冬季刺参养殖环境与肠道内细菌菌群的研究

运用传统细菌分离培养与分子生物学技术相结合的方法,对2008年11月至2009年1月冬季刺参(Apostichopus japonicus Liao)养殖池塘环境(养殖水、底泥、附着基)及刺参肠道内的细菌菌群进行了分析。应用平板稀释涂布培养计数法测得刺参养殖池塘水体、底泥、附着基和肠道细菌数量分别为0.75×102～1.4×104cfu/mL、8.7×104～8.1×105cfu/g、3.8×105～2.8×106cfu/g、7.1×105～1.5×107cfu/g;根据形态学差异从培养所得的细菌中筛选得到22株菌,用限制性内切酶Rsa I和Msp I对所分离菌株进行ARDRA(Amplified rDNA Restriction Analysis)分析,这22株菌被分为8种不同的分类单元(Operational Taxonomic Unit,OTU),其中OTU2与OTU3所包含的菌株分别占分离菌株种数的30%和20%;此外,作者对不同环境培养所得的优势度最高的细菌进行分子鉴定分析。结果表明:水环境中优势菌为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),沉积物中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),附着基中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(Vibrio splendidus),肠道中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(V.splendidus)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)。通过对冬季刺参池塘细菌菌群多样性分析和优势菌鉴定,为筛选低温益生菌和防治刺参疾病提供了有益参考。     

池塘养殖和海上吊笼养殖仿刺参肠道菌群结构对比分析

实验采用平板分离及16S r DNA序列分析法研究池塘养殖和海上吊笼养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)的前肠、中肠和后肠菌群结构并进行对比分析.结果显示,从海上吊笼养殖的仿刺参的肠道内分离鉴定的240株菌株分属于3个门、11个属和34个种.从池塘养殖仿刺参的肠道内分离鉴定的211株菌株分属于3个门、11个属和49个种.两种养殖模式仿刺参肠道菌群结构存在较大差异,且同一仿刺参肠道各部分之间的菌群结构也存在较大的差异.海上养殖仿刺参的肠道优势菌群为弧菌属(Vibrio)、Formosa属、希瓦氏菌属(Shewanella),池塘养殖仿刺参的肠道内优势菌群为弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属(Bacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus).两个菌群共有菌株有7个种,存在于在不同的肠道部位.两种养殖模式比较发现池塘养殖仿刺参的肠道菌群的丰富度大于海上吊笼养殖的仿刺参,且池塘养殖仿刺参肠道内芽孢杆菌(Bacillus)等益生菌的占比较高,海上吊笼养殖仿刺参分离得到较多的弧菌属(Vibrio)细菌.本研究可为南方仿刺参人工养殖中潜在益生菌的筛选提供基础资料.     

刺参肠道与养殖池塘环境中异养细菌和弧菌数量周年变化

2008年9月~2009年10月,对刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧菌周年变化进行了初步研究。结果表明:刺参肠道与养殖环境中(水体、底泥、附着基)异养细菌数(HPC)、弧菌数(VBC)均呈现出明显的季节变化,肠道中HPC、VBC分别为1.85×105~2.17×109CFU/g、4.1×104~2.2×108CFU/g,水体中HPC、VBC分别为90~4.67×105CFU/mL、0~5.3×103CFU/mL,底泥中HPC、VBC分别为9.80×104~6.72×106CFU/g、1.01×104~5.75×105CFU/g,附着基中HPC、VBC分别为2.78×105~2.57×107CFU/g、4.6×104~1.31×107CFU/g,夏、秋两季细菌总数较高,冬、春低温季节细菌数量显著下降。通过VBC与HPC的比值可以看出,在冬、春季细菌总数较低的季节,弧菌与异养细菌数量比例较高,最高值达到:43.8%、43.2%,通过对优势菌的分离鉴定,冬、春两季灿烂弧菌(Vibrio splendidus)均占优势,这可能是造成冬、春两季刺参发病的诱因之一。本文通过研究刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧菌的变化规律,以期为刺参的健康养殖提供有益参考。     

