绿鳍马面鲀精子的超微结构

为探讨绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)精子的超微结构,作者应用扫描电镜和透射电镜观察了其精子外部形态与各部位的横切结构。结果表明:绿鳍马面鲀精子由头部和尾部两部分组成。精子头部呈卵圆形,无顶体,头部主要结构是细胞核,染色质致密,核内存在少量染色质空隙,无液泡;核后端正中有凹入核内的植入窝,呈棒状,植入窝较深,最深处占细胞核纵长的5/6,最宽处在细胞核末端,约占头部宽度的1/3。中心粒复合体位于植入窝内,由近端中心粒、中心粒间体和基体组成,近端中心粒的长轴与基体的纵轴垂直,排列方式为"T"型;头部末端为袖套,内含5个或6个均匀分布的线粒体球和少量随机分布的囊泡。尾部细长,自基体向后伸出,尾部无侧鳍结构,其核心结构是轴丝,轴丝为典型的"9+2"微管复合体结构。揭示其精子的形态结构,以期丰富硬骨鱼类繁殖生理学内容,同时为鱼种鉴别提供依据。     

绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)CYP19a基因克隆与表达特征分析

利用简并引物扩增及RACE全长克隆技术, 克隆得到绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)CYP19a基因cDNA全长序列。通过多序列比对, 发现具有芳香化酶特定保守序列, 包括一个I-螺旋区, 一个Ozol肽区, 一个亚铁血红素结合区域以及一个芳香化酶特异性结合区域。通过RT-PCR技术检测了其在绿鳍马面鲀成鱼各组织表达的情况, 发现其CYP19a基因只在卵巢中有表达; 同时也分析了其在不同卵巢发育期的表达情况, 发现CYP19a在卵黄发生后期表达量达到最高值, 卵巢退化吸收期表达量达到最低值。     

绿鳍马面鲀早期生长发育与摄食特性的研究

在人工培育条件下,采用实验生态学方法,对绿鳍马面鲀(Thamnaconusmodestus)仔、稚、幼鱼生长、发育与摄食特性的变化进行了研究。结果表明,绿鳍马面鲀仔、稚、幼鱼的各生长指标可拟合为具有1～2个生长转折点的2～3段直线,其中全长、体长、体质量、肛前长、头长、吻长和体高可拟合为3段直线,眼径可拟合为2段直线。头长在第一转折点后的生长速率显著高于其他指标,除头长和体高在第二个生长转折点后生长速率减慢外,其余各项生长指标生长速度均逐渐加快。3～4日龄"开口期"前后的仔鱼,摄食发生率和饱食率均较低,随后逐渐升高。摄食发生率在12日龄后达到100%,饱食率在25日龄后达到100%(消化道充塞度为3～4级)。绿鳍马面鲀仔、稚、幼鱼均为白天摄食类型,白天摄食量占全天摄食量的71.6%以上。随日龄增长,鱼苗饱食时间呈下降趋势,消化时间则呈上升趋势。了解绿鳍马面鲀早期的生长发育与摄食特性,可为人工育苗管理提供参考,以促进鱼苗生长,提高成活率。     

绿鳍马面鲀肌肉营养成分分析和营养评价

作者以黄海野生绿鳍马面鲀(Thamnaconusseptentrionalis)为研究对象,按国家标准(GB5009.3-6-2010)进行检测,对其肌肉的一般营养成分和氨基酸、脂肪酸进行测定分析。结果表明:水分含量75.47%,粗蛋白含量17.88%(湿样),灰分含量6.15%,粗脂肪含量0.55%。肌肉中检测出17种氨基酸,其中含有7种人体必需氨基酸,平均含量35.70%,与总氨基酸含量平均比值为41.8%;鲜味氨基酸4种,平均含量34.33%,与总氨基酸含量平均比值为38.74%。其必需氨基酸组成符合FAO/WHO理想模式,属于优质蛋白质鱼类。肌肉(干样)中粗脂肪含量较低,含有7种饱和脂肪酸和18种不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸含量60.38%,其中EPA、DHA含量分别在8.71%和23.78%。根据氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS),第一限制氨基酸和第二限制氨基酸分别为蛋氨酸+半胱氨酸和缬氨酸,必需氨基酸AAS均大于1.0, CS均大于0.8。必需氨基酸指数(EAAI)为92.20,高于大部分经济鱼类。因此,野生绿鳍马面鲀肌肉各营养成分种类齐全含量较高,是理想的食用鱼类,今后值得继续开发。     

