Heterologous expression of acyl-ACP desaturase （FAB2） from Chlamydomonas reinhardi in Escherichia coli and its expres- sion features in response to different temperature and salinity stresses

脂肪酸去饱和酶（fattyaciddesaturase）是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶,催化脂肪酸链的特定位置脱氢形成双键,其通过引入双键调节脂肪酸不饱和度,以适应周围环境的变化。菜茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）质体酰基一酰基载体蛋白去饱和酶（plastidacyl—ACPdesaturase,FAB2）在△9位脱氢,催化脂肪酸中第1个双键的形成。本文首先在大肠杆菌中异源表达了FAB2,另外将其氨基酸序列与其他高等植物、微藻、真菌等进行了多序列比对以及系统进化分析,推测其与高等植物亲缘关系更近。利用定量RT-PCR技术研究了衣藻FAB2基因不同胁迫条件下的表达模式,结果表明4℃＋0％NaCl,25℃＋1％NaCl胁迫条件下FAB2基因表达量都有一定程度升高。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶是虾青素生物合成途径中关键酶之一,本研究通过基因枪法将克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt),转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中,经过含100mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析,证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT-PCR和RT-PCR Southern杂交分析,表明bkt在衣藻转化子中得到表达。     

不同营养方式下藻蓝蛋白对莱茵衣藻光合作用与生长的影响研究

藻蓝蛋白是光合蓝藻重要捕光天线藻胆体的主要组成部分,它能够帮助蓝藻吸收绿色光合生物难以利用的波长范围内的光,为了探究重组藻蓝蛋白对绿色植物光合作用的影响,本研究比较了在光合自养和混合营养两种营养方式下重组表达藻蓝蛋白的莱茵衣藻的光合作用与生长情况。结果表明：表达了藻蓝蛋白的莱茵衣藻中存在着从藻蓝蛋白到光合反应中心的光能传递。光合自养条件下,藻蓝蛋白能够显著促进莱茵衣藻的光合作用与生长;混合营养生长时,藻蓝蛋白也能够促进莱茵衣藻的光合作用,但效果不如光合自养条件下显著。     

南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE-L）谷胱甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化

采用RT-PCR技术克隆南极衣藻GR基因ORF全长cDNA,然后经酶切、连接等步骤构建其原核表达载体;并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行了优化,以期获得较大量的酶蛋白。结果表明,将构建的原核表达载体pET-GR导入大肠杆菌BL21,可以高效表达融合蛋白;且表达的蛋白均以包涵体的形式存在;经SDS-PAGE电泳...     

别藻蓝蛋白β亚基基因在莱茵衣藻中重组表达及其对光能传递的影响研究

为了探究别藻蓝蛋白与类囊体膜光合系统之间的光能传递规律,及其与异源类囊体膜光合系统之间光能转移的可能性,本研究构建了含有钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),及合成藻蓝胆素的血红素氧化酶基因(ho)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的转化载体pHyg3-apcB-ho-pcyA,利用玻璃珠转化法将其导入莱茵衣藻中。聚合酶链式反应筛选验证阳性转化藻株,Southern Blot结果表明基因apcB、ho、pcyA成功转化入莱茵衣藻基因组中。而后将转化藻株与对照藻株均置于高光(50μmol·m^-2·s^-1)和低光(25μmol·m^-2·s^-1)条件、白光和绿光条件中培养,并检测别藻蓝蛋白β亚基的表达、总叶绿素含量、77 K低温荧光、光系统表观电子传递效率、生物量变化。结果显示：实时定量PCR分析和Western Blot检测表明外源基因apcB,pcyA和ho均在转基因藻株Cr-ApcBHP中得到了转录表达。高光和低光条件下光系统Ⅱ(PSⅡ)和光...     

