马氏珠母贝家系的生长比较

采用单对配对方法建立马氏珠母贝Pinctada martensii第一代家系7个,对家系间的生长和家系内大小变异进行了分析比较。7个家系的壳高大小顺序为F15>F20>F18>F19>F12>F17>F21,总重大小顺序为F15>F18>F19>F20>F12>F17>F21。在同批家系中,F15的壳高、总重显著大于其它2个家系(F12、F17)(p<0.05),其壳高比F12大11.64%,比F17大16.01%;其总重比F12重27.40%,比F17重38.98%,而且其个体大小变异较小,表现出明显的生长优势,是一个生长性状优良的家系。F18在壳高和总体重上比F19大2.88%和19.49%。F20显著大于F21(p<0.05),壳高比F21大19.49%,总重大53.72%,该家系生长较快,可通过进一步的选择培育成一个生长快、个体大的家系。     

马氏珠母贝微卫星快速分离及遗传多样性分析

马氏珠母贝(Pinctada martensii Dunker)又称合浦珠母贝,是世界上用于生产海水珍珠的最主要贝类之一.自60年代我国成功地开展马氏珠母贝的人工育苗以来,海水珍珠养殖业发展迅速,至20世纪90年代,海水珍珠养殖已成为广东、广西和海南沿海部分地区的支柱产业,海水珍珠成为出口创汇的重要产品.海水珍珠产业的发展仅靠采捕天然野生的亲贝已不能满足生产的需要,越来越多地用人工养殖的亲贝进行人工繁殖.而采用少数亲贝(尤其是养殖亲贝)的育苗导致近亲繁殖,使马氏珠母贝种质资源出现了退化,在海水珍珠养殖上产生的直接后果是珍珠的质量和产量(单产)明显下降.     

马氏珠母贝生长性状的相关分析

对马氏珠母贝(Pinctadamartensi)不同生长时期的壳长、壳高、壳宽和活体质量进行了一年多的跟踪测量。分析表明,在不同生长时期,其4个性状的两两间的相关系数均达到极显著水平(P<0.01),但其相关系数大小排列顺序存在差异,8次测量的平均相关系数大小依次为壳高-壳长>壳宽-体质量>壳高-体质量>壳长-体质量>壳长-壳宽>壳高-壳宽。在不同生长时期,活体质量对壳高、壳宽的偏回归系数均极显著(P<0.01),而对壳长的偏回归系数在第1,3,7,15个月时不显著(P>0.05)。该研究的结果可为珍珠贝的选育种的重要目标性状的确定提供理论指导。     

马氏珠母贝黄壳色家系的生长、壳色分离及总抗氧化能力比较

以马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)黄壳色作为选育指标构建了黄壳家系,对其4个生长性状和黄壳色性状分离比进行了统计分析,并测定了黄壳家系中黄壳、褐壳色个体不同组织中的总抗氧化能力(TAC)。结果发现:黄壳色性状能遗传并发生分离,其分离不完全符合孟德尔遗传分离定律;褐壳色亲本不会产生黄壳色子代,推测褐壳色是纯合子;第一代黄壳家系5、7月龄贝仅壳宽值显著小于褐壳家系(P<0.05),壳高、壳长、总质量差异不显著, 11月龄贝仅壳长和壳宽值显著小于褐壳家系, 14、20月龄贝的壳高、壳长、壳宽、总质量这4个生长性状均极显著小于褐壳家系(P<0.01);在第一代6个黄壳家系内,黄壳、褐壳色个体的4个生长性状差异不显著;黄壳色贝在足、心、性腺中的TAC显著低于褐壳色贝(P<0.05);在鳃、闭壳肌、消化腺组织中TAC高于褐壳色贝,但差异不显著。     

马氏珠母贝SNP标记开发及家系遗传多态性分析

利用13个源自转录组序列的SNP标记对3个马氏珠母贝(Pinctada fucata)家系进行遗传多态性分析及聚类分析。结果显示,家系1#、3#、6#的平均期望杂合度(He)分别为0.307 8、0.318 9和0.382 7;平均观测杂合度(Ho)分别为0.342 2、0.341 0和0.394 2;平均多态信息含量(PIC)分别为0.243 5、0.247 9和0.297 7。结果表明,3个马氏珠母贝家系具低度或中度遗传多态性,为马氏珠母贝内SNP应用于遗传多态性分析等提供了基础。利用SNP标记对3个家系进行聚类分析,发现半同胞家系1#和3#在家系及个体聚类中均先聚在一起,然后再与亲缘关系较远的家系6#聚在一起。新开发的SNP标记能较准确地对家系及个体进行聚类,为SNP标记应用于马氏珠母贝遗传关系分析提供了研究基础。     