温度、盐度对绿鳍马面鲀幼鱼存活及生长的影响

在工厂化条件下,通过控制养殖用水的不同温度、盐度,对绿鳍马面鲀幼鱼的存活及生长情况进行观测研究。结果表明:平均全长(42.66±5.23)mm的幼鱼存活的适宜温度为21～30℃,高于30℃时会引起大量死亡;体长和体质量生长的最适温度为21～24℃,高于24℃则生长速度减慢。幼鱼存活的适宜盐度为10～45,体长和体质量生长的最适盐度为25～35,超出此范围生长速度明显降低。     

绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)鱼皮胶原蛋白的分离纯化及理化性质研究

利用酸溶法和酶溶法分离纯化绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对所得的ASC和PSC的氨基酸组成、亚基组成、红外光谱(FTIR)、黏度和热变性温度,以及溶解度等性质进行系统分析。研究结果表明:马面鲀鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC)的得率分别为0.87%±0.15%和9.52%±0.41%(按鱼皮干重计算)。ASC和PSC中含有的主要氨基酸为甘氨酸(Gly),含量分别为323.3残基/1000残基和321.7残基/1000残基;二者中所含的亚氨基酸含量分别为191.1/1000残基和183.4/1000残基。氨基酸组成分析、SDS-PAGE和FTIR证实马面鲀鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)为I型胶原蛋白,且其SDS-PAGE图中的亚基组成(α1-肽链和α2-肽链)、氨基酸序列,以及胶原蛋白构型与PSC明显不同。ASC和PSC的热变性温度(Td)分别为21.5℃和18.9℃,显著低于哺乳动物来源的胶原蛋白。ASC和PSC的最大溶解度出现在p H 2—3时,当Na Cl的浓度低于2%时,二者的溶解度就开始急剧下降。此外,冻干的胶原蛋白显示出疏松多孔的超微结构。综上,相对于哺乳动物类胶原蛋白,马面鲀鱼皮ASC和PSC的亚氨基酸含量和热变性温度较低,结构稳定性差,易于降解,可作为胶原蛋白肽的制备原料进行开发利用。     

盐度对绿鳍马面鲀存活、抗氧化酶及组织结构的影响

绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)作为中国沿海新兴网箱养殖种类, 在夏季多雨季节会经历盐度剧烈变化的过程, 因而探明盐度对绿鳍马面鲀存活和生理指标的影响, 对开展网箱养殖具有重要意义。本研究首先测定了绿鳍马面鲀的96 h半致死盐度, 随后分别设置低盐组(15)和高盐组(40), 分析盐度胁迫不同时间后生理指标的动态变化规律, 观察肝脏、鳃和肾脏的组织结构改变。结果显示, 绿鳍马面鲀96 h半致死低盐度为10.74, 半致死高盐度为42.95。低盐组和高盐组鳃Na⁺-K⁺-ATP酶活呈上升趋势, 且高于对照组, 在96 h时各组差异性显著(P<0.05)。低盐组和高盐组肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均表现为先上升、后下降的趋势, 在96 h时均低于对照组; 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性呈先下降后上升的趋势, 在96 h时低盐组显著低于高盐组(P<0.05)。低盐组和高盐组肝脏丙二醛(MDA)含量在96 h达到最大值, 且显著高于对照组(P<0.05)。组织切片显示, 低盐组和高盐组肝细胞出现空泡和细胞核固缩的现象, 且高盐组更为严重; 鳃丝上皮细胞排列紊乱、细胞坏死, 低盐组鳃丝变宽, 鳃小片变长, 高盐组鳃丝萎缩, 鳃小片间距变大; 肾组织低盐组出现肾小管管腔扩张、肾小囊腔膨大, 高盐组出现肾小管和肾小球坏死的现象。本研究探究了盐度对存活、抗氧化酶及组织结构的影响, 可为绿鳍马面鲀健康养殖提供理论支持。     