刺参肠道及养殖池塘底泥微生物多样性的比较研究

刺参养殖作为北方环渤海地区新兴的经济产业,池塘养殖是其主要的养殖模式,而传统养殖模式中其生长环境易受外界影响,池塘底泥和刺参消化道中菌群的变化易引起刺参病害的发生,本文旨在通过研究不同季节刺参肠道及刺参养殖池底泥中菌系多样性及变化为深入了解刺参池塘养殖系统微生物的结构与功能提供参考。运用纯培养方法和16SrRNA基因序列分析,在1年中分4次取样,从刺参肠道和刺参养殖池底泥中分离出共151株海洋菌株,其中肠道菌72株,养殖池塘底泥79株,发现新菌种5株,拮抗菌株1株,通过构建系统发育树对刺参肠道及养殖环境底泥多样性进行研究。结果显示:分离的菌株分属海王星菌属(Neptuniibacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、迪茨氏菌属(Dietzia)、铁单胞菌属(Ferrimonas)、需盐杆菌属(Salegentibacter)等31个属;通过TCBS培养基筛选后发现弧菌属(Vibrio)在刺参肠道中有32株,底泥中28株,是刺参肠道和底泥环境中的第一大优势菌属,其数量随着时间变化呈上升趋势。     

仿刺参养殖区泥样中灿烂弧菌拮抗菌的快速筛选及其保护作用

采用不同培养基和泥样加热方法,从红岛仿刺参养殖区泥样中分离出27株可培养细菌,对其进行16SrRNA基因序列分析。发现海泥中可培养细菌多分布于γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)(占总菌数的71.4%),其中包括假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、弧菌属(Vibrio)和希瓦氏菌属(Shewanella)等;80℃加热处理20min,海泥中可培养细菌多属于芽孢杆菌属(Bacillus)。人工浸泡感染实验发现,泥样中灿烂弧菌LJ08(Vibrio splendidus)对仿刺参幼参具有致病性。泥样中分离获得的可培养细菌经安全性、抑菌活性和毒性检测,筛选出对灿烂弧菌LJ08有明显抑菌作用的LJ03、LJ04和LJ06并用其进行人工拮抗实验。统计分析显示,添加LJ03和LJ06拮抗组的累计排脏率分别为(36.11±4.81)%和(2.78±4.81)%,与仅添加灿烂弧菌LJ08的阳性对照组差异显著(P0.05)。结果表明,LJ03和LJ06具有很好保护仿刺参幼参的作用,尤其LJ06对仿刺参幼参的排脏保护率达104.7%。作为拮抗灿烂弧菌的潜在有益菌,LJ06在仿刺参养殖中将有良好的应用前景。     

青岛近岸特征环境中海洋异养细菌的分布规律及其分子鉴定

研究海洋微生物特征,从青岛近岸养殖密集区、工业区、洁净区分离了428株海洋异养细菌,采用BIOLOG技术对其进行了鉴定和聚类,从中选出13株具有代表性的菌株,克隆其16SrDNA片段,进行分子鉴定。结果表明,它们分别属于弧菌属(Vibrio)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、海单胞菌属(Oceanimonas)、噬纤维菌属(Cellulophaga)、赤细菌属(Erythrobacter)和Rhodovirga。在3种特征环境中,海洋异养细菌的分布具有一定的规律性:其中洁净区的特征类群属于弧菌属(Vibrio),工业区的特征类群属于弧菌属(Vibrio)和不动杆菌属(Acinetobacter),养殖密集区的特征类群属于弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseu-domonas)、海单胞菌属(Oceanimonas)、赤细菌属(Erythrobacter)、噬纤维菌属(Cellulophaga)和噬冷菌属(Algoriphagus)。     

中国对虾成虾肠道微生物区系

对野生健康中国对虾成虾肠道微生物区系进行了研究.从其肠道中分离出47株菌,它们分别属于弧菌属、发光杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属8个属.其中弧菌属和发光杆菌属在整个肠道中为优势菌属,不动杆菌属和假单胞菌属为次优势菌属,黄杆菌属、气单胞菌属、屈挠杆菌属和色杆菌属为非优势菌属.在对虾的整个肠道中,前肠和中肠的优势菌属为弧菌属,而后肠的优势菌属为发光杆菌属.在弧菌属中溶藻胶弧菌、漂浮弧菌和坎贝氏弧菌为优势菌,哈唯氏弧菌为非优势菌.前肠、中肠和后肠的菌量分别为1.3×105、2.8×105和1.1×104cfu/虾体.     