马氏珠母贝群体内遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,对一马氏珠母贝养殖群体中个体大和个体小的两个组的遗传多样性进行分析。5个引物在2个组100个样品中共得到72个清晰的扩增位点,其中多态性位点71个,多态位点百分率(PPB)为98.61%。POPGENE分析结果表明:个体大的组的遗传多样性水平高于(PPB=94.44%,I=0.3523,h=0.2181,na=1.9444)小个体组(PPB=80.61%,I=0.3008,h=0.1915,na=1.8056)。两组间的遗传分化系数Gst=0.0948。UPGMA聚类分析表明大个体组内几乎所有的贝(47个)聚在一起,而小个体组的贝(50个)聚成另一支。     

马氏珠母贝选育子一代生长特性研究

通过选择培育获得马氏珠母贝Pinctada martensii大亚湾养殖群体选育子一代(DDS),以大亚湾养殖群体为对照(DDC),在相同条件下进行养殖,对其生长性状进行了约1年的跟踪测量,运用t检验对2个组别主要性状进行了比较。分析表明,经过一代的选育,DDS在壳长、高、宽和总重上均大于DDC,存活率提高9.18%,除壳长在2个时期(2003年12月,2004年2月)差异不显著外(p>0.05),DDC/DDS2个组别其他性状在7个生长时期均具有显著差异(p<0.05)。该研究为进一步通过选择育种培育马氏珠母贝优良品种奠定了基础。     

海洋酸化对马氏珠母贝受精及早期发育的影响

自2010年7月1日至3日,在pH值为8.1、7.7和7.4条件下研究了海洋酸化对马氏珠母贝(Pinctada martensii Dunker)受精及早期发育的影响。结果显示,海洋酸化对不同pH值下马氏珠母贝的受精率无显著影响。pH8.1、pH 7.7和pH 7.4试验组幼虫的壳长、壳高的值逐渐增大,pH 8.1组幼虫的壳长、壳高的值大于同期其他两组的值,且在实验的第24、36、48小时与其他两组同期幼虫的壳长、壳高的值差异显著,这表明海洋酸化显著影响马氏珠母贝幼虫的生长。实验期间,pH 8.1试验组幼虫的存活率和畸形率没有显著变化,而pH 7.7和pH 7.4组幼虫的存活率显著低于pH 8.1组。pH 7.4组幼虫的畸形率显著高于同期pH 8.1和pH 7.7组幼虫的畸形率,表明在海洋酸化的环境中幼虫的发育受到影响。本文将为海洋酸化的相关研究提供基础数据。     

基于FIASCO技术的合浦珠母贝微卫星标记分离与筛选研究

用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了合浦珠母贝Pinctada fucata基因组微卫星标记的分离与筛选研究.合浦珠母贝基因组DNA经限制性内切酶MseI酶切后与接头连接, 用生物素标记的(CA)15探针与其杂交, 然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段, 经PCR扩增后形成双链, 最后进行克隆转化, 构建微卫星富集文库.挑选克隆用探针引物(CA)15 和载体引物进行第2次筛选, 获得阳性克隆357个, 测序结果表明, 297个克隆(83.2%)含有微卫星序列, 包括479个微卫星DNA结构域.其中完美型微卫星有370个(77.3%), 非完美型95个(19.8%), 复合型14个(2.9%).合成引物49对, 有31对(63%)扩增出目的产物, 其中9 对在种群中(n=32)具有扩增多态性, 其多态信息含量PIC值在0.375―0.809之间, 平均为0.536;等位基因数在2―9个之间, 平均为4.889个;观测杂合度介于0.200―0.600之间, 平均为0.415;期望杂合度的变化范围为0.454―0.844, 平均为0.598.表明FIASCO技术适合于合浦珠母贝微卫星标记的分离与筛选.     

马氏珠母贝饥饿补偿生长的初步研究

采取饥饿处理时间不等(3、6、9和12d)、但总持续时间相等的方法研究马氏珠母贝Pinctada martensi (Dunker)稚贝在饥饿处理后的生长和存活.结果表明,S12组(饥饿12d)的存活率最低,恢复期的壳长和体重最小,表明饥饿强度大会对其生长和存活造成较大的影响;饥饿处理后的稚贝都表现出补偿生长现象,S9组(饥饿9d)的特定生长率最高,S3组(饥饿3d)的最低,但饥饿组间的差异不明显,其壳长和体重大小排列为S3>S6>S9>S12,恢复期延长,其生长恢复到正常水平.     

