皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道潜在益生菌的筛选及对幼鲍生长的影响

采用体外实验筛选益生菌结合16SrDNA序列分析法,从124株不具有溶血作用的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道细菌中筛选得到5株潜在益生菌并进行了分子鉴定,进一步对5株潜在益生菌进行了安全性实验及体内饲喂实验。结果表明,2株具有拮抗哈维弧菌和灿烂弧菌能力的潜在益生菌分别被鉴定为Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65),一株产海藻酸酶和淀粉酶的潜在益生菌被鉴定为Vibrio sp.(WA51),产蛋白酶潜在益生菌被鉴定为Bacillus sp.(FA12),产琼脂酶潜在益生菌被鉴定为Tamlana sp.(FA86);安全性实验表明5株潜在益生菌在107cfu/ml下对皱纹盘鲍没有明显的毒害作用;通过体内饲喂实验发现,潜在益生菌WA64、WA65的复合作用能够显著提高幼鲍增重率和存活率(P<0.05),并在生产条件下能够明显降低幼鲍的死亡量。经抗生素敏感性实验,WA64菌株对15种抗生素均敏感或中度敏感,WA65菌株仅对庆大霉素和链霉素2种抗生素产生耐药。     

大黄鱼病原菌——溶藻弧菌的EuSA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌(0.05%甲醛,30℃,8h)制成菌苗,注射免疫实验兔获得抗血清.该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应.用该抗血清进行溶藻弧菌ELISA检测,其最低检测极限为97000cfu/ml.将该方法应用于养殖现场,检测结果为海水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%,表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

九孔鲍养殖中的脓疱病病因分析和药物敏感性研究

在福建沿海养殖的九孔鲍不论是成鲍还是幼鲍均经常发生脓疱病,死亡率可达 50％-60％,其症状与皱纹盘鲍脓疱病相似,但对药物的敏感性却不同．研究发现: 导致福建省的九孔鲍发生脓疱病的主要致病菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)而非 河流弧菌(V．fluvialis)．其对多数药物不敏感,在43种抗菌药物中只对呋喃妥因、氯霉 素、痢特灵等中度敏感,而对青霉素、复方新诺明和头孢类药物则完全不敏感．由于上述 药物已被列为禁用渔药而不宜使用,故生产中应以新研制的无公害防治药物替代．     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

养殖近江牡蛎致病弧菌的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌,人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组.3株细菌均为革兰氏阴性,短杆状,能运动.常规生理生化和Biolog 细菌鉴定系统测试结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V. proteolyticus亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V. carchariae亲缘关系最近.为了进一步确定它们的分类学地位,分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列,分析相关细菌相应序列的同源性,并构建系统进化树.结果表明, 菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近.因此菌株A3G-2、A2G-5B 和B1X-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌.组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊,表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落,管腔扩大,进而管壁解体,消化盲囊出现大面积受损.     

养殖近江牡蛎致病弧茵的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌,人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组。3株细菌均为革兰氏阴性,短杆状,能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V．proteolyticus亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V．carchariae亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位,分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列,分析相关细菌相应序列的同源性,并构建系统进化树。结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近。因此菌株A3G-2、A2G-5B和BIX-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌。组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊,表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落,管腔扩大,进而管壁解体,消化盲囊出现大面积受损。     

分子鉴定方法研究大亚湾水体弧菌种类变化

借助分子鉴定方法监测大亚湾水体中弧菌Vibrio种类季节性动态的变化规律.通过增菌培养、菌株分离,在224份海水中共分离出弧菌368株,并用分子生物学辅助生化鉴定方法鉴定弧菌菌株.结果表明,在大亚湾海域水体中鉴定的弧菌种类有溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈氏弧菌V.harveyi和创伤弧菌V.vuinificus,没有检测到霍乱弧菌V.cholerae、拟态弧菌V.mimicus、河流弧菌V.fluvialis和霍利斯弧菌V.hollisae.溶藻弧菌和副溶血弧菌为优势菌群,分别占弧菌总数的27.99%和21.74%.     

