大黄鱼病原弧菌拮抗菌筛选

用平板涂布法从集美海边分离到381株细菌,用平板划线法或点种法检验这些海洋细菌对两株病原弧菌(副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的拮抗作用。从中挑选2株对海水养殖动物病原弧菌有较好拮抗作用的细菌,编号为GX75和GZ46。对拮抗菌(GX75和GZ46进行了抗菌谱测定,结果表明,GX75对9株指示菌中的副溶血弧菌、河流弧菌和坎普氏弧菌有较好的拮抗作用,GZ46对副溶血弧菌、溶藻弧菌和坎普氏弧菌有较好的桔抗作用。在营养肉汤中,测定了GX75和GZ46的抗菌作用,表明(GX75和GZ46对副溶血弧菌拮抗作用很明显。     

一株海洋拮抗菌的分离鉴定及其培养特性研究

从青岛近海采取的扇贝中分离到1株对多种细菌具有拮抗作用的海洋细菌SA10,根据16SrDNA序列及常规生理生化反应鉴定为Pseudoalteromonas ruthenica.以15种弧菌、嗜硫小红卵菌(Rhodoulum sulfidophilum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)为供试菌株,分别采用平板点种法及杯牒法测定了SA10菌株及其发酵液对指示菌的抗菌活性及抗菌谱.通过测定SAl0的生长曲线和产抗菌物质曲线对其生长特性进行了初步的研究.结果表明:该菌生长周期约为5d,其中延迟期相对较短,培养14h后进入对数生长期,36h开始产生抗菌物质,在56h左右,菌液的光密度达到峰值,60h之后即进入生长稳定期,72h抗菌活性最高,以后抗菌活性逐渐降低直至120h几乎消失.用超滤法根据不同的分子重分离SA10的抗菌物质,得到的抗菌物质分子量在10000Da以上.     

来自大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定

采用点种法并以副溶血弧菌(Vp1.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)为弧菌指示菌,对从健康的大黄鱼肠道内分离的115株细菌进行体外拮抗试验。并对筛选出的拮抗菌进行抗菌谱测定,最后利用VITEK-32细菌快速鉴定系统和16SrRNA基因序列对拮抗菌进行鉴定。结果表明,从中筛选到3株有较强拮抗作用的菌株,编号分别为X1402-1、X1108和X3914,且菌株X1402-1的抗菌作用最强,抗菌谱最广,21株病原指示菌中,对16株均能产生较强的抑制作用,其中对Vp-1.2164的抑菌直径最大,达到28.5mm,对Va-Y的抑菌直径为8.7mm;其次为菌株X1108和X3914,对两种指示弧菌的抑菌直径分别为:12.0mm、9.0mm和0mm、7.2mm。经VITEK-32细菌快速鉴定系统鉴定,3株拮抗菌分别与铜绿假单胞菌,恶臭假单胞菌,地衣芽孢杆菌的相似性均为99%。通过16SrRNA基因序列分析表明,3株拮抗菌分别与类产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes(EU419918)、恶臭假单胞菌Pseudomon asputida(FJ440105)和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis(DQ988136)的16SrRNA基因同源性最高,分别为100.0%、97.5%、99.0%。综合分析试验结果,X1402-1、X1108和X3914分别被确定为类产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌和地衣芽孢杆菌。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

大黄鱼病原副溶血弧菌拮抗菌的筛选

用点种法从大黄鱼肠道优势菌群中筛选出104株病原性副溶血弧菌的拮抗菌,进一步研究拮抗效果最好的11株拮抗菌的抗菌谱和生长曲线,其中NAC平板上筛选的4株拮抗菌的抗菌范围较广,锰营养琼脂培养基上筛选的3株拮抗菌具有生长优势。用BIOLOG板测定了抗菌谱较广、有一定生长优势3株拮抗菌(R22,Y58和J312)的碳源利用情况,结果表明,3株拮抗菌的碳源谱都比较广,都能利用糖类、有机酸和氨基酸等,而且与鱼类营养的竞争较小。16S rRNA基因同源性分析的结果显示与R22,Y58,J312同源性达99%以上的菌株分别来自弧菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属。进一步对R22,J312和Y58三株拮抗菌进行生化鉴定,结果显示R22为溶藻弧菌,J312为荧光假单胞菌,但Y58的种属未能得到确认。所得到的3株拮抗菌R22,Y58,J312在拮抗病原菌、抗菌谱、生长特性和营养利用等方面都初步满足益生菌的筛选条件,有待进一步检测其安全性和实用效果以便能够成为能实用的益生菌。     