荧光定量PCR方法分析皱纹盘鲍HSP70在温度胁迫下的表达

根据皱纹盘鲍(Haliotis discus hannaiIno)HSP70和Actin mRNA序列,设计合成引物,建立了皱纹盘鲍HSP70的荧光定量PCR技术平台,并用于检测皱纹盘鲍在热激处理后不同恢复时间HSP70的转录水平变化。结果表明在热诱导后,肌肉组织HSP70的表达呈时间依赖性,存在先升高后降低的趋势,在热诱导后2h,肌肉HSP70基因的表达量明显升高,是对照组(0h)的15倍,随后HSP70的表达量继续升高,在诱导后12h达到最高值,是对照组的21倍。然后表达量开始回落,至热诱导后96h,HSP70表达量降至初始值,表现出一种瞬时表达的趋势。     

真蛸FAXDC2基因的克隆及其表达分析

FAXDC2(fatty acid hydroxylase domain-containing protein 2)是脂肪酸羟化酶家族中的成员,在脂肪酸的合成与代谢中发挥重要功能。真蛸(Octopus vulgaris)是中国南方近海的经济种类,为了研究饥饿对真蛸FAXDC2(OvFAXDC2)基因表达的影响,本研究从课题组真蛸转录组数据库中筛选获得OvFAXDC2基因序列。采用从头至趾方法进行验证,最终获得OvFAXDC2的cDNA全长序列共1384 bp。它包含100 bp的5′非编码区(UTR)、228 bp的3′UTR和1056 bp的开放阅读框(ORF), ORF共编码351个氨基酸,预测其分子量为3.98 kDa,理论等电点为8.93。系统进化树分析显示,真蛸和加州双斑蛸(O. bimaculoides)聚为一支,而与其他无脊椎动物分开。实时荧光定量PCR分析表明, OvFAXDC2在消化腺中表达量最高,在鳃和鳃心中次之。在幼体饥饿试验中,随着时间的推移, OvFAXDC2表达量先升后降,在第三天达到最高,表明OvFAXDC2表达量的变化趋势可作为幼体代谢是否正常的一个指标。     

海产花鲈IGFBP-1、2基因的克隆及表达分析

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆得到花鲈的IGFBP-1和IGFBP-2基因cDNA全长序列,IGFBP-1全长1 779bp,编码248个氨基酸,IGFBP-2全长815bp,编码267个氨基酸。花鲈的IGFBP-1和IGFBP-2氨基酸序列同其他硬骨鱼类一样都包括C-端结构域、N-端结构域和多变的中央L-结构域。二者均存在18个保守的半胱氨酸残基以维持氨基酸二级结构的稳定,同时也都拥有N-端结构域的CGCCXXC-box和C-端结构域的CWCV-box,它们都是与IGF配体结合的重要结构。此外,IGFBP-2的C-端结构域还存在一个RGD结构,它能够与整合素相互作用,介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的黏附作用。利用荧光实时定量PCR技术对花鲈的脑、垂体、心脏、鳃、胃、盲肠、肠、头肾、肾脏、肝脏、性腺(雄)、脾脏和肌肉这13个组织的IGFBP-1和IGFBP-2mRNA的相对表达水平进行分析。结果显示,花鲈IGFBP-1mRNA表达量较为广泛,在肝脏中的转录水平最高,在肌肉和脾脏有较多的表达。花鲈IGFBP-2mRNA仅在肝脏中的表达水平最高,在肌肉中表达水平较高,其他组织表达量较低。     

LPS胁迫下五个群体菲律宾蛤仔TYR基因在鳃和肝胰腺中表达特性研究

为了解TYR基因与蛤仔免疫的关系,本实验利用荧光定量PCR技术研究了菲律宾蛤仔五个群体(白蛤、白斑马蛤、斑马蛤、养殖和野生群体)的鳃组织和肝胰腺组织在LPS胁迫下TYR基因在不同时间(0 h、3 h、12 h、24 h、48 h)的表达特性。结果表明,在LPS注射后鳃组织中TYR6基因表达水平在白蛤和白斑马蛤3 h、6 h、12 h,野生蛤仔3 h,斑马蛤3 h、6 h,养殖群体6 h、12 h显著上调(P<0.05),3h野生蛤仔和斑马蛤达到峰值, 6 h白蛤、白斑马蛤、养殖群体达到峰值(P<0.05);在肝胰腺中,养殖群体和白斑马蛤6 h,白蛤6 h、24 h,野生群体24 h,斑马蛤3 h显著上调, 3 h野生蛤仔和斑马蛤达到峰值,6h养殖群体、白蛤、白斑马达到峰值(P<0.05);鳃组织中TYR10基因表达水平在白蛤、野生群体和白斑马蛤3 h,养殖群体3 h、6 h,斑马蛤3 h、12 h显著上调(P<0.05),肝胰腺组织中TYR10基因表达水平在白蛤3 h,野生群体3 h、6 h、12 h,斑马蛤、养殖群体6 h显著上调(P<0.05),推测T...     

