:第一主成分主要与脲酶、有机质含量、微生物活性、总PLFA、B/F有显著的正相关关系(r>0.9),而与Gram+/Gram-、pH、18:1ω9C/T、单不饱和/支链却存在显著的负相关关系(r>0.9);第二主成分主要与脱氢酶有显著正相关关系(r>0.8),四种池塘在PCA图中分散开,说明其微生物群落结构及环境状况存在明显差异。     

凡纳滨对虾人工授精的初步研究

以未交配的成熟雌性亲虾和脱落精荚为实验材料，采用不同精荚破裂处理、不同基础液释出精子、不同保存时间的脱落精荚和不同授精密度进行凡纳滨对虾的人工授精实验。实验结果表明，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）脱落精荚的精子在生理功能上是成熟的，可以使卵子受精，受精卵发育正常并孵出无节幼体。网搓法进行精荚破裂处理对精子损伤较少，人工授精的效果比研磨法好；用生理盐水作为基础液释出精子进行人工授精的效果比海水略好；精荚冷冻保存时间越长，其人工受精的效果越差；凡纳滨对虾的精子不具鞭毛，没有运动能力，人工授精的卵子受精率很大程度上取决于精子在水中的密度，增加精子密度可获得较高的无节幼体产量。     

凡纳滨对虾净肉质量的影响因素分析

选择5月龄凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)1 200尾,测定净肉质量、去头质量、全长、体长、第一腹节背高、第三腹节背高、第一腹节背宽和头胸甲长共8个性状,采用相关分析和通径分析的方法,计算了以形态性状和去头质量为自变量对净肉质量作依变量的通径系数、决定系数及相关指数,定量地分析了形态性状和去头质量对净肉质量的影响效果。研究表明,凡纳滨对虾6个形态性状和去头质量与净肉质量的相关系数除头胸甲长外均达到极显著水平(P<0.01);所选性状与净肉质量的复相关指数R2=0.958;多元回归分析建立了去头质量、全长、头胸甲长对净肉质量的回归方程,为对虾的良种选育提供了理论依据。     

凡纳滨对虾4种血蓝蛋白亚型的特征分析

血蓝蛋白是对虾体内的氧运输蛋白,占血浆中蛋白含量的95%以上.研究表明,它参与了许多生理功能,包括蛋白储运,渗透压调节,蜕皮过程以及骨架形成等等.近年来的研究表明,血蓝蛋白还参与了对虾的先天性免疫反应,具有酚氧化酶,抗菌肽、抗病毒等相关生物活性.本研究从凡纳滨对虾中克隆获得了血蓝蛋白L亚基LvHcL,并对其基因组织结构进行了分析.该基因具有丰富的多态性,含有多个SNP位点.研究中发现该基因亚基至少存在4种亚型,其中一种亚型缺失第二个外显子,仅含有2个外显子.对各个亚型的转录水平分析表明,抗病对虾在病毒感染刺激下,各个亚型的转录水平均会被诱导提高.而普通对虾在病毒感染刺激下,各个亚型的转录水平则被抑制.研究结果表明,血蓝蛋白参与了对虾的抗病毒免疫反应.这些结果不仅有助于深入了解对虾血蓝蛋白的免疫学特点,也有助于促进对无脊椎动物抗病毒免疫机制的认识.     

凡纳滨对虾ATF 2分子克隆及表达特征分析

激活转录因子-2(ATF-2)作为细胞内应激活化蛋白激酶下游效应分子,参与调控了生物体诸如细胞增殖、凋亡以及免疫炎症反应等许多细胞生物学过程.本研究首次从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中克隆得到了ATF-2基因全长编码序列,命名为Lv ATF-2.序列分析表明,Lv ATF-2基因开放阅读框长1 719 bp,可编码572个氨基酸.其编码的蛋白具有特征性的锌指结构和碱性亮氨酸拉链结构域,并且在N端具有两个保守的苏氨酸磷酸化位点(Thr71和Thr73).进一步的系统进化树分析显示,Lv ATF-2蛋白与脊椎动物及软体动物ATF-2蛋白聚为一簇,且与软体动物ATF-2蛋白亲缘关系更近.半定量RT-PCR结果显示,Lv ATF-2基因在所检测的各个组织中均有转录,但在鳃和肠道中转录量较高.此外Lv ATF-2基因在白斑综合症病毒(WSSV)感染早期转录水平显著下降,提示该基因与WSSV感染密切相关,可能参与了对虾应答病毒的免疫反应过程.本文通对Lv ATF-2基因的克隆与表达特征分析,为将来研究该基因在对虾免疫应答过程中的功能提供了依据.     

凡纳滨对虾P23蛋白基因的筛选、表达和生物信息学分析

克隆凡纳滨对虾极端体重个体的组织差异表达基因P23基因并进行生物信息学分析, 为进一步研究该基因的功能以及凡纳滨对虾的分子选育等研究提供信息。以凡纳滨对虾雌虾极端体重个体腹部肌肉为实验材料, 利用抑制消减杂交(SSH)技术构建极大体重雌性个体和极小体重雌性个体腹部肌肉组织正反向消减cDNA文库:正库(以极大体重个体为试验组, 以极小体重个体为驱动组, L-S)和反库(以极小体重个体为试验组, 以极大体重个体为驱动组, S-L)消减cDNA文库, 并采用实时定量技术分析P23基因的组织表达规律, 利用生物信息学对其功能和结构进行预测。以β-actin为看家基因检测两个文库的消减效率分别为210和25, 实时定量技术分析结果表明P23基因在体重的调节中起上调作用。P23基因编码区序列全长495bp, 编码165个氨基酸, GenBank登录号:JF806619。生物信息学分析发现P23蛋白部分序列含有强疏水性, 无跨膜螺旋结构, 两种信号肽预测都显示P23含有信号肽。     

