三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP4C基因的cDNA克隆及表达分析

采用RT-PCR及Smart-TM Race技术,首次获得三疣梭子蟹CYP4C基因cDNA全长序列。该基因全长1888bp,编码一个由514个氨基酸组成的多肽,预测分子量大小为59.54kDa,理论等电点为8.08。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹CYP4C基因与岸蟹、凡纳滨对虾、日本沼虾、中国对虾、沟虾、红螯螯虾的同源性分别为88%、72%、66%、59%、60%、59%。荧光定量RT-PCR结果表明,CYP4C在肝胰腺、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。高盐(45)胁迫后,三疣梭子蟹CYP4C的表达量显著高于对照组,随着胁迫时间的延长出现逐渐降低的趋势,在胁迫48h后表达量达到对照组水平;低盐(11)胁迫条件下,CYP4C的表达水平随着胁迫时间的延长呈现逐渐下降的趋势,且从胁迫6h开始显著低于对照组。研究推测,CYP4C基因参与三疣梭子蟹盐度适应调节,是蜕皮机制的调控因子之一。     

三疣梭子蟹CYP4C基因的cDNA克隆及表达分析

采用RT-PCR及Smart-TM Race技术,首次获得三疣梭子蟹CYP4C基因cDNA全长序列。该基因全长1888bp,编码一个由514个氨基酸组成的多肽,预测分子量大小为59.54kDa,理论等电点为8.08。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列（ExxR）和血红素结合区（FxxGxxxCxG）。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹CYP4C基因与岸蟹、凡纳滨对虾、日本沼虾、中国对虾、沟虾、红螯螯虾的同源性分别为88%、72%、66%、59%、60%、59%。荧光定量RT-PCR结果表明,CYP4C在肝胰腺、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。高盐（45）胁迫后,三疣梭子蟹CYP4C的表达量显著高于对照组,随着胁迫时间的延长出现逐渐降低的趋势,在胁迫48h后表达量达到对照组水平;低盐（11）胁迫条件下,CYP4C的表达水平随着胁迫时间的延长呈现逐渐下降的趋势,且从胁迫6h开始显著低于对照组。研究推测,CYP4C基因参与三疣梭子蟹盐度适应调节,是蜕皮机制的调控因子之一。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌雄性腺的差异转录组分析

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我国东海海域具有重要经济价值的蟹类。为探讨雌雄梭子蟹性腺基因表达差异,挖掘与性腺发育相关基因,利用高通量测序技术对三疣梭子蟹雌雄性腺进行测序和生物信息学分析,为进一步研究其性腺发育及性别分化机制提供基础。测序结果经denovo组装共获得192848个转录本,130054个unigene。差异表达分析发现,其中101742个unigene上调,37588个unigene下调。在差异表达数据库中筛选出EcR、RXR、VTG等6个可能参与三疣梭子蟹的性腺分化发育的基因,并利用荧光定量PCR验证其在雌雄性腺中的表达情况,验证结果与转录组测序结果基本一致,为深入研究三疣梭子蟹性腺分化发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析

采用构建三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的方法克隆了一个新型抗菌肽基因Pthyastatin,并用荧光定量RT-PCR方法,进行Pthyastatin的表达研究。结果表明,Pthyastatin前体由16个氨基酸残基的信号肽和成熟肽两部分组成,其中Pthyastatin成熟肽有两个结构域:N端的富含Pro/Arg结构域和C端的包含6个保守Cys残基与对虾抗菌肽penaeidins同源的结构域,表明Pthyastatin属于对虾抗菌肽penaeidins家族;荧光定量RT-PCR分析结果表明Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达;致病菌副溶血弧菌诱导后Pthyastatin在血细胞中表达先下调、后上调,在诱导后24h表达量又基本恢复到诱导前水平,支持Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达的观点,但致病菌诱导后表达变化机制不明。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体重遗传力的估计