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库, 利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列, 并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明, 泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp, 开放阅读框为708bp, 编码236个氨基酸; 蛋白结构预测显示, Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域, SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成, SH3结构域主要由β-折叠片组成, 具备典型的结构特征; 氨基酸序列比对发现, Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%, 而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示: Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达, 而在血液中的表达量极显著地高于其它组织; 在泥蚶的不同发育阶段中, Tg-GRB2 mRNA在 2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量, 而在D形幼虫中表达量最高, 表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。     

企鹅珍珠贝Creb2基因的克隆及表达分析

CREB(cAMP response element binding protein)是一种真核生物中广泛存在的调控因子。为了探讨企鹅珍珠贝(Pteria penguin)Creb基因的序列和表达特征,为进一步阐述Creb的生理功能提供科学依据,本研究利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝一个Creb基因的全长序列,分析其理化性质和进化地位;利用荧光定量PCR分析Creb基因在各组织中的表达特征。结果表明,该企鹅珍珠贝Creb基因的c DNA全长为1484 bp,其中开放阅读框(ORF)为1071 bp,编码356个氨基酸,5′非编码区为218 bp,3′非编码区为195 bp,C端包含一个碱性亮氨酸拉链结构(basic region leucin zipper,b ZIP)。预测其分子质量为39.49 k D,等电点为4.43。序列比对显示该企鹅珍珠贝Creb基因与欧洲平牡蛎(Ostrea edulis)和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的Creb2同源性(identity)最高,分别为46.3%和46.1%,故命名为pp Creb2;系统进化树分析结果与传统形态学分类结果相吻合。荧光定量PCR分析显示,pp Creb2在企鹅珍珠贝的各个组织中组成性表达,其中在足中表达量最高,鳃中其次。     

中国明对虾TOR 基因的克隆及精氨酸、亮氨酸对其表达的影响

首次从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensiss)肌肉组织中克隆得到TOR基因的cDNA,全长共7 638 bp,开放阅读框7 389 bp,编码2 462个氨基酸。氨基酸序列比对和结构域分析均证实其为目前已知的TOR激酶的同源蛋白。应用实时定量PCR的方法研究TOR在中国明对虾中的组织分布特异性,以及注射等浓度的亮氨酸和精氨酸后,肌肉组织中TOR mRNA表达水平在3,6,12,24 h的变化,探讨营养水平对TOR基因表达的影响。结果显示,注射亮氨酸和精氨酸24 h的对虾TOR mRNA表达量是对照组的3~4倍,显著升高(P0.05),证实氨基酸对TOR的表达具有调节作用。     

施氏鲟Asnanos1基因序列分析及其在雌雄不同组织中表达

本研究首先从施氏鲟(Acipenser schrenckii)性腺转录组中获得nanos1(Asnanos1)基因全长c DNA,并对其序列的准确性和特征分别进行PCR验证和生物信息学分析。进一步利用荧光定量RT-PCR技术检测Asnanos1基因在雌、雄施氏鲟的性腺、心脏、鳃、脑、肾、肝脏、脾脏等组织中的表达量。利用荧光定量RT-PCR技术检测Asnanos1基因在雌、雄施氏鲟的性腺、心脏、鳃、脑、肾、肝脏、脾脏等组织中的表达量。结果显示:Asnanos1的c DNA全长为1 389 bp,其中,5′非编码区(UTR)为414 bp,3′UTR为279 bp,ORF为696 bp。该基因共编码231个氨基酸。Asnanos1基因在施氏鲟除心脏以外的各组织中均有表达,在雌、雄鱼的鳃、脑、肾、肝脏、脾脏等组织中表达量无显著差异,但在卵巢中的表达量显著高于其他各组织(P0.05)。所得到的结果可为人工培育全雌施氏鲟苗种提供一些基础资料。     