一株拮抗菌C-5 的分离及鉴定

针对目前海参养殖中水产微生态制剂品种单一、施用效果不稳定等现状,作者从地瓜参(Acaudina molpadioidea)肠道分离土著肠杆菌(Enterobacter),筛选到1株具有较好拮抗作用的海洋细菌C-5,该菌对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)等7种细菌有拮抗作用;通过形态观察、生理生化和16S rDNA基因序列分析鉴定为霍肠杆菌(Enterobacter hormaechei);通过卤虫(Artemia)和药敏实验检测该菌具有安全性,其对卤虫的72 h半致死浓度(LC50)为108cfu/m L,只对20种常规抗生素中的5种产生耐药性;对C-5的发酵条件进行优化,该菌优化后的发酵条件为:温度30℃,pH 7.0,盐度2%。结果表明,C-5有望作为一种益生菌应用于海水养殖病害控制。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌群的地域性差异与共性研究

作为高附加值水产养殖物种,仿刺参(Apostichopusjaponicus)的病害和病原微生物研究受到人们关注,但对其共生菌群组成、地域性差异及与水体环境间交流等方面的研究仍十分有限。本研究收集了来自中国、日本和韩国共786例仿刺参肠道、水体和沉积物的16SrRNA基因高通量测序数据,比较细菌群落组成以探寻仿刺参肠道微生物与环境和地域之间的关系。分析结果显示,尽管仿刺参肠道、水体和沉积物中各细菌组分的比例不同,但共有菌属甚多,表明仿刺参可以从外界环境大量获取微生物。与水体和沉积物的样本类型相比,仿刺参肠道微生物多样性最低且所含菌属的种类最少,进一步提示仿刺参肠道对外界来源的微生物进行了富集和筛选,其中变形细菌门(Proteobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和利斯顿氏菌属(Listonella)的富集尤为明显。中国、日本和韩国来源的仿刺参肠道微生物Alpha多样性无显著差异,但主坐标分析将它们聚为不同的簇,且各自拥有独特的细菌门类。比较中国渤海和黄海两个海区的仿刺参肠道菌群获得了相似的结果,体现出广泛的地域性差异。基于细菌分类的功能预测发现三个国家仿刺参肠道微生物均具有发酵、化能异养和需氧化能异养功能,表明共生菌群在功能上存在共性,并可能对宿主生理产生相同的作用。本研究揭示了仿刺参肠道微生物在不同地域之间存在明显差异,并且与水体环境之间存在着密切的联系,能够为仿刺参共生微生物及其与宿主健康的相关性研究提供基础性资料,并可能在自然循环过程和渔业资源保护过程中发挥作用。     

芽孢杆菌水体泼洒对刺参体内外细菌群落结构的影响

研究了泼洒蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BC-01对刺参(Apostichopus japonicus)生长的影响,并应用PCR-DGGE技术分析了养殖水体和肠道细菌群落结构的变化。芽孢杆菌的泼洒浓度分别为106、108和1010cfu/m3(分别命名为BC6、BC8和BC10),每7d全量换水1次,以未泼洒芽孢杆菌处理为对照组2(CT2)。另外设置每隔3d全量换水1次的未泼洒芽孢杆菌处理作为对照组1(CT1)。8周的养殖实验表明,BC6处理组刺参的末体重显著高于2个对照组(P0.05),BC8和BC10处理组刺参的末体重显著高于对照组CT1(P0.05)。而BC6和BC8处理组的刺参特定生长率均显著高于CT1和CT2处理组(P0.05)。研究发现,刺参养殖水体中的优势菌群归属于α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)和疣微菌纲(Verrucomicrobiae),各处理水体中细菌群落结构明显不同,蜡样芽孢杆菌未能在养殖水体中形成优势菌群。刺参肠道内含物中优势菌群归属于α-变形菌纲、γ-变形菌纲、ε-变形菌纲、黄杆菌纲、拟杆菌纲和芽孢杆菌纲,以BC8和BC10处理组之间的相似度最高。芽孢杆菌纲(Bacilli)细菌在3个处理组刺参肠道内含物中成为优势菌群,并在BC6处理组成为第一优势菌群,而相对于CT2对照组,拟杆菌纲细菌相对丰度在3个处理组中显著下降。刺参肠道固定菌群的优势菌群归属于α-变形菌纲、γ-变形菌纲、黄杆菌纲和芽孢杆菌纲,相对于对照组CT1和CT2,3个处理组刺参肠道γ-变形菌纲的相对含量明显下降。相对于对照CT2,BC6和BC8处理组中芽孢杆菌成为第一优势菌群。黄杆菌纲细菌比例随芽孢杆菌添加量的增加而升高。本研究表明,水体中泼洒该芽孢杆菌制剂对水体和刺参肠道菌群结构均具有显著影响,在适宜的泼洒浓度下可以有效提高刺参的生长速度。     