应用数量遗传学原理和全同胞组内相关法估计了三疣梭子蟹80日龄和120日龄体重的遗传力。实验中的400只亲蟹均来自人工养殖的选育群体。通过群体间杂交,构建了37个全同胞家系包括13个半同胞家系,分别测定了80日龄和120日龄时大约30个个体的体重。利用SPSS软件的一般线性模型(GL.M)过程,计算表型变量的方差组分,估计体重性状的遗传力。结果表明,三疣梭子蟹80日龄和120日龄体重的遗传力估计值分别在0.42—0.64和0.25—0.39之间。雌性遗传方差组分均显著大于雄性遗传方差组分,说明雌性遗传方差组分存在显著的母性效应。经过t检验,父系半同胞、母系半同胞方差组分估计的遗传力均未达到显著水平,全同胞方差组分估计的遗传力达到极显著水平。因此可以认为基于全同胞方差组分估计的遗传力是对三疣梭子蟹两个发育阶段狭义遗传力的无偏估计值,估计值分别为0.53和0.35。说明三疣梭子蟹体重属于中度遗传力,对其选择育种具有较大的潜力。     

中国三疣梭子蟹Portunus trituberculatus Miers的研究

本文概述了国内有关三疣梭子蟹形态、习性、繁殖、发育、生长、种群、生理、成分和养殖等方面的研究现状，探讨了关于三疣梭子蟹研究的发展方向。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)FABP基因克隆及其在卵巢发育过程中的表达特征研究

脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)是胞内脂质结合蛋白超家族成员,在长链脂肪酸的摄取、转运及代谢调节中发挥重要作用。本研究采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)脂肪酸结合蛋白基因(简称Pt FABP)c DNA全长,并采用实时荧光定量PCR技术测定了FABP基因在三疣梭子蟹不同组织和不同发育阶段卵巢中的表达情况,探讨了Pt FABP在卵巢发育过程中的作用。Pt FABP基因全长893bp,包括289bp的5’UTR,405bp的ORF和199bp的3’UTR。该基因编码长度为134个氨基酸的多肽,其理论p I为5.92,分子量为15.13k Da。Pt FABP氨基酸序列与中华绒螯蟹同源性最高(72%),且有一个Lipocalin结构域。q PCR的结果表明:FABP在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量最高,肝胰腺、眼柄中表达量中等,心脏、鳃、肌肉和血淋巴细胞中的表达较低。在卵巢发育过程中Pt FABP的表达量呈现先上升后下降的趋势,卵巢发育至近成熟期(Ⅳ期)时达到最高值,而在成熟排卵后不断降低。这与三疣梭子蟹卵巢发育伴随着脂类大量积累相关。因此上述研究结果表明,FABP可能参与调控三疣梭子蟹卵巢的发育,并且为后期胚胎的发育储存能量。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)RXR基因克隆及其在蜕皮过程中的表达分析

本研究通过转录组测序和RACE技术克隆了三疣梭子蟹类维甲酸X受体2(PtRXR2)基因cDNA全长(登录号:KF914662),并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明,(1)PtRXR2基因cDNA全长1718bp,包括5’非编码区(5’-UTR)141bp、3’-UTR 209bp和开放阅读框1368bp,编码455个氨基酸,预测分子量和等电点为49.75kDa和6.79。(2)PtRXR2推导氨基酸序列的Blastp结果显示,PtRXR2与已知甲壳动物RXR的一致性为74%—99%,系统进化树分析表明PtRXR2与其它甲壳动物RXR聚为一支。(3)qRT-PCR结果显示PtRXR2在C期三疣梭子蟹Y器官、鳃、眼柄和大颚器中表达水平较高,肝胰腺中的表达水平最低。其它6个组织中的表达水平居中。(4)不同蜕皮阶段,PtRXR2在Y器官、眼柄和胸神经中均是AB期表达水平最高,E期最低,这可能与上述器官的细胞增殖主要发生在AB期有关;肌肉中的PtRXR2表达水平在AB和C期较高,E和D期最低,与肌肉的生长和营养物质积累主要发生在这两个阶段相对应;肝胰腺中的PtRXR2表达水平在AB期最高,C期最低,这暗示PtRXR2主要参与肝胰腺中的上皮细胞增殖和分化,对于C期的营养代谢调控可能不起关键作用。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)foxl2基因功能初探及相关miRNA分析

foxl2在脊椎动物卵巢分化、发育和功能维持等方面具有重要作用,然而其在三疣梭子蟹(Por-tunus trituberculatus)卵巢发育中的功能尚不明确.本研究首先克隆了三疣梭子蟹foxl2(Ptfoxl2)基因cDNA全长序列,该基因5′和3′非编码区域(UTR)长度分别为701?bp和211?bp,开放阅读...     