一株生防细菌LHB02的筛选、鉴定及其发酵条件优化(英文)

从中国福建沿海某一污染滩涂的沉积物中筛选到一株具有较强拮抗水产病原菌的生防细菌LHB02。采用通用引物,对LHB02的16SrRNA片段进行扩增,获得1511bp的DNA系列,基于该DNA系列,结合细菌形态学、生理生化特征,鉴定LHB02为一株枯草芽孢杆菌。对LHB02进行了抗菌试验、抗菌谱检测和发酵条件优化研究,结果表明,LHB02对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等有很强的拮抗作用,其优化后的发酵条件为:KB培养基(蛋白胨20g,丙三醇10mL,K2HPO41.5g,MgSO4.7H2O1.5g,H2O1000mL);温度28°C,pH值7.0,培养时间36h,接种量1.5%。     

一株海洋拮抗菌D-2的筛选及其发酵条件初探

从西沙海域水样中分离了72株细菌,以副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus13150为病原指示菌,筛选到1株具有较好拮抗作用的海洋细菌,经形态观察、生理生化和16Sr DNA测序鉴定为居幼虫普罗威登斯菌(Providencia vermicola),编号为D-2,此菌在NCBI的登录号为KJ660957。同时,通过卤虫浸泡实验和药敏试验检测该菌的安全性,并初步优化其发酵条件。结果表明,D-2对杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌等有拮抗作用;其对卤虫的72 h半致死浓度(LC50)为108CFU/m L,而副溶血弧菌V.parahaemolyticus对卤虫的72 h LC50为105CFU/m L;此外,药敏试验说明该菌只对20种常规抗生素中的卡那霉素、诺氟沙星2种产生抗性,其余的18种抗生素表现敏感性;优化后的发酵条件为:温度25℃~37℃,p H 7.0,盐度4%。该菌作为一种新的益生菌,有望应用于海水养殖病害控制。     

南麂岛海洋沉积物中抗大黄鱼(Pseudosciaena crocea)致病弧菌的放线菌分离和筛选研究

采用平板涂布法从南麂岛近海海洋沉积物样品中分得86株放线菌,用琼脂块法和杯碟法结合筛选出对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)两种大黄鱼病原性弧菌具有不同拮抗作用的海洋放线菌5株,其中编号NJR0956的菌株对两种致病菌的抑菌圈直径均25mm,表现出较强的抑制作用;进而测定了5株活性菌株的抗菌谱。结果表明,它们对指示菌中的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)四种病原弧菌均具有较好的拮抗作用;在对NJR0956的抑菌效果研究中发现,该菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中不仅能够增殖,而且能够有效地抑制病原菌的生长。     

一株海洋生境芽孢杆菌FA08的筛选、鉴定及其酶学特性和抗菌性能分析

利用生防细菌拮抗病原菌,是水产疾病防治的有效措施之一。本研究从福建省宁德市海水养殖区底泥筛选到一株既能产纤维素酶又具有拮抗水产病原菌功能的芽孢杆菌FA08,通过传统的形态学、生理生化鉴定手段,并结合16S r DNA序列分析,鉴定功能菌FA08为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,Gen Bank登录号:KM892857)。进一步考察功能菌FA08菌株所产的纤维素酶对p H值、温度和紫外线的敏感性发现,功能菌FA08所产纤维素酶对酸碱度具有很强的耐受力,p H 3至p H 10范围内保持稳定,对温度也有较好的稳定性,在30—80°C范围内,其酶活仍达到70%,对紫外线不敏感。对FA08的抗菌性能进行分析,结果发现,功能菌FA08发酵上清对嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌有拮抗效果。因此,该菌对未来水产业具有良好的开发应用价值。     

生防细菌K2-1对大菱鲆病原菌的抑制作用及其抗菌特性分析

为探讨生防细菌应用于水产养殖动物细菌病防治的可行性,作者从厦门市海沧港口污泥中筛选到一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)K2-1,利用琼脂扩散法发现其发酵上清对大菱鲆(Scophthalmus maximus)养殖常见致病菌——副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus))有较强拮抗作用。进一步分析抗菌物质的部分特性,结果显示,蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)K2-1发酵产生的抗菌物质含有蛋白(肽)类成分,该抗菌物质具有一定的耐热性,其在温度40~70℃的条件下保持较好的抑菌效果,对酸碱度也有很强的耐受力,pH在3.0~9.0范围内,活性降低少于15%,对紫外线不敏感,对胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶也不敏感,但对蛋白酶K敏感。从实验结果可以初步确定该菌具有较好的开发价值。     

