间接免疫荧光抗体技术检测活的非可培养状态的副溶血弧菌

副溶血弧菌 (Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ)是在海洋及盐湖环境中分布极为广泛的一种致病性嗜盐细菌 ,一般在冬季用常规方法不易将其检出［１］,并且在冬季的暴发频率和发病水平都远远低于夏季。Ｗｏｌｆ和Ｏｌｉｖｅｒ于１９９２年 ,Ｊｉａｎｇ等［３］均发现副溶血弧菌在低温贫营养的条件下可进入活的非可培养状态 (ＶｉａｂｌｅＢｕｔＮｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅＳｔａｔｅ,ＶＢＮＣ),即细菌处于不良环境条件下 ,细胞缩成球形 ,用常规方法培养不能使其生长繁殖 ,但仍然是活的一种特殊存活形式［１］。作者在对副溶血…     

用PCR方法快速检测水产品中的副溶血弧菌

建立了水产品中副溶血弧菌快速,敏感,特异的PCR检测方法;选择的引物具有良好的副溶血弧菌的种特异性,对人工污染在冷冻水产品中副溶血弧菌的检测低限是12-21CFU/10g,对其增菌液的检测低限是7600-9100GFU/ml。每PCR反应体系的检测低限为91-109CFU,对400份自然污染样品的检测结果显示,PCR方法的检测结果同常规培养法的结果完全相符。     

中国对虾弧菌病的间接荧光抗体诊断技术研究

于１９９４年８月－１９９５年５建立中国对虾病原菌－副溶血弧菌的间接荧光抗体检测技术，其中副溶血弧菌的特异抗血清由家兔制备，羊抗兔免疫球蛋白用异硫氰酸荧光素标记，并以罗丹明标占血清白蛋白为背影染色。     

大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测

用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24～36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为107～108CFU/mL形成生物膜的量最大;在30℃,NaCl浓度为3%～5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD590值最大;C 2a+促进副溶血弧菌生物膜的形成,而M 2g+抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24~36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为10⁷~10⁸CFU/mL形成生物膜的量最大;在30 ℃,NaCl浓度为3%~ 5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD₅₉₀值最大;Ca²⁺ 促进副溶血弧菌生物膜的形成,而Mg²⁺ 抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

副溶血弧菌胶体金快速检测试纸的研制及应用

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海水养殖动物弧菌病的主要病原菌之一。为实现对该菌的现场快速检测,本文以制备的兔抗副溶血弧菌多克隆抗体作为金标抗体,提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌蛋白,以不同浓度的4种抗原蛋白作为4条检测线(T1~T4),特别在T4线设置全菌蛋白,基于竞争免疫层析原理研制出副溶血弧菌胶体金快速检测试纸。使用该试纸检测了副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri),检测结果表明其能够准确鉴别副溶血弧菌感染,排除其他菌的交叉反应干扰。副溶血弧菌快速检测试纸的最低检测限为5×105 cfu·mL^-1,感染副溶血弧菌的牙鲆组织的检测结果与ELISA结果一致。本文研制的试纸具有较高的特异性与准确性且操作简单,为现场快速检测副溶血弧菌提供了有力工具。     

检测海洋弧菌的酶联免疫吸附试验研究

研究建立中国对虾病原菌┐副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）的间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）快速检测技术。间接ＥＬＩＳＡ技术中的副溶血弧菌的特异抗血清由家兔制备，羊抗兔ＩｇＧ用碱性磷酸酶标记，酶的底物为对磷酸基硝基苯。将该技术标准化后，测定了抗血清与１３株其它副溶血弧菌菌株及２９株其它弧菌标准菌株的交叉反应，并进行了苗期对虾样品中副溶血弧菌的检测     

溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测

建立了大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体检测方法，溶藻弧菌的特异性抗血清由新西兰兔制备，试管凝集法测定抗血清及交叉反应效价，吸附离心法去除交叉反应，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白，现场检测对具典型弧菌病表症大黄鱼病原检出率为100％，表观健康大黄鱼病原检出率为30％，养殖海水检测结果均为阴性，结果表明，间接荧光抗体检测法不仅可以用于已感染发病大黄鱼的快速检测，而且还能用于已感染未发病大黄鱼的检测。     