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

3种致病弧菌感染对大黄鱼7种酶活性的影响

大黄鱼溃疡病主要由3种致病弧菌引起:溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈维弧菌V. harveyi和副溶血弧菌V. parahaemolyticus。为了解大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理,对其疾病防御提供重要的理论基础,本实验将健康的大黄鱼随机分为3个实验组和1个对照组,分别注射0.2 mL的哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水。在人工感染后的第0,1,2,4,7,10,13,16,20天分别采样,通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性,比较这3种致病弧菌对大黄鱼影响的差异性。结果表明:在感染后的1～10 d,实验组大黄鱼血清中血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性变化,总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于-致的现象,且不同病原菌之间存在-定的时效差异。 碱性磷酸酶(AKP)对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感,ACP、POD和MPO对溶藻弧菌反应较敏感,LSZ和PO对副溶血弧菌反应较敏感。     

脱壳病和吻肿病东风螺体内致病菌及条件致病菌菌相研究

为探讨东风螺脱壳病和吻肿病与体内外致病菌及条件致病菌的相关性,测定了东风螺养殖水体环境中异养菌菌落总数,并对病螺及健康螺体内致病菌及条件致病菌进行了分离鉴定.经兔血培养基、TCBS培养基和弧菌显色培养基分离培养,用生化试验和细菌16S rDNA序列分析鉴定,结果显示:发生脱壳病的方斑东风螺螺池水体中的异养菌菌落总数为1.34×106 cfu/mL,病螺体内分离的致病菌及条件致病菌有副溶血弧菌、哈氏弧菌、河流弧菌、Vibrio hepatarius、腐败希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和芽孢杆菌,其中优势菌株为副溶血性弧菌溶血菌株和哈氏弧菌;脱壳病与吻肿病共患的泥螺螺池水体中异养菌的菌落总数为1.46×107 cfu/mL,病螺体内分离的致病菌及条件致病菌有副溶血弧菌、哈氏弧菌、鲍鱼希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和芽胞杆菌,优势菌株为海藻希瓦氏菌、鲍鱼希瓦氏菌和哈氏弧菌;健康东风螺螺池水体异养菌菌落总数为7.6×104 cfu/mL,健康东风螺螺体内的优势菌株为副溶血性弧菌非溶血菌株和Vibrio hepatarius.试验结果表明,东风螺脱壳病和吻肿病与养殖水体环境中异养菌的总数及螺体内部致病菌及条件致病菌分布具有一定相关性.     

皱纹盘鲍肠道菌群组成及PCR-DGGE 指纹图谱分析

对养殖和野生皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino )不同个体间肠道菌群数量和种类组成进行了研究, 并采用PCR-DGGE 指纹技术对比分析了二者肠道优势菌群的差异。研究结果表明, 养殖和野生皱纹盘鲍肠道好氧及兼性厌氧菌总数分别为(3.50±0.85)×10⁶个/g, (3.03±1.10)×10⁶个/g; 两组鲍鱼肠道优势菌基本相同, 均为弧菌属(Vibrio), 次优势菌均为玫瑰杆菌属(Roseobacter) 和希瓦氏菌属(Shewanella), 在养殖组中检测到芽孢杆菌属(Bacillus), 表明皱纹盘鲍对肠道细菌具有特异选择性。此外, PCR-DGGE 指纹图谱结果表明, 从养殖和野生皱纹盘鲍肠道样品分别获得14 条和12 条扩增条带,其中人工组中有2 条特异性条带; 二者相似性系数(戴斯系数)为92.31%。     