大黄鱼病原弧菌拮抗放线菌的筛选与人工诱变

从厦门集美海滩底泥分离得到38株放线菌，用琼脂块法测定它们对大黄鱼病原弧菌-溶藻弧菌和副溶血弧菌的拮抗效果，选择两株拮抗效果较好的放线菌进行诱变，测定诱变后各菌株的抗菌效果，并选择抗菌效果较好的菌株进行第二次诱变，如此反复诱变3次，共得到97株放线菌，结果表明；38株放线菌中的22株对两株病原菌有一定的拮抗作用；用紫外线照射可以获得少量对两株病原菌拮抗作用加强的菌株。     

纳米银对青岛近海浮游细菌活性的影响研究

纳米银广泛用于抗菌材料、医疗设备和其他抗菌产品。在纳米银产品的生产、运输、消费和处置过程中,纳米银将不可避免地释放到自然环境中,而水生生态系统是纳米银在自然界中重要的汇之一。本文以青岛近海为研究对象,采集现场海水进行实验室模拟培养,通过测定(48 h)不同浓度纳米银(0.5、5和50 mg/L)短期暴露下对表层海水中浮游细菌死亡率、蛋白质含量、碱性磷酸酶活性及氨肽酶活性的变化,研究纳米银对近岸海区浮游细菌生长和活性的影响。研究结果表明,在纳米银胁迫下细菌生长和活性受到显著抑制(P<0.05),高浓度组在培养4 h后死亡率达到最高值88.20%,随着暴露时间延长,纳米银胁迫组活细菌数量缓慢恢复、死亡率逐渐减小;纳米银对碱性磷酸酶活性和氨肽酶活性的抑制效应分别在培养4和8 h后达到最高,分别为8.58%和32.55%,在培养16 h后,酶活性开始缓慢上升,表现出对纳米银胁迫的适应性;纳米银组的蛋白质含量在培养8 h后达到最低,相比于对照组降低了29.80%,在培养后期同样有所升高,蛋白质含量接近于对照组。由此可见,纳米银对青岛近海浮游细菌的生长和活性都具有显著的抑制效应;不同浓度纳米银对细菌的抑制效应不同,纳米银浓度越高,抑制效应越明显(P<0.05),具有明显的浓度梯度效应;在培养后期,碱性磷酸酶活性和氨肽酶活性都有恢复,蛋白质含量上升,细菌死亡率下降,表明细菌对纳米银胁迫表现出一定的适应性。     

4株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定

采用体外拮抗试验的方法,先从不同生长阶段的对虾肠道中分离的96株细菌中筛选出4株对病原菌（鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌）有拮抗作用的细菌;进一步通过固体扩散法和液体混合法确定LV060806、LV060808的产物对鳗弧菌有明显抑制作用,Lv060806、LV060815的产物对副溶血弧菌有明显抑制作用,LV060810、LV060815的产物对哈维氏弧菌有明显抑制作用。溶血试验证实这些菌株不产生溶血素,不具有潜在的致病性;动物安全性实验证实菌株浓度在10^6 cfu／ml以下对实验对虾无明显的毒害作用。随后测定了其16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,结合菌株表型特征和生理生化特性最终鉴定结果为：LV060806、LV060808为Vibrio natriegens;LV060810、LV060815为V.alginolyticus。     

对虾病原菌抑菌药物的研究

应用药敏纸片法研究了48种化学疗剂对中国对虾红腿病病原菌(包括Vibrio alg-inolyticus,V.campbellii,V.parahaemolyticus,Proteus vulgaris及未确定的海洋弧菌)生长的抑制作用,其中氯霉素(30μg/片)、磺胶药+TMP(25μg/片)和呋喃妥因(200μg/片)抑菌力最强、抑菌谱最广;红霉素(15iu/片)、土霉素(30μg/片)无明显抑菌作用。对27种中草药水浸液以平板点种法试抑菌作用。结果表明乌梅、石榴皮、五味子的水浸液具有较强的抑菌活性,可用于配制防病药物饵料。5,7—二氯-8-羟基喹啉对多种病原菌有较强的抑菌作用,药物平板点种法最小抑菌浓度为25mg/L,药浴法有效抑菌浓度低于5mg/L。     