皱纹盘鲍肠道菌群组成及PCR-DGGE 指纹图谱分析

对养殖和野生皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino )不同个体间肠道菌群数量和种类组成进行了研究, 并采用PCR-DGGE 指纹技术对比分析了二者肠道优势菌群的差异。研究结果表明, 养殖和野生皱纹盘鲍肠道好氧及兼性厌氧菌总数分别为(3.50±0.85)×10⁶个/g, (3.03±1.10)×10⁶个/g; 两组鲍鱼肠道优势菌基本相同, 均为弧菌属(Vibrio), 次优势菌均为玫瑰杆菌属(Roseobacter) 和希瓦氏菌属(Shewanella), 在养殖组中检测到芽孢杆菌属(Bacillus), 表明皱纹盘鲍对肠道细菌具有特异选择性。此外, PCR-DGGE 指纹图谱结果表明, 从养殖和野生皱纹盘鲍肠道样品分别获得14 条和12 条扩增条带,其中人工组中有2 条特异性条带; 二者相似性系数(戴斯系数)为92.31%。     

水产品鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)细菌多样性及优势微生物分析

为研究鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)在不同冻藏时期的优势微生物,并且得到一个较全面的细菌群落组成结构,采用16SrDNA基因克隆文库及克隆子分析等方法,分别对冻藏1d、8d和20d条件下鲐鱼鳃体系中的细菌种群多样性、优势微生物及其中产组胺菌的变化进行分析。结果表明,不同时期鲐鱼鳃内的细菌多样性均较强;冻藏1天的鳃体系中不动杆菌属(Acinetobacter)占优势为总数的77.5%,产组胺细菌如泛菌属(Pantoea)和肠杆菌属(Enterobacter)较少;第8天优势细菌种群是梭杆菌属(Fusobacteria bacterium)和希瓦氏菌属(Shewanella),而产组胺菌如发光杆菌属(Photobacterium)和弧菌属(Vibrio)较前期数量有所增加;冻藏到第20天的优势种群为哈夫尼菌属(Hafnia)和沙雷菌属(Serratia),它们均是产组胺的菌群。鲐鱼中细菌多样性及其优势微生物的变化等全面信息可为了解鲐鱼水产品组胺发生的微生物机制及其控制方法提供重要依据。     

中国对虾幼体致病菌哈维氏弧菌的分离及其生物学特性研究

于1996年4—5月,在青岛丰城地区一些对虾育苗场发生大规模爆发性传染病,主要感染中国对虾幼体,尤其是蚤状幼体。死亡率高达80％以上。从自然发病及人工感染患病濒死中国对虾幼体中分离出38株细菌,研究其形态特征,生理、生化特性及对中国对虾幼体的致病性。结果表明,38株分离物均为革兰氏阴性杆菌,菌体为杆状或短杆状,极生单鞭毛运动,不发光,氧化酶呈阳性,发酵葡萄糖产酸,TCBS平板上生长,菌落呈黄色或绿色,对弧菌抑制剂0／129（150g／ml）敏感,此均为弧菌属的典型特征,属于弧菌。其中26株细菌被归为同一类群,参照伯杰氏细菌学鉴定手册（1994年,第9版）鉴定表明,该菌同哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）最为接近;另外,Biolog系统鉴定表明也为哈维氏弧菌,因此定名为哈维氏弧菌。利用浸泡感染法以2．5×103—2.5×107cfu／ml浓度的细菌感染不同发育时期（无节幼体期、蚤状期、糠虾期和仔虾期）的中国对虾幼体。结果表明,该病原菌主要感染中国对虾幼体的无节幼体晚期、蚤状期和糠虾早期并导致其大量死亡,而在仔虾期感染死亡率较低,并且2．5×104cfu／ml以上浓度的病原菌即可导致蚤状幼体严重感染死亡,由此可见,所分离的致病菌对中国对虾蚤状期幼体具有较强的致病力。人工感染试验结果     