绿鳍马面鲀重复发育雄性生殖腺结构与发育组织学观察

采用常规石蜡切片、HE组织染色法研究了性成熟绿鳍马面鲀雄性生殖腺结构和发育组织学。结果表明,性成熟绿鳍马面鲀精巢从外形上明显分为上、下两段,上段为生精部,下段为贮精囊。生精部分为2支,呈黄色、长条状;生精部为典型的小叶型结构;精小叶间有间质(Leydig)细胞。其生精部的发育历程可分为重复发育Ⅲ期、精子形成Ⅳ期、精子成熟Ⅴ期和退化吸收Ⅵ期。贮精囊位于精巢的后方并通过壶腹与生精部相连,贮精囊为椭圆形,白色不分支,其组织结构与贮存精子功能相适应,由许多被结缔组织分开的管状囊腔组成;贮精囊组织学变化与生精部周期性的变化相关,又有相对的独立性,也有周期发育,可分为恢复期、生殖期和退化期。     

人工培育条件下绿鳍马面鲀Thamnaconus modestus胚胎发育的研究

2010年春、夏季对绿鳍马面鲀的人工繁育技术进行研究.以驯化的2～4龄野生绿鳍马面鲍作为亲鱼,人工采卵、半干法授精获得发育同步的受精卵.受精卵孵化条件:水温为(21.O士0.5)℃,S为32～33,pH为7.8～8.2,微充气.对绿鳍马面鲀的胚胎发育进行观察、拍照,分析各发育时期的发育时序和形态特征.绿鳍马面鲍受精卵为...     

绿鳍马面鲀微卫星标记开发及在丝背细鳞鲀中的通用性检测

为充分挖掘绿鳍马面鲀(Thamnaconus modestus)基因组资源,开发可用于群体遗传学研究的分子标记,本研究利用NCBI数据库中公布的绿鳍马面鲀全基因组序列筛查微卫星位点并在野生群体中验证,在85个选取的位点中筛选得到30个新的多态性较高的微卫星标记。每个微卫星标记的等位基因数为4~16,平均为8.5个;观测杂合度范围为0.207~0.916,平均值为0.685;期望杂合度范围为0.315~0.971,平均值为0.756;多态信息含量范围为0.301~0.898,平均值为0.716,其中属于高度多态的位点有26个,占总位点数的86.67%;经过Bonferroni校正后,有7个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。将30个绿鳍马面鲀多态性微卫星标记在丝背细鳞鲀(Stephanolepis cirrhifer)中进行通用性检测,其中13个位点成功扩增,9个位点具有多态性。本研究开发的微卫星标记可用于绿鳍马面鲀及相关物种的遗传多样性分析、QTL定位以及系统进化等研究。     

黄鳍鲷（Sparus latus）两种生长激素受体的cDNA克隆及组织表达分析

采用RT-PCR方法克隆了黄鳍鲷两种生长激素受体（Growth hormone receptor,GHR）的cDNA序列,序列分析表明：GHR1开放阅读框为1935bp,共编码645个氨基酸,GHR2开放阅读框为1749bp,共编码583个氨基酸,GHR1与GHR2的氨基酸同源性为36.7%。GHR1和GHR2在分子结...     

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)两种催乳素受体基因的 cDNA 克隆和 mRNA 表达分析

采用RT-PCR方法克隆了斜带石斑鱼两种催乳素受体(Prolactin receptor,PRLR)的cDNA序列,序列分析表明:PRLR1开放阅读框为1947bp,共编码649个氨基酸,PRLR2开放阅读框为1749bp,共编码487个氨基酸,PRLR1与PRLR2的氨基酸同源性为40.4%。用Real-time RT-PCR方法研究了PRLR1和PRLR2在各组织和早期发育不同阶段的表达情况,结果表明:PRLR1和PRLR2在所检测的12种组织中均有表达,其中以鳃、肾、肠表达量较高;PRLR1在受精期表达最高,PRLR2在视囊形成期表达最高,而且除受精卵期外PRLR2在各时期的表达量均高于PRLR1。     

黄鳍金枪鱼巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的克隆与序列分析

采用同源克隆的方法、利用RACE技术从黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)肝脏中克隆了其MIF(TaMIF)的cDNA序列.TaMIF的cDNA全长706 bp含一个345 bp的开放阅读框,编码一个长115氨基酸的蛋白质.信号肽预测分析表明TaMIF没有信号肽.序列分析与进化分析表明,黄鳍金枪鱼与近海养殖鱼类MIF的氨基酸序列高度相似、进化地位相近,预示着深海鱼类TaMIF与近海养殖鱼类具有相似的生物学功能.研究结果是对深海鱼类MIF基因信息资料的重要补充.     