大米草中生物活性物质的筛选

大米草(Spartina anglica)是一种资源丰富的盐沼植物，目前已在中国沿海大量分布，综合开发利用大米草具有重要的生态意义和经济效益。利用硅胶柱层析方法分离大米草甲醇提取物，再分别用DPPH法、纸碟法和MTT法对大米草中40多个组分进行了抗氧化、抗细菌和抗肿瘤活性的筛选。结果得到抗氧化活性组分5个、抗菌活性组分2个、抗肿瘤活性组分3个。目前对其活性先导化合物的分离纯化研究正在进行中。     

注射生物胺对凡纳滨对虾免疫指标的影响

研究了注射生物胺(多巴胺、5-羟色胺)对凡纳滨对虾Litopenaeus vanna mei免疫指标的影响。结果表明,注射生物胺(10-9mol.尾-1)对凡纳滨对虾血细胞数量、血淋巴酚氧化酶活力、溶菌和抗菌活力影响显著(p<0.05),而对照组各免疫指标无明显变化;在实验时间内,注射生物胺处理组各免疫指标呈明显峰值变化,血细胞数量均在3h达到最小值,血淋巴酚氧化酶活力和溶菌、抗菌活力均分别于6h时达到最大值和最小值,且多巴胺处理组各免疫指标比5-羟色胺处理组变化更明显,其中大、小颗粒细胞和血淋巴酚氧化酶活力在12h后保持稳定,总血细胞和透明细胞数量18h后趋于稳定,血淋巴溶菌和抗菌活力在24h后稳定,而且稳定后各免疫指标与对照组均无显著差异。     

皱纹盘鲍经诱导后血淋巴中一些因子变化的研究

于１９９５年１１月在山东荣城大鱼岛鲍养养殖厂采集皱纹盘鲍，以大肠杆菌，弧菌为诱导物，将鲍分为三组分别进行注射，在注射后的５，１８，３２，５０ｈ分别取鲍血淋巴，测定其抗菌，溶菌，酚氧化酶和超氧化物歧化酶活力，并研究注射组各项活力的变化规律。实验结果表明，适当的刺激可增加皱纹盘鲍的抗病能力。     

虾夷扇贝育苗阶段幼体细菌性病原的确定

本研究确定了獐子岛集团虾夷扇贝Patinopecten yessoensis育苗过程中幼体大规模死亡的病原菌。采用TCBS培养基从患病幼体中分离弧菌,其数量为1.12×10⁴ CFU/g,以V1菌株和V2菌株为优势菌,占总弧菌数的64.3%和32.1%。用血琼脂平板测定V1菌株和V2菌株的溶血性,2株菌分别呈β溶血和α溶血。用2株菌分别感染扇贝幼体,幼体的死亡率显著高于对照组(P<0.05),症状与自然状态下的发病症状一致,并且从感染死亡的幼体中分离到原感染菌株,确定V1菌株和V2菌株是造成扇贝幼体大规模死亡的病原菌。对2株病原菌进行致病基因分析,结果发现V1菌株含有胞外金属蛋白酶基因。经16S rRNA基因测序分析,V1菌株(GenBank登录号KR232924)和V2菌株(GenBank登录号KR232925)与Vibrio splendidus ctt 31/5 和 Vibrio tasmaniensis 007的相似度分别为99.9%和99.2%。用药敏纸片扩散法检测病原菌对常见抗生素的敏感性,结果表明利福平、氟苯尼考和磺胺异恶唑均能有效抑制病原菌的生长。     

中国对虾血淋巴抗菌活力的测定

采用溶藻胶弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、副溶血弧菌（Ｖ． ｐａｒａｈａｅｍ ｏｌｙｔｉｃｕｓ）、哈维氏弧菌（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）、嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍ ｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）对中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）血浆样品、血细胞溶解物（ＨＬＳ）样品的抗菌活力进行了测定。表明中国对虾血浆样品对四种细菌均表现出一定的抗菌活力。其中,三种弧菌活细胞数在孵育１ｈ 时呈现最低;嗜水气单胞菌活细胞数在孵育４ｈ 时最少。在三种弧菌中,血浆样品对哈维氏弧菌表现出的抗菌活力最强,而对副溶血弧菌表现出的抗菌活力最弱。血细胞溶解物样品对三种弧菌几乎没有表现出抗菌活力;嗜水气单胞菌在与血细胞溶解物样品孵育２ｈ 时,其活细胞数呈现最低,说明血细胞溶解物样品对该菌表现出了一定的抗菌活力。由此显示,抗菌活力在中国对虾血浆样品中表现得较强,而在血细胞溶解物样品中表现得较弱,血淋巴抗菌因子可以在短时间内对细菌表现出其最强的活力,但对不同种细菌其抗菌作用强弱不同。