广东沿海香港牡蛎消化道异养菌统计及其耐药性研究

本研究针对高温时期(6月、9月)广东沿海地区的香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内异养细菌总数和弧菌总数进行了深入的调查,并由添加单种抗生素(分别是:庆大霉素、呋喃唑酮、利福平、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素、复方新诺明)的培养基中分离得到310个菌株。进一步采用纸片扩散法(kirby-bauer法)针对常见的抗生素对此310个菌株进行药敏测试,了解不同来源菌株的耐药状况。结果表明310个菌株分属48个不同种属,主要是肠杆菌(Enterobacter)、弧菌(Vibrio)、芽孢杆菌(Bacillus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella)、希瓦氏菌(Shewanella)、不动杆菌(Acinetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、短波单胞菌(Brevundimonas)、发光杆菌(Photobacterium)、黄杆菌(Tenacibaculum)、盐单胞菌(Halomonas)等。在9月份从牡蛎体内分离的异养细菌比6月份分离的异养细菌高出1～2个数量级(除台山外)。6月份从台山地区牡蛎分离的异养细菌数(2.6×10⁶...     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道潜在益生菌的筛选及对幼鲍生长的影响

采用体外实验筛选益生菌结合16SrDNA序列分析法,从124株不具有溶血作用的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道细菌中筛选得到5株潜在益生菌并进行了分子鉴定,进一步对5株潜在益生菌进行了安全性实验及体内饲喂实验。结果表明,2株具有拮抗哈维弧菌和灿烂弧菌能力的潜在益生菌分别被鉴定为Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65),一株产海藻酸酶和淀粉酶的潜在益生菌被鉴定为Vibrio sp.(WA51),产蛋白酶潜在益生菌被鉴定为Bacillus sp.(FA12),产琼脂酶潜在益生菌被鉴定为Tamlana sp.(FA86);安全性实验表明5株潜在益生菌在107cfu/ml下对皱纹盘鲍没有明显的毒害作用;通过体内饲喂实验发现,潜在益生菌WA64、WA65的复合作用能够显著提高幼鲍增重率和存活率(P<0.05),并在生产条件下能够明显降低幼鲍的死亡量。经抗生素敏感性实验,WA64菌株对15种抗生素均敏感或中度敏感,WA65菌株仅对庆大霉素和链霉素2种抗生素产生耐药。     

“海参-对虾”混养海水池塘的食物网结构及营养层级研究

The food sources of aquacultured Apostichopus japonicus and the trophic levels of organisms in a sea cucumber(A. japonicus) and prawn(Penaeus japonica) polyculture system in a saltwater pond in Zhuanghe, Liaoning Province were examined using carbon and nitrogen stable isotopes. Across organisms, δ13C ranged from(–25.47±0.20)‰ to(–16.48±0.17)‰(mean±SD), and δ15N ranged from(4.23±0.49)‰ to(12.44±0.09)‰. The δ13C and δ15N contents of A. japonicus, P. japonica and Fenneropenaeus chinensis were comparatively higher than those of other organisms. Values of δ13C and δ15N revealed that P. japonica, Hemigrapsus sanguineus and Neomysis japonica comprised the largest component of the diet of A. japonicus. The mean trophic level of the organisms in this saltwater pond polyculture system was(2.75±0.08). P. japonica, A. japonicus, F. chinensis,Synechogobius hasta and Neomysis japonica were in the 3rd trophic level(2–3); jellyfish, H. sanguineus and zooplankton were in the 2nd trophic level(1–2); and Enteromorpha prolifera, benthic microalgae, periphyton and suspended matter primarily consisting of phytoplankton, bacteria and humus were in the primary trophic level(0–1).     

粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4为哈氏弧菌(V. harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果：20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107 cfu/mL 的 bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明, bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。