黄鳍鲷白细胞介素1β基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用同源克隆和RACE-PCR(Rap id amp lification of DNA ends-PCR)技术,从黄鳍鲷Acanthopgrus latus中克隆了白细胞介素1β(interleuk in-1,βIL-1β)基因的全长cDNA序列。黄鳍鲷IL-1β的cDNA全长共1 242 bp,5端非编码区(UTR)为121 bp,3端非编码区(UTR)为342 bp,开放阅读框(open read ing fram e,ORF)为762 bp,编码一条253个氨基酸残基的多肽,分子量约为28.5kDa,理论等电点为5.55,含有2个潜在的糖基化位点。同源性分析表明与其它鱼类和脊椎动物的IL-1β序列具有较高的同源性。利用软件S ignalP分析表明它不存在信号肽序列,氨基酸序列中不存在IL-1β转换酶(interleuk in-1βconverting enzym e,ICE)剪切位点,推导可能成熟肽为从第85位氨基酸开始共169个氨基酸残基的多肽,分子量约为18.9kDa。将此成熟肽序列克隆入pQE30质粒构建表达载体pQE30-IL1β,并在大肠杆菌Escherichia coliM15(pREP4)中进行诱导表达,获得了分子量约为21 kDa的特异性融合蛋白。     

密斑刺鲀(Diodon hystrix)gnrh基因的克隆及表达分析

密斑刺鲀(Diodonhystrix)不仅具有食用价值,同时也是传统的中药及保健食品,但目前关于密斑刺鲀的生殖内分泌调控研究较少,限制了密斑刺鲀的人工繁育基础理论的发展。总所周知,促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是生殖内分泌调控的关键因子之一。利用转录组分析及分子克隆技术,获得密斑刺鲀促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH) gnrh2和gnrh3基因的cDNA开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)序列,并利用生物信息学的方法,获得密斑刺鲀gnrh2 cDNA开放阅读框共279 bp,可编码92个氨基酸残基;密斑刺鲀gnrh3cDNA开放阅读框共270 bp,可编码89个氨基酸残基。通过系统进化分析表明,密斑刺鲀GnRH与鲀科类的鱼具有较近的亲缘关系。通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)半定量的方法检测gnrh2和gnrh3基因在密斑刺鲀各组织中的分布,结果发现gnrh2和gnrh3基因在脾、鳃和垂体中的表达量较高,而在心脏中的表达量最低。此外,利用实时荧光定量的方法检测了密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在性腺发育不同时期的表达模式,结果显示密斑刺鲀gnrh2基因在不同的性腺发育时期中没有显著性的变化,而gnrh3基因随着性腺发育成熟而不断升高。研究主要获得两个创新性的重要结果:首先是证实了密斑刺鲀存在两种gnrh基因(gnrh2和gnrh3),其次是提示了gnrh3基因可能是密斑刺鲀生殖调控的主要gnrh类型。研究结果可为深入研究密斑刺鲀生殖内分泌调控机理提供研究方向和基础。     

金钱鱼脑型芳香化酶基因cDNA 的克隆及表达分析

为了探讨Cyp19a1b基因表达与温度及鱼油添加量的相互关系,奠定金钱鱼人工繁育理论基础,作者采用RT-PCR和RACE法,克隆了金钱鱼(Scatophagus argue Linnaeus)脑型芳香化酶基因(Cyp19a1b);采用实时荧光定量PCR法,检测了不同温度(23、26和29℃)和不同水平鱼油(0、2%和6%)处理后二龄雌性金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA表达。结果表明:Cyp19a1b cDNA全长2409bp,5′端非编码区164 bp,3′端(不包括poly(A))712 bp,开放阅读框(ORF)1506 bp,编码501个氨基酸,推测其蛋白质分子量为56.697 kDa。序列分析及分子系统进化树结果表明:金钱鱼Cyp19a1b氨基酸序列与黄锡鲷和舌齿鲈Cyp19a1b同源性较高,分别为86.2%、86.5%,与鲤鱼(Cyprinus carpio)、稀有鲫(Gobiocypris rarus)、斑马鱼(Danio rerio)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、南方大口鲇(Silurus meridionalis)和鲻鱼(Mugil cephalus)Cyp19a1b同源性为64.1%~84.4%,但与上述7种鱼性腺芳香化酶(Cyp19a1a)同源性低于63.5%,同源性分析结果与根据传统形态学和生化特征分类的结果相一致。荧光定量PCR结果显示,随处理时间的延长,26℃和29℃组金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量都逐渐降低,但29℃组显著低于26℃组(P0.05),而23℃组在6周时则显著高于26℃和29℃组(P0.05),约为26℃组2倍的表达量;鱼油处理3个投喂组脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量均逐渐降低,但鱼油对金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量无显著影响(P0.05)。以上结果表明:随着卵巢发育或鱼油含量的提高,可降低雌性金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达,这种降低可能是E2反馈调节所致;水温高于26℃将抑制Cyp19a1b mRNA的表达。     