高温胁迫下皱纹盘鲍不同养殖群体心率变化比较

高温是海水贝类度夏死亡的环境诱因之一。本研究应用一种非损伤性的心率检测方法,检测两个皱纹盘鲍养殖群体在高温胁迫条件下心率等生理指标的变化,尝试以心率变化指标比较这两个群体高温耐受能力。由于高温胁迫下皱纹盘鲍的心率随温度变化的关系符合阿伦尼乌斯(Arrhenius)公式,且心率随温度上升呈先上升后下降趋势,该研究通过计算两者直线拟合拐点即阿伦尼乌斯拐点温度(ABT,Arrhenius break temperatures)指标,用以指示皱纹盘鲍温度耐受程度。以此法对皱纹盘鲍两个群体(高温耐性,对照)各17个个体进行了测定分析,结果表明:两个群体间的ABT存在显著差异,高温耐性组的皱纹盘鲍的ABT显著高于对照组(P0.05);个体ABT指标的高低与测定个体的壳高呈正相关(P0.05)。本研究首次将探讨了高温胁迫下皱纹盘鲍心率变化规律,并以ABT为指标分析比较了两个皱纹盘鲍养殖群体间高温耐受能力,结果对研究皱纹盘鲍和其它贝类温度胁迫下生理响应及抗逆选育具一定借鉴意义。     

广东沿海香港牡蛎消化道异养菌统计及其耐药性研究

本研究针对高温时期(6月、9月)广东沿海地区的香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内异养细菌总数和弧菌总数进行了深入的调查,并由添加单种抗生素(分别是:庆大霉素、呋喃唑酮、利福平、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素、复方新诺明)的培养基中分离得到310个菌株。进一步采用纸片扩散法(kirby-bauer法)针对常见的抗生素对此310个菌株进行药敏测试,了解不同来源菌株的耐药状况。结果表明310个菌株分属48个不同种属,主要是肠杆菌(Enterobacter)、弧菌(Vibrio)、芽孢杆菌(Bacillus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella)、希瓦氏菌(Shewanella)、不动杆菌(Acinetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、短波单胞菌(Brevundimonas)、发光杆菌(Photobacterium)、黄杆菌(Tenacibaculum)、盐单胞菌(Halomonas)等。在9月份从牡蛎体内分离的异养细菌比6月份分离的异养细菌高出1～2个数量级(除台山外)。6月份从台山地区牡蛎分离的异养细菌数(2.6×10~6～5.8×10~6 cfu/g)最多,高出其他地区1～3个数量级。药敏测试结果显示牡蛎体内异养细菌对20种抗生素普遍存在抗性,尤其对青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及万古霉素表现出较高的耐药率。高温时期(6月、9月)分离的异养菌大多数为多重耐药细菌,其比例分别为84.18%和91.72%。本研究将为牡蛎养殖业的疾病控制以及水产养殖中细菌的耐药状况提供重要参考依据。     

哈维弧菌和鲍类疱疹病毒刺激对杂色鲍免疫相关因子的影响

以哈维弧菌(Vibrio harveyi)、鲍类疱疹病毒(Abalone herpesvirus,Ab HV)悬液对杂色鲍(Haliotis diversicolor)注射刺激,研究其血淋巴中可溶性总蛋白浓度,免疫相关酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)活性的变化,杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺、腹足中血蓝蛋白(Hemocyanin,Hc)基因Hc1、Hc2相对表达量的变化以及感染后杂色鲍无细胞血浆的抑菌性。结果显示:(1)杂色鲍血淋巴中可溶性总蛋白浓度变化显著,呈现出先升高后降低的趋势。(2)无细胞血浆中的SOD、ACP、AKP活性与对照组相比变化显著,哈维弧菌注射组的SOD活性在感染后第6小时显著升高;Ab HV注射组SOD活性与对照组比较在注射后的各个时相均呈下降趋势,从注射后6 h各个时相的SOD活性与对照组相比均差异显著(P0.05)。哈维弧菌注射组ACP活性在注射后的第48小时显著升高;Ab HV注射组ACP活性在注射后的第12小时显著升高。哈维弧菌注射组AKP活性在注射后48 h显著升高;AbHV注射组AKP活性在注射后第12小时显著升高。(3)杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺以及腹足中血蓝蛋白两个基因Hc1、Hc2的相对表达量均在注射后的不同时间点出现升高。(4)杂色鲍无细胞血淋巴对哈维弧菌、创伤弧菌和溶珊瑚弧菌这三种贝类病原均表现出了不同程度的抑菌性增强的作用。这些结果表明细菌和病毒的刺激引起了杂色鲍免疫相关因子的变化,使得血淋巴的抑菌性增强。本研究为今后进一步研究杂色鲍的非特异性免疫以及在生产实践中应用免疫技术防治病害提供参考。     

矛尾复虾虎鱼溃疡病病原创伤弧菌的鉴定

2009年8月江苏连云港赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼（砂nechogobius hasta）大量死亡．从病鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明分离菌对虾虎鱼的半数致死量（LD,0）为1．63×10^6cfu／g。对分离菌进行了形态特征、理化特性和分子生物学等方面的分析。一方面．分离...     