间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMP1快速检测中的应用

以大菱鲆(Scophthalmus maximus)出血症的病原菌——鳗弧菌(Vibrio anguillarum)SMP1为抗原,制备兔抗血清,测定了抗血清的工作浓度和对抗原的特异性,建立了在大菱鲆肝肾组织中检测SMP1的间接ELISA方法。SMP1人工感染大菱鲆,用建立的间接ELISA对大菱鲆肾脏和肝脏进行检测,结果肾脏的阳性检出率为87.7%,肝脏的阳性检出率为90%。该方法的建立有助于快速准确地鉴定由SMP1引起的大菱鲆疾病。     

文蛤稚贝盐度适应性的研究

在室内条件下,观察不同海水盐度对文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)稚贝存活及生长的影响,并将168h50%死亡的盐度作为适宜生存临界盐度,将增长率30%时所对应的盐度作为适宜生长临界盐度。结果表明:在稚贝体重(13.07±3.4)mg、壳长(3.46±0.35)mm、壳高(3.16±0.30)mm,水温27.4℃～29.1℃,pH值7.8～8.2下,文蛤稚贝适宜生存盐度为6.5～39.5,最适生存盐度为9.0～31.0;适宜生长盐度为7.3～38.7,最适生长盐度为15.0～23.0。在最适盐度范围之外,稚贝的存活率、体重、壳高及壳长日增长率均随着盐度的升高或降低而降低。     

呋喃唑酮间接竞争ELISA(ciELISA)检测法的建立

为快速检测水产品中FZ残留ELISA ;将呋喃唑酮 (Furazolidone ,FZ)与牛血清白蛋白 (BSA)、人血清白蛋白 (HSA)联接 ,分别作为免疫原及包被原 ,建立了水产养殖动物组织中呋喃唑酮的ELISA筛选方法。实验结果表明 ,理想的呋喃唑酮———人血清白蛋白 (FZ- HSA )包被抗原的浓度为 1.2 5 μg/mL ,酶标二抗 (羊抗兔IgG HRP)的工作浓度为 1∶10 0 0 ,多抗 (FZ- PcAb)的工作浓度为 1∶3 2 0 0 ,可测定的最适范围为 10～ 10 0ng/mL ,最小检测限为 1ng/mL。本实验所建立的ELISA方法的孔间差异为 4.16% ,板间差异为 9.2 0 % ,实验重复性好。添加回收率试验测的虾肉样本品均回收率为 (94.86± 9.5 5 ) %。在实验浓度范围内 ,呋喃唑酮 (FZ)的抗血清与氯霉素 (Chloramphenicol)、磺胺二甲基嘧啶 (Sulfamethazine)、红霉素 (Erythromycin)、恩诺沙星 (Enrofloxacin)、甲氧苄啶 (Trimethoprim )等可能会因同时使用而导致共同残留的抗微生物药物未显示免疫交叉反应性 ,与结构相似或相近药物呋喃西林 (Furacilinum)的交叉反应性为 43 %。这表明所建立的方法有较高特异性和灵敏度 ,适合呋喃唑酮残留的快速筛选。整个测定时间为 5h。     

养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究

本文建立了网箱养殖大黄鱼病原菌--副溶血弧菌酶联免疫吸附法,也即间接ELISA快速检测方法.用0.5×10-3(V/V)甲醛、30℃作用8h灭活病原菌制成菌苗.用该菌苗免疫新西兰兔获得特异性抗血清,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为标记第二抗体,对副溶血弧菌进行间接ELISA快速检测,其最低检测极限为5×104CFU/cm3.现埸检测养殖水体中没有副溶血弧菌检出,患病大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为70%,外观健康大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为20%.现埸检测结果表明间接ELISA检测法不仅可以用于患病大黄鱼病原菌的快速检测,而且能够检测出无病症带菌大黄鱼.     