饥饿胁迫下凡纳滨对虾能源物质的消耗

通过对饥饿2,4和6 d再恢复投喂12 d的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体成分组成的分析,了解饥饿期间能源物质消耗的特点。饥饿状态下,凡纳滨对虾干物质、脂肪、碳水化合物质量分数和能值下降,灰分质量分数增加,蛋白质质量分数无明显变化;饥饿6 d,虾体脂肪消耗程度几乎达到其脂肪总质量分数的50%,蛋白质的消耗量仅占其蛋白质总质量分数的14.8%,但蛋白质消耗量是脂肪的5.5倍;恢复投喂12 d后,虾体生化组成均恢复到对照组水平。分析认为,在饥饿过程中,蛋白质、碳水化合物和脂肪三种能量物质均被消耗,其中脂肪是被优先利用的能源物质,而蛋白质是主要的供能物质。     

凡纳滨对虾的遗传育种研究现状

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei Boone),由于其生长快,抗环境变化能力强,对饵料的要求低,肉味鲜美、出肉率高,成为世界上公认的优良养殖对虾品种之一.凡纳滨对虾自1998年从美国夏威夷再次引进到中国华南,并相继突破集约化防病养殖和全人工繁育技术以来[1],已成为中国海水养殖动物中发展最快的一个种类,其养殖产量已达到中国养殖对虾产量的80%～90%.然而目前中国凡纳滨对虾亲虾多数直接从虾塘挑选,造成品质参差不齐,抗病力下降,生产周期延长,严重制约了中国凡纳滨对虾养殖业持续健康发展.凡纳滨对虾亟需形成稳定优良的养殖品系.     

凡纳滨对虾血清凝集素、溶血素的特性研究

对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的血清凝集素和溶血素部分特性的研究结果表明,凡纳滨对虾血清凝集素热稳定性较差,温度高于50℃时,活性呈明显减弱至无活性,其最适温度为25~45℃;最适pH为8~9;盐度为24~48时,凝集活性最强,当盐度超过48或者低于6时,凝集活性较差;凝集素活性能被浓度高于16 mmol/L(包括16 mmol/L)EDTA-Na2,D-葡萄糖,D-果糖及D-半乳糖完全抑制。Cu2 使凝集素的活性完全丧失,而Ca2 和Mg2 能使凝集活性明显增强。45~60℃时,溶血素活性逐渐增强,60℃时达到最高;当pH 6~9时,溶血素的活性较强;盐度为18~36时,能增强溶血素的活性;EDTA-Na2对溶血素的活性几乎无影响;Cu2 使溶血素丧失活性,Mg2 能增强溶血活性,Mn2 对溶血素的活性没有影响,而Ca2 和Ba2 对溶血素有轻微的抑制作用。     

凡纳滨对虾类Ig定性和定位的初步研究

以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象,运用Western—blotting和免疫组织化学等现代免疫学方法,对对虾中的类Ig（immunoglobulin,免疫球蛋白）蛋白进行定性和定位研究。结果发现,虾血清中有两种分子质量约为70ku和62ku的蛋白可与抗人Ig发生特异性的结合。同时,虾血细胞——无颗粒细胞的外膜及虾类淋巴器、肝胰脏、心脏、胃和肠等5种组织器官的石蜡切片与抗人Ig反应呈不同程度的阳性,其中类淋巴器和肝胰脏显色较深。提示,虾体内确实存在能与抗人Ig发生特异性结合的类Ig蛋白,其不仅存在于虾血清中,还存在于无颗粒细胞、类淋巴器和肝胰脏等组织中,为对虾的免疫系统的研究和疾病的防治奠定基础。     

光照对凡纳滨对虾幼体变态发育的影响

为了解光照对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体发育和存活率的影响,作者在研究中设定了4种单色光(红、黄、蓝、绿光)及不同光照强度(0、1 500、5 500、12 000 lx)进行实验并就光照对幼体产生的影响进行分析。实验表明:4种单色光对幼体发育变态时间和成活率都有较大影响。幼体从ZⅠ变态发育至仔虾P1,蓝光的幼体发育时间最长,为262.83 h,比对照组多28 h;黄光存活率最低,只有14.49%,比对照组低25.00%,差异显著(P0.05)。同时,凡纳滨对虾幼体在不同的发育阶段对不同光色的敏感度不同,红光和黄光只对溞状幼体变态有较明显的抑制作用,但对糠虾幼体的发育却有促进作用;蓝光和绿光对整个发育阶段都有影响。光照强度对幼体的存活和变态影响差异显著(P0.05)。幼体从ZⅠ发育至P1,12 000 lx光照下幼体变态发育耗时最长(257.33 h),存活率最低(1.63%)。在溞状幼体期,光照大于1 500 lx时,幼体的变态时间增加,存活率下降。糠虾幼体期可适应光照在5 500 lx以下的环境,而仔虾期则可适应120 000 lx的光照。建议根据不同发育阶段调整光照强度,当幼体在ZⅠ时,光强应控制在1 500 lx以下,之后可逐渐增强。本实验结果可为凡纳滨对虾育苗期间的光照管理提供基础数据和理论依据。