海带磷酸甘露糖变位酶(PMM)基因的克隆与表达分析

磷酸甘露糖变位酶(PMM)是褐藻胶和岩藻聚糖合成过程中的关键酶之一。本研究利用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得2条海带PMM基因(Sjpmm1,Sjpmm2)序列。其中,Sjpmm1的开放阅读框(ORF)长759 bp,其编码的Sj PMM1为卤酸脱卤酶(HAD)超家族成员,含252个氨基酸,分子量约为28.51 k Da;而Sjpmm2的ORF长1866 bp,其编码的Sj PMM2属于磷酸己糖变位酶超家族的成员,含621个氨基酸,分子量约为66.49 k Da。海带PMM的二级结构均以?-螺旋为主。进化分析表明,Sjpmm1来自于原始真核生物,而Sjpmm2来源于质体的第一次内共生作用。实时定量PCR分析发现,海带受到高温或低温胁迫时,Sjpmm1和Sjpmm2转录水平上升,以合成岩藻聚糖抵抗环境影响。此外,利用p MAL-c5X载体对Sj PMM1进行体外表达,得到高浓度的可溶性融合蛋白,为后续的Sj PMM功能分析提供基础。     

海蜇dmrta2基因的克隆及其在横裂生殖中的表达分析

Dmrt基因家族在后生动物性别决定与分化以及组织和器官的形成等发育过程中发挥着重要作用。为探究dmrt家族基因在海蜇(Rhopilema esculentum)横裂生殖中的功能,本研究以海蜇转录组测序获得的dmrta2基因片段为基础,通过RACE技术获得了海蜇dmrta2基因的cDNA全长,并分析了其在横裂生殖不同时期的表达模式。结果显示海蜇dmrta2基因cDNA全长为1 804 bp,开放阅读框为1 011 bp,所编码蛋白质含336个氨基酸,分子质量为37.25 kDa,理论等电点为9.11。预测海蜇dmrta2编码蛋白为亲水性蛋白质,无跨膜区域,不含信号肽。在33至79位氨基酸之间具有dmrt基因家族保守的DM结构域,与珊瑚、果蝇等物种的同源基因相应区域高度一致。系统进化分析显示,海蜇DMRTA2与鹿角珊瑚DMRTA2和DMRT3以及海葵DMRTA2的亲缘关系最近。原位杂交显示dmrta2基因在海蜇横裂生殖后期主要表达于感觉缘叶原基位置,在初生碟状体中表达于感觉棍位置。研究结果表明,dmrta2基因参与海蜇横裂生殖过程,可能主要与感觉棍神经系统的分化发育相关,研究为进一步解析海蜇等钵水母横裂生殖的分子调控机制提供了基础数据。     

刺参真核翻译起始因子基因(eif2s1)的cDNA 克隆及表达分析

夏眠是刺参(Apostichopusjaponicas)应对夏季高温低氧等不良环境的重要生存策略,而抑制高耗能的蛋白合成则是夏眠期机体有效降低能耗的重要环节。真核翻译起始因子eIF2是启动蛋白翻译的关键因子,在蛋白合成调控中发挥了重要作用。本研究克隆分析了刺参翻译起始因子eIF2α亚基(eif2s1基因)全长cDNA序列及结构特征,并测定了其在夏眠期间的时空表达模式。结果表明:刺参eif2s1基因序列较保守,与紫海胆该基因同源性最高。同时,刺参eif2s1基因在深度夏眠期组织中出现了不同程度的表达抑制,可能参与了刺参夏眠蛋白抑制调控。     

缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表达分析

克隆得到缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2（Sc-Nramp2）基因的cDNA全长序列3 681 bp,该基因的开放阅读框有1 776 bp,编码591个氨基酸,预测分子量为65.86 kDa;其结构具有Slc11蛋白家族的典型特征,包括有10个典型的跨膜结构和2个糖基化位点。Sc-Nramp2基因3'-UTR有2个类似于脊椎动物Nramp2中铁反应控制蛋白结合位点;同源性分析表明,Sc-Nramp2和太平洋牡蛎Nramp2-like的同源性最高为71.6%。实时荧光定量PCR结果表明,Sc-Nramp2基因在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鳃6个组织中均有表达,其中肝胰腺中的表达量最高,其次是鳃,与其他组织均有极显著性差异（P<0.01）;注射副溶血弧菌后,肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表达量较对照组显著上调（P<0.01）,且表达量呈现先上升后下降的趋势,在12 h时达到最大表达量,推测Sc-Nramp2基因参与了缢蛏非特异性免疫应答反应。