泥蚶苗种的增殖研究

１９９１～１９９２年在青岛市黄岛区薛家岛镇唐岛湾进行了泥蚶苗种增殖试验。研究结果表明，泥蚶天然苗种增殖的主要技术措施有：首先要留足亲贝，保证１．８个／ｍ２亲贝；其次是准确预报泥蚶产卵及幼虫附着期，然后及时采取平畦、挑沟、撒砂等措施人工改造滩涂环境，可使泥蚶附苗率增加达（７～５６）×１０－２。     

硬壳蛤同工酶的组织特异性研究

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对硬壳蛤5种组织(足、外套膜、闭壳肌、鳃和肝)的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(M DH)和乳酸脱氢酶(LDH)同工酶进行了比较研究,并对酶谱表型及位点表达进行了分析。结果表明,硬壳蛤上述组织的EST和M DH同工酶存在不同程度的组织特异性,而LDH没有组织特异性。在EST酶谱中,肝组织染色最深,说明其EST活性最高,这与肝脏为重要的消化腺和解毒器官相适应。在M DH酶谱中发现了s-M DH和m-M DH所形成的谱带,闭壳肌的M DH谱带染色很深,这与肌肉需要由三羧酸循环提供大量ATP相适应。     

胶州湾菲律宾蛤仔生长特征研究

为对胶州湾菲律宾蛤仔增养殖业的可持续发展提供技术支持,2004年5～9月,通过对胶州湾菲律宾蛤仔进行定点采样调查和生物学特性测定,分析研究了菲律宾蛤仔的生长特征.结果表明：近几年胶州湾菲律宾蛤仔的底播增殖,苗种平均体重0.26g、壳长11.1mm;1～3龄期间个体生长速度较快,1～2龄、2～3龄,体重分别增长3.88g和4.02g;1～2龄生物量增长最快,2～3龄由于死亡率提高,使生物量增长缓慢;壳长、壳高、壳宽与体重关系式分别为y=0.000 2x^3.053 3,y=0.000 4x^3.088 6,y=0.005 3x^2.683 4,壳高、壳宽与壳长关系式分别为y=0.667 4x＋0.305 9,y=0.457 5x-0.967 8;1～3龄蛤仔软体部的生长速度快于贝壳,5～6月份是菲律宾蛤仔的肥育期.由个体生长特性分析,3龄为最佳采捕年龄,从生物量上分析,采捕2龄蛤收益最高;6月是最佳的捕获季节.     

MPS法高精度自由表面识别方法研究

为了提高粒子法即移动粒子半隐式法(Moving Particle Semi-implicit method, MPS法)中自由表面粒子的识别精度,降低由粒子误判引起的非物理压力振荡,对MPS法的自由表面识别方法进行了改进。在原始自由表面判别标准的基础上增加辅助判别条件,提出2种新的自由表面判别法即压力判别法和填充率判别法。利用对静水问题和溃坝流问题的模拟计算,对比分析选用不同自由表面判别法得到的数值计算结果,揭示粒子识别精度对压力计算的重要影响。研究结果表明:新提出的压力判别法和填充率判别法可以有效地提高自由表面粒子的识别精度,减轻压力计算中的非物理压力振荡现象,从而提高压力计算的稳定性以及整体数值计算的模拟精度。     

硬悬挂钻井隔水管涡激振动特性研究

针对深水钻井过程中遭遇强台风,基于安全性考虑要求钻井平台悬挂隔水管提前撤离的问题,采用软件SHEAR7针对HYSY981钻井平台硬悬挂隔水管系统避台风撤离作业过程中,受南海一年一遇海流作用时诱发涡激振动(VIV)的情况,研究航速与悬挂长度对VIV特性的影响。研究表明,浮力块覆盖率越高,隔水管系统张力越小;浮力块分布对隔水管系统VIV响应影响较大,25%交错布置方案VIV响应最弱。隔水管并非越短越好,要综合考虑洋流剖面、隔水管配置和平台航行的影响;在不同悬挂长度及航行条件下的VIV响应,在撤离作业前应尽量避免在高流速区布置浮力单根,撤离作业时应尽量采用顺流而避免平台逆流航向。     

基于自动跟踪技术检测GNSS动态测量精度方法

提出一种基于TDA5005高精度全站仪对GNSS定位设备进行自动跟踪测量,通过自动控制、时间同步、姿态改正、空间基准统一等步骤,实现对动态环境下GNSS设备单历元定位精度进行检测。设备检测既可在海上也可在陆地上进行,自动化程度高,操作简便,以期对GNSS的应用有一定的指导和借鉴意义。