不同氮源下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的生物量、氮吸收与脂肪酸组成研究

微藻培养过程中氮缺失有利于油脂和生物量的积累,然而不同氮源条件下微藻生长与生物量的研究有限,限制了生物油脂的相关研究。本文研究通过研究南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L在不同氮源条件下的细胞生长与油脂积累,进一步探究其作为富集油脂微藻的潜力。研究发现：在含有NH₄CL的培养基中,Chlamydomonas sp.ICE-L生长速率最大;在含有NH₄NO₃的条件下,获得了最大干重量0.28 g/L。最高油脂含量0.21 g/g是在缺氮条件下获得,同时得到干重0.24 g/L。在多不饱和脂肪酸的产出方面,NH₄NO₃和NH₄Cl为氮源培养基时要好于缺氮和KNO₃培养基,在NH₄NO₃和NH₄Cl为氮源的培养条件下ICE-L胞内C18：3和C20：5的含量高。比较而言,缺氮和KNO₃培养基时C16：0、C18：1和C18：2的含量要高。     

南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶的热胁迫响应

为了研究南极冰藻的热胁迫应答机制,本文根据转录组测序得到的冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L过氧化氢酶CiCAT基因分析了其编码蛋白的特征,同时研究了CiCAT基因表达和过氧化氢酶活性在培养温度升高时的响应变化情况。结果表明:CiCAT基因序列全长为2 066 bp,编码492个氨基酸。在过氧化氢酶的系统进化树中,南极冰藻与其他绿藻聚类为一个分支。CiCAT编码的蛋白序列与盐藻和红球藻的过氧化氢酶序列相似性较高,分别为80.5%和78.9%。当南极冰藻处于热胁迫条件下,CiCAT基因的相对表达量和过氧化氢酶活均呈现出先上升后下降的趋势,但在胁迫24 h时CiCAT基因的表达量变化不明显,而实验组的酶活显著高于对照组。在胁迫72 h时,基因表达量和酶活均达到最高值。研究初步表明,与在常温藻类和高等植物中的功能相似,在经受热胁迫的情况下,南极冰藻中的抗氧化酶系统也发挥着重要作用。     

温度对南极衣藻ICE-L(Chlamydomonas sp. ICE-L)谷胱甘肽含量及其相关酶活性的影响

采用分光光度法研究了在不同温度下(包括最适温度、低于或高于最适温度)南极衣藻ICE-L(Chlamydomonassp.ICE-L)谷胱甘肽(GSH)含量、蛋白含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性,同时分析了已适应高温(16℃)的衣藻重新适应低温(8℃)时这些指标的变化,以期阐明谷胱甘肽系统与南极冰藻低温适应性的关系。结果表明,当温度低于对照组(最适温度8℃)时,蛋白含量降低,而GSH含量、GPx、GST和GR活性上升,已适应高温的衣藻重新适应低温时也出现类似的结果。但当温度高于最适温度时,GSH含量、GST和GPx活性下降,而蛋白含量和GR活力有上升的趋势,GR活力增长幅度比低于最适温度时的变化小。由此可见谷胱甘肽系统在南极衣藻低温适应过程中,GSH、GPx、GR、GST与低温适应呈正相关,同时除GR外其他因子与南极衣藻高温适应呈负相关,GSH及其相关酶在南极冰藻低温适应中具有重要作用。     

南极冰藻的总脂含量及脂肪酸组成与其低温适应性的关系

通过对南极水样中分离出来的 4种南极冰藻 (2种硅藻和 2种绿藻 )在不同温度下的总脂含量和脂肪酸组成的研究 ,发现 2种硅藻 (H1和 H2 )通过增加胞内脂肪含量和不饱和脂肪酸的组成来提高其低温适应性 ,而且单不饱和脂肪酸含量远高于多不饱和脂肪酸 ,发挥主要的作用 ;绿藻 L1的总脂含量变化不大 ,但在低温条件下 ,其不饱和脂肪酸的含量亦相应提高 ;绿藻 L4的总脂含量和脂肪酸组成变化与 2种硅藻相似 ,但 2种绿藻的多不饱和脂肪酸含量远高于单不饱和脂肪酸 ,发挥主要的作用。研究结果还显示 ,低温有利于短链脂肪酸的合成。同时作为膜磷脂重要组成成分的 C2 2∶ 6脂肪酸在 4种冰藻中均保持稳定 ,含量相对较高 ,这也是对南极低温环境条件的适应     