合浦珠母贝基因组微卫星富集文库的构建与分析

采用生物素标记的(AC)_(15)探针和磁珠富集法构建合浦珠母贝(Pinctada fucata)基因组DNA微卫星富集文库。随机挑选2097个克隆进行筛选,得到483个候选克隆(23.03%),对其中135个阳性克隆测序分析发现122个克隆含有微卫星重复单元(90.37%)。进一步通过序列比对,最终得到65个具有特异微卫星序列的阳性克隆(53.28%),其中包含85个微卫星DNA结构域,其中完美型(perfect)70个,占82.36%;非完美型(imperfect)7个,占8.24%;混合型(compound)8个,占9.41%,重复次数主要分布在5~20(95.74%),平均重复次数为7.83,(AC/GT)n重复所占比例最高(75.53%)。基于微卫星两端的侧翼序列,利用Primer Premier 5.0设计引物,获得11对具有多态性的微卫星引物。本研究为开展合浦珠母贝分子育种及资源评价分析提供了基础资料。     

合浦珠母贝3个养殖群体双列杂交F1代的生长和遗传分析

为开展合浦珠母贝(Pinctada fucata)遗传改良和培育优质新品种,作者利用合浦珠母贝北海养殖群体(B)、徐闻养殖群体(X)和三亚养殖群体(S)进行双列杂交,获得3个种群内自繁群体及6个种群间杂交群体。对8月龄F1代的壳长、壳高、壳宽和体质量4个生长性状进行了测定,计算了各组合的一般配合力、特殊配合力及杂种优势。结果表明,杂交组合的各性状值普遍高于自繁群体,其中S(♀)×B(♂)和S(♀)×X(♂)杂交组合的各性状值极显著高于其他组合。三亚群体各性状的一般配合力最大,S(♀)×X(♂)组合各性状特殊配合力最大,其次是S(♀)×B(♂)组合。杂交子一代4个生长指标均表现出一定程度的杂种优势(0.24%~52.62%)。不同杂交组合间和不同性状间的杂种优势存在差异,其中,S(♀)×B(♂)杂交组合杂种优势明显,其反交组合B(♀)×S(♂)杂交优势程度不高,且在壳宽上表现出较低的杂种优势率(0.24%);S(♀)×X(♂)杂交组合杂种优势率比反交组合X(♀)×S(♂)高。体质量的平均杂种优势率均高于其他3个性状。该研究的结果表明杂交群体性状的改进为进一步选育奠定了基础。     

合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS细胞研究中具有重要作用,将它们加入体外培养的细胞中,可以诱导体细胞去分化成为多能干细胞。作者通过RACE-PCR技术从合浦珠母贝(Pinctada fucata)的外套膜组织中克隆获得了3个转录因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全长1585bp,开放阅读框的长度为1131bp,编码376个氨基酸,蛋白结构分析表明它具有保守的HLH和Myc-N结构域。Sox2全长1908bp,开放阅读框长度为990bp,编码329个氨基酸,蛋白结构分析它具有保守的HMG-box和Soxp结构域。KLF4全长2268bp,开放阅读框长624bp,编码207个氨基酸,预测该蛋白具有两个zf-H2C2_2结构域。BLAST分析它们均与太平洋牡蛎的相关蛋白具有较高同源性,说明其与太平洋牡蛎亲缘关系更近。RT-PCR实验发现这3个基因在合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃6种组织中均有表达,表明它们是非常保守的转录因子。本研究对于合浦珠母贝细胞系建立和研究具有启发意义。     

合浦珠母贝转录因子PF-CREB3L2基因的克隆和鉴定

克隆得到了合浦珠母贝(Pinctada fucata)PF-CREB3L2蛋白的c DNA序列,其c DNA全长1 983 bp,其中开放阅读框长度为1 728 bp,编码的蛋白含有575个氨基酸残基。组织表达分布实验发现,其在合浦珠母贝内脏囊中表达量最高,在外套膜和鳃中也有大量表达,推测其广泛参与合浦珠母贝的贝壳形成等生理活动。贝壳损伤修复实验中发现,在合浦珠母贝贝壳受到损伤后,PF-CREB3L2和基质蛋白的表达量会迅速上升,且PF-CREB3L2的峰值出现更早,推测其通过影响基质蛋白转录,参与合浦珠母贝生物矿化的调控过程。PF-CREB3L2与合浦珠母贝基质蛋白表达相关性的分析发现,PF-CREB3L2与Prisilkin39、KRMP的表达量呈现显著的正相关,说明其可能特异性地调控某些基质蛋白的转录。     