刺参肠道微生物组成分析及产酶、溶血性试验

对野生和人工养殖刺参的肠壁及内容物中的菌群数量、种类组成进行了研究;并结合产酶试验和溶血性试验,对刺参肠道益生菌做了初步的体外筛选。结果表明,野生刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(3.30±0.41)×107 cfu/g、(6.39±0.32)×107 cfu/g,养殖刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(2.83±0.31)×107 cfu/g、(5.67±0.53)×107 cfu/g。野生刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella);养殖刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)。在224株细菌中,共有160株细菌具有产酶能力,所占比例为71.43%,其中具产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分别为114株、114株、108株,所占比例分别为50.89%、50.89%、48.21%。99株细菌中有23株具有溶血性,所占比例为23.23%。综合分析实验数据,确定6株细菌作为刺参肠道潜在益生菌,菌株代号分别为HS1(Pseudomonas)、HS5(Bacillus)、HS7(Shewanella)、HS8(Vibrio)、HS10(Vibrio)、HS11(Vibrio)。     

CPA-核酸试纸条快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)方法的建立及其在海产品检测中的应用

本研究将交叉引物恒温扩增技术(cross priming amplification,CPA)与核酸试纸条相结合建立一种副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)快速可视化检测方法。针对副溶血性弧菌特有的不耐热溶血素基因tlh的六个不同区域设计两对特异性引物和一对检测探针,通过优化反应条件确定了最佳反应体系。CPA-核酸试纸条方法对副溶血性弧菌的检测具有较强的特异性,对纯培养物的检测灵敏度达到58 cfu/m L,对污染牡蛎中副溶血性弧菌的检测灵敏度为5.2 cfu/g,比传统的PCR技术灵敏度提高了10倍,且具有较高的稳定性。交叉引物恒温扩增技术与核酸试纸条相结合的方法操作简便、特异性强、灵敏度高且能有效防止污染,可用于现场及基层单位副溶血性弧菌的快速检测。     

以16S和16S—23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) PCR快速检测技术

提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。     

Rearing in intermediate salinity enhances immunity and disease-resistance of turbot (Scophthalmus maximus L.)

Studies were conducted to investigate the non-specific immune responses and disease-resistance of juvenile turbot Scophthalmus maximus,cultured at four different salinities(8,20,32 and 40) . Three concentrations(3.75 × 10 7,3.75 × 10 8 and 3.75 × 10 9 CFU/ml) of Vibrio anguillarum suspension were employed at each salinity to determine the 4-day LD 50 . The serum lysozyme activity,the alternative complement pathway activity(ACH50) and the phagocytosis percentage of head kidney in turbot were tested at 24,48 and 72 h post-challenge of V. anguillarum(1.1 × 10 8 CFU/ml,0.1 ml) ,respectively,to evaluate the non-specific immune responses at the selected rearing salinities. Fish reared at salinity 20 had the lowest mortality,namely,the highest 4-day LD 50 value(8.88 ± 0.17) . Besides,the lysozyme activity,ACH50 and the phagocytosis of turbot were the highest at the salinity 20,but with the lowest at the salinity 40 treatment regardless of sampling time. In addition,the non-specific immune activities kept increasing within 72 h post-challenge of V. anguillarum,except that the lysozyme activity increased from 24 to 48 h,and then decreased from 48 to 72 h at 40 significantly. These results together indicate that rearing in intermediate salinity(20) was able to enhance the immunity and disease-resistance of turbot.