织锦巴菲蛤(Paphia textile)过氧化氢酶基因cDNA全长克隆、序列同源分析与组织表达

Catalase is an important antioxidant protein that can protect organisms against various forms of oxidative damage by eliminating hydrogen peroxide. In this study, the catalase c DNA of Paphia textile(Pt CAT) was cloned using RTPCR and rapid amplification of c DNA ends(RACE). Pt CAT is 1 921 bp long and consists of a 5′-UTR of 50 bp, a 3′-UTR of 349 bp, and an ORF of 1 542 bp that encodes 513 amino acids with a molecular weight of 58.4 k D and an estimated isoelectric point of 8.2. Sequence alignment indicated that Pt CAT contained a highly conserved catalytic signature motif(~(61)FNRERIPERVVHAKGAG~(77)), a proximal heme-ligand signature sequence(~(352)RLFSYSDP~(359)), and three catalytic amino acid residues(H~(72), N~(145), and Y~(356)). Pt CAT also contains two putative N-glycosylation sites(~(34)NKT~(36) and ~(437)NFT~(439)) and a peroxisome-targeting signal(~(511)AQL~(513)). Furthermore, Pt CAT shares 53%–88% identity and 29%–89% similarity with other catalase amino acid sequences. Pt CAT m RNA was present in all tested organs, including the heart, digestive gland, adductor muscle, gonad, gill, and mantle, but its expression was highest in the digestive gland. High-temperature-induced stress produced two expression patterns of Pt CAT m RNA: first, an initial up-regulation followed by a down-regulation in the heart, digestive gland, and gonad and, second, consistent down-regulation in all other organs. These results demonstrate that Pt CAT is a typical member of the catalase family and might be involved in the responses to harmful environmental factors.     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢发育中的表达分析

VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。     

真蛸FAXDC2基因的克隆及其表达分析

FAXDC2(fatty acid hydroxylase domain-containing protein 2)是脂肪酸羟化酶家族中的成员,在脂肪酸的合成与代谢中发挥重要功能。真蛸(Octopus vulgaris)是中国南方近海的经济种类,为了研究饥饿对真蛸FAXDC2(OvFAXDC2)基因表达的影响,本研究从课题组真蛸转录组数据库中筛选获得OvFAXDC2基因序列。采用从头至趾方法进行验证,最终获得OvFAXDC2的cDNA全长序列共1384 bp。它包含100 bp的5′非编码区(UTR)、228 bp的3′UTR和1056 bp的开放阅读框(ORF), ORF共编码351个氨基酸,预测其分子量为3.98 kDa,理论等电点为8.93。系统进化树分析显示,真蛸和加州双斑蛸(O. bimaculoides)聚为一支,而与其他无脊椎动物分开。实时荧光定量PCR分析表明, OvFAXDC2在消化腺中表达量最高,在鳃和鳃心中次之。在幼体饥饿试验中,随着时间的推移, OvFAXDC2表达量先升后降,在第三天达到最高,表明OvFAXDC2表达量的变化趋势可作为幼体代谢是否正常的一个指标。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因的cDNA和基因组DNA克隆及序列分析

根据已知的β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase,BKT)的cDNA序列设计引物,利用长距离PCR扩增获得了bkt基因的cDNA完整编码片段及基因组DNA片段,并对这些片断进行了序列测定。cDNA和基因组DNA比对结果表明该基因至少包括5个内含子,它们的剪切位点皆符合GU-AG规律。在比对结果中同时还发现一个19bp的短序列重复,该重复序列在bkt的cDNA和基因组DNA上都发生了多次重复,推测在BKT的表达调控中可能具有一定功能。另外,在序列比对过程中还发现本实验所获得的cDNA和基因组DNA序列与前人报道的cDNA序列之间都存在多处单碱基差异和19bp的短序列差异。