虾蟹混养塘中WSSV对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)致死效应的定量研究

采用实时荧光定量PCR法,在对白斑综合症多发的虾蟹混养塘内三疣梭子蟹体内病毒含量进行定量跟踪检测的基础上,结合电子显微镜及病理切片,对室内经口服、注射两种回感模式处理已感染白斑综合症病毒的濒死三疣梭子蟹体内病毒含量进行实验验证,并观察其体内主要器官组织的病理改变。结果表明,受白斑综合症病毒感染的三疣梭子蟹存活与死亡取决于蟹体内病毒含量,当病毒含量≥109拷贝/ml时均进入濒死或死亡阶段,其主要器官组织均有明显的病理改变。     

三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蜕皮中的表达分析

为了研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE),克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)HMGR基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:KF280756)。该序列全长2575bp,包括一个53bp的5′端非编码区,一个686bp的3′端非编码区和一个长度为1836bp的开放阅读框,编码611个氨基酸。该氨基酸序列与已公布的美洲海鳌虾HMGR氨基酸序列相比一致性达65%,具有Ⅰ型HMGR保守催化区域、两个HMG-Co A结合基序和两个NADP(H)结合基序。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析三疣梭子蟹HMGR基因的组织差异表达及在蜕皮周期中的表达水平变化,结果表明HMGR基因在三疣梭子蟹大颚器(MO)中的表达量最高,在其它组织中表达量均极低;在三疣梭子蟹蜕皮周期中,大颚器中HMGR基因的表达量自A期至D0亚期升至最高,然后下降,至D4亚期最低。验证了大颚器是三疣梭子蟹合成甲基法尼酯的唯一器官,表明HMGR在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要作用。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因克隆及其表达分析

本研究克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因,命名为Pt CLIC。该基因c DNA全长2000bp,5’和3’非编码区(UTR)长分别为76bp和1162bp,开放阅读框长762bp,推测编码253个氨基酸,预测分子量为29.2k Da,理论等电点为5.93。生物信息学分析表明,Pt CLIC基因中未发现跨膜结构域,属于不稳定蛋白;同源性分析表明,Pt CLIC基因编码的氨基酸序列与蚤状溞(Daphnia pulex)CLIC基因的同源性高达83%;系统进化分析表明,三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支;实时荧光定量RT-PCR分析表明,Pt CLIC基因在选取的所有组织中均有表达,在肝胰腺中的相对表达量最高,且显著高于其它组织(P0.05)。低盐度胁迫显著改变了Pt CLIC基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先上调后下调的趋势,并发现该基因在低盐耐受和低盐敏感家系中的表达规律差异显著。研究结果表明Pt CLIC基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用,可辅助三疣梭子蟹耐低盐品系的选育。     

红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因克隆及表达分析

本文利用RACE技术克隆获得红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因全长,并利用生物信息学方法对该基因的m RNA序列特征、氨基酸序列特征、分类及系统发生进行了分析。结果表明,在红鳍笛鲷中,酪氨酸酶相关蛋白1基因含有TYRP1a和TYRP1b两个拷贝,其中TYRP1a序列全长3178bp,开放阅读框(ORF)长1566bp,5?端235bp,3?端1377bp;TYRP1b基因c DNA全长1871bp,ORF区长1656bp,5?端89bp,3?端126bp。序列分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因与其它物种的同源基因保守性较高,尤其是酪氨酸酶基因家族典型的酶活性位点序列在脊椎动物中具有高度保守性。进化分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因的种间同源性高于两个基因间的同源性。荧光定量PCR数据分析表明,TYRP1a和TYRP1b基因都在眼睛部位具有最高表达,TYRP1b在黑色皮肤也有较高表达。结果可为进一步阐述TYRP1基因在红鳍笛鲷身体和眼睛部位的色素合成机制提供一定的理论基础。     

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白基因克隆及Cd~(2+)胁迫下的表达分析

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒和金属元素代谢等生理过程。本研究采用RACE技术,克隆获得了菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白(RpMT)的全长cDNA序列。RpMT的cDNA全长为570bp,编码75个氨基酸,包含15个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构。采用实时荧光定量PCR技术,分析了两种壳色菲律宾蛤仔(白蛤和斑马蛤)RpMT基因在Cd2+暴露后的表达变化。结果发现:Cd2+急性和亚慢性暴露均可导致两种壳色蛤仔消化腺和鳃组织RpMT基因表达量的显著上调;暴露后两种壳色蛤仔鳃组织RpMT基因表达量的增加幅度均高于消化腺组织,且以白蛤鳃组织基因表达水平的上调幅度较高。上述结果表明,RpMT可能在菲律宾蛤仔抵御Cd2+胁迫过程中发挥了重要作用。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢发育中的表达分析

VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。     

圆斑星鲽(Verasper variegatus)wtl基因的克隆与表达分析

圆斑星鲽（Verasper variegatus）雌鱼生长快,成熟雌鱼个体大小是雄鱼的2倍以上,开展性别相关基因的功能研究,对于探究圆斑星鲽性别决定机制,建立单性培育技术具有重要意义。本研究获得了wt1a及wt1b两个同源基因,wt1a基因全长为3263bp,预测开放阅读框（ORF）长为1245bp,编码415个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长372bp和1640bp;wt1b基因全长为2312bp,预测开放阅读框（ORF）长为1281bp,编码427个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长369bp和659bp。wt1a基因编码氨基酸分子量为46.2kDa,理论等电点为9.24,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,编码KTS三肽;wt1b基因编码氨基酸分子量为46.95kDa,理论等电点为8.99,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,并且编码KTS三肽。基因表达结果表明：wt1a和wt1b基因主要在圆斑星鲽性腺中表达,精巢的表达高于卵巢,肾脏的表达量显著高于其他组织,推测wt1a基因和wt1b基因在性腺和肾脏发育过程及功能方面均发挥重要作用;在早期发育阶段,wt1a基因在原肠期之前微弱表达,从原肠早期开始逐渐上升至神经胚期表达量达到最高,之后逐渐下降,直至孵化阶段,推测wt1a基因在圆斑星鲽原始生殖细胞分化过程及性腺发育中发挥重要作用。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因克隆鉴定及在低盐胁迫和蜕皮周期中的表达分析

几丁质酶在甲壳动物中参与多个生物学进程,发挥重要作用。本研究采用RACE技术,克隆获得总长为3694 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶基因全长c DNA序列,命名为Pt Cht基因。该基因5′和3′非编码区分别为200bp和455bp,开放阅读框为3039bp,推测编码1012个氨基酸,预测分子量为113.4k Da,理论等电点为6.289。生物信息学分析表明,Pt Cht基因含有2个催化结构域和1个几丁质结合结构域Cht BD2,催化结构域具有几丁质酶第18家族的保守基序MotifⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹Pt Cht基因与亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)Cht的同源性最高;荧光定量RT-PCR分析表明,Pt Cht基因在各组织中均有表达,而在眼柄和表皮中的相对表达量较高。Pt Cht基因在蜕皮周期中的表达规律表明,Pt Cht基因在不同蜕皮时期存在明显变化,在表皮中先下调后上调;在眼柄中,呈整体上调趋势。通过分析Pt Cht基因在低盐胁迫进程中的表达规律发现,低盐胁迫可显著改变Pt Cht基因在鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降的表达趋势。该研究结果表明Pt Cht基因在三疣梭子蟹蜕皮发育和渗透压调节中发挥重要作用,为深入研究三疣梭子蟹和其它甲壳动物几丁质酶的功能提供了重要信息。     

栉孔扇贝BI-1基因的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR和RACE技术首次获得了栉孔扇贝(Chlamys farreri)BI-1基因(Cf BI-1)c DNA全长序列,长度957bp,5′和3′非编码区长度分别为48bp和195bp,开放阅读框为714bp,预测编码一个含有237个氨基酸的蛋白质,分子量为27k Da;结构预测显示,Cf BI-1蛋白包含6个跨膜结构域。同源和分子进化聚类分析显示,Cf BI-1蛋白序列与其他一些物种中的BI-1蛋白序列相似性很高,表明BI-1具有很高的保守性。通过荧光定量PCR的方法检测了Cf BI-1 m RNA在栉孔扇贝正常组织中和在干露、脂多糖以及扇贝急性病毒性坏死症病毒刺激之后的表达水平的变化。结果表明,Cf BI-1在栉孔扇贝各组织中广泛分布,其中闭壳肌中的表达量最高,血淋巴中的表达量最低。在干露和病毒刺激以后,Cf BI-1基因表达水平较对照组都有显著上调(P0.05),表明Cf BI-1基因可能参与了干露刺激和急性病毒性坏死症病毒感染后的细胞应激响应及其诱导的细胞凋亡过程。综合上述分析,我们认为Cf BI-1基因在栉孔扇贝细胞凋亡调控过程中可能起到重要作用,可为栉孔扇贝凋亡相关基础研究提供参考。