中药对合浦珠母贝插核手术伤口愈合效果和珍珠质量的影响

研究了3 种中药对合浦珠母贝(Pinctada fucata)插核手术后体重日增长速度、伤口的愈合效果及其对珍珠质量的影响。试验采用白藜芦醇、芦荟胶和云南白药对插核伤口进行单次处理(插核手术后及时处理)和3 次处理(手术后第5 天和第10 天分别进行第2 次和第3 次处理), 对体质量日增长速度、愈合率和珍珠质量进行统计分析。结果显示, 休养期各组体质量日增长速度变化趋势基本相同, 早期几乎全为负增长(0.06～?0.26 g/d), 第16 天基本恢复正常生长水平, 达到0.54～0.93 g/d, 后期云南白药单次处理组的增长速度最快(1.52 g/d), 显著高于对照组(0.34 g/d)(P<0.05), 但处理次数对体质量增长的影响不大。各试验组愈合率均较高, 10 天时试验组的愈合率达90%以上(90.7%～99.2%), 显著高于对照组(79.8%)(P＜0.05), 其中云南白药处理组的愈合率最高。各处理组的商品珠比例(87%~90%)均较高,但优质珠比例各组差异较大, 最高的是白藜芦醇和云南白药单次用药组, 分别为52.4%和54.8%。上述结果表明, 中药处理对伤口的愈合和珍珠质量具有一定的促进作用, 其中, 白藜芦醇或云南白药对伤口单次处理的效果最好。     

中药对合浦珠母贝插核手术伤口愈合效果和珍珠质量的影响

研究了3种中药对合浦珠母贝（Pinctada fucata）插核手术后体重日增长速度、伤口的愈合效果及其对珍珠质量的影响。试验采用白藜芦醇、芦荟胶和云南白药对插核伤口进行单次处理（插核手术后及时处理）和3次处理（手术后第5天和第10天分别进行第2次和第3次处理）,对体质量日增长速度、愈合率和珍珠质量进行统计分析。结果显...     

地塞米松和过氧化氢对合浦珠母贝珍珠层结构及基质蛋白表达的影响

分别用地塞米松(Dexamethasone,DEX)和过氧化氢(H2O2)处理合浦珠母贝(Pinctada fucata),研究其对贝珍珠层和基质蛋白表达的影响。扫描电镜观察显示,DEX可促进珍珠层生长,H2O2则抑制珍珠层生长。体外碳酸钙结晶实验表明,DEX处理组间液蛋白调控文石生成的趋势加强,并加速碳酸钙结晶速率;H2O2处理组相反。实时定量PCR实验显示,DEX处理组TGFβ和NF-кB信号通路关键因子pf-smad3、pf-rel等和基质蛋白Nacrein等基因表达水平明显降低,H2O2作用组则显著上升。由上述结果推测,DEX和H2O2可通过抑制或激活合浦珠母贝的TGFβ和NF-кB信号通路,从而调控与珍珠层形成相关的基质蛋白的表达,并影响珍珠层的结构;同时暗示贝的免疫体系和矿化系统可能存在协同作用,该作用机制具有生物进化学意义,并对养殖珍珠的培育具有借鉴作用。     

基于微卫星的泥蚶5个地理群体遗传多样性分析

为了研究泥蚶不同地理群体的系统发育关系和遗传多样性,运用微卫星DNA标记,对浙江温州(ZJ)、山东日照(SD)、韩国釜山(KR)、广西企沙(GX)、海南海口(HN)等5个泥蚶地理群体进行了17个基因位点的遗传多样性分析。结果显示,从17对引物中共检测出115个等位基因,每个位点等位基因数(Na)2~12个。有效等位基因数(Ne)为1.192~7.849,平均观测杂合度(Ho)为0.430~0.516,平均期望杂合度(He)为0.573~0.656,5个群体的平均多态信息含量(PIC)为0.525~0.608。Hardy-Weinberg平衡检验表明,51.2%的微卫星位点偏离平衡状态(P0.05)。5个群体间的种群遗传分化系数(FST)为0.012~0.062,呈现出较低的遗传分化。UPMGA聚类分析表明,浙江群体和韩国群体首先聚在一起,亲缘关系最近,然后与海南群体聚合;广西群体和山东群体亲缘关系较近,聚为一支,然后与上面三个群体聚合。     

大珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝(Pinctada maxima)微卫星DNA文库,随机挑选1200个菌落,经PCR筛选得到298个候选克隆,成功测序246个,分析获得251个微卫星序列,其中完美型、非完美型和混合型分别占63%、32%和5%。除探针中使用的CA重复外,还得到AT、GT、TC、AG、GC、TAA、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、CGTC、GACG、CTGT等重复序列。设计引物90对,挑选其中30对合成并筛选出21对能在大珠母贝基因组有效扩增的引物。种群PCR扩增后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测,获得了10个多态位点,共检测出59个等位基因,片段长度范围为133~444 bp。各位点等位基因数2~8个,平均等位基因数5.9个;有效等位基因数为1.342 3~6.000 0,平均为4.124 0;多态性信息含量(CPI)为0.222 5~0.811 8,平均0.7179;期望杂合度(He)为0.259 3~0.847 5,平均0.717 9;观测杂合度(Ho)为0.300 0~0.800 0,平均0.533 3。这些微卫星多态性标记的获得,为进一步开展大珠母贝遗传育种、保护生物学和种群遗传多样性等研究奠定了一定基础。