环境因子对2种南极绿藻脂肪含量和脂肪酸组成的影响

通过气相色谱方法对南极冰藻的脂肪酸进行了分析,发现环境因素对2种绿藻总脂含量有一定的影响：(1)温度对Pymmixtomonas sp,总脂含量影响不大,一般为8．3％～8．9％,Chlorophyceae L-4在2℃时的总脂含量最高为10.33％;(2)光强显著地影响这2种绿藻脂肪在细胞内的积累。随着光强由限制生长的39 lx增加到3900 lx,2种绿藻的脂肪酸含量降低：(3)盐度的提高有利于2种绿藻脂肪的积累;(4)营养盐的限制也利于2种绿藻脂肪的积累。在氮源缺乏条件下,Pyramidomonas sp,和Chlorophyceae L-4细胞内脂肪大量积累,含量分别是以NH4Cl为氮源的2．2和3.2倍。环境因素对2种绿藻脂肪酸组成和含量的影响不同,其脂肪含量的改变反映了南极冰藻生长的改变。环境因子能够影响这2种绿藻的脂肪含量,同样也影响到它们的生长。在适合南极冰藻生长的条件下,脂肪酸积累降低;反之,在南极冰藻生长受到限制的条件下,脂肪合成增加。这表明2种绿藻的脂肪含量随生存环境的变化而变化。环境因子同样影响到2种绿藻的脂肪酸组成,尤其是不饱和脂肪酸的组成和含量,但组成和其生长不存在相关性。环境因子(温度、光强、盐度和营养盐)对2种绿藻脂肪酸的测定结果表明,在2种绿藻中,多不饱和脂肪酸的含量高于单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸。因此。这2种绿藻可望为多不饱和脂肪酸的开发利用提供藻种资源。     

南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE-L）谷胱甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化

采用RT-PCR技术克隆南极衣藻GR基因ORF全长cDNA,然后经酶切、连接等步骤构建其原核表达载体;并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行了优化,以期获得较大量的酶蛋白。结果表明,将构建的原核表达载体pET-GR导入大肠杆菌BL21,可以高效表达融合蛋白;且表达的蛋白均以包涵体的形式存在;经SDS-PAGE电泳...     

南极衣藻chlamydomonas sp. ICE-L硝酸还原酶基因的生物信息学分析

硝酸还原酶(NR)除调节植物的氮代谢外,在植物的各种非生物胁迫的适应过程中也发挥着重要的作用.从南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的cDNA文库中筛选到了硝酸还原酶的全长基因,对其进行测序并对其编码的蛋白序列进行了生物信息学分析,构建了NR的系统进化树,通过多序列比对探讨了可能与该酶逆境适应性相关的活性位点,并对该蛋白进行了三级结构预测分析.结果显示,NR基因的编码区长2 589 bp,编码863个氨基酸.在以氨基酸序列构建的系统进化树中,南极衣藻的NR序列和其他绿藻类的聚在一起,与团藻、莱茵衣藻、杜氏盐藻和小球藻的同源性依次分别为63％,61％,60％和54％.蛋白质功能预测分析显示,该NR基因含有与高等植物NR相类似的3个不同的功能结构域.对南极冰藻NR基因的生物信息学分析研究,将有助于从硝酸还原酶角度了解南极衣藻对极端环境的适应性,拓展并深化其适应机制的研究.     

盐度对大菱鲆幼鱼肌肉氨基酸和脂肪酸组成的影响

为了探讨盐度对幼鱼肌肉中氨基酸和脂肪酸组成的影响,作者将平均体质量为(7.16±0.07)g的大菱鲆(Scophthal musmaximus)幼鱼分别饲养在盐度(12、18、24、30(对照组)和36)水体中60 d。结果表明,不同盐度下,幼鱼肌肉中的氨基酸总量(TAA)、必需氨基酸(EAA)总量、非必需氨基(NEAA)总量和呈味氨基酸(FAA)总量分别在69.25%±0.37%~74.85%±1.26%、31.70%±0.11%~33.74%±0.28%、31.29%±0.44%~34.60%±1.26%和24.20%±0.66%~26.98%±1.02%,从高到低依次为36组30组12组18组24组,36组均显著高于24组(P0.05)。支链氨基酸(BCAA)总量、EAA/TAA、EAA/NEAA、FAA/TAA分别在14.94%±0.34%~15.37%±0.18%、44.57%±1.20%~45.78%±0.26%、80.40%±3.93%~84.42%±0.89%和34.95%±0.70%~36.41%±1.33%,各盐度组间均无显著性差异(P0.05)。必需氨基酸指数(EAAI)在40.41±1.23~44.46±0.54,30和36组显著大于其他组(P0.05)。脂肪酸(TFA)总量和非必需脂肪酸(NEFA)总量分别在88.65%±0.68%~89.66%±0.32%和85.11%±0.78%~86.38%±0.37%,12和30组均显著高于18组(P0.05)。多不饱和脂肪酸(PUFAS)总量和EPA+DHA总量分别在34.95%±1.01%~36.88%±0.64%和23.53%±1.30%~25.74%±0.25%,从高到低依次为36组30组24组12组18组,各盐度组间均无显著性差异(P0.05)。必需脂肪酸(EFA)总量在3.28%±0.04%~3.58%±0.10%,各盐度组间均无显著性差异(P0.05)。饱和脂肪酸(SFA)总量在27.51%±0.37%~29.83%±0.35%,12组显著高于36组(P0.05)。与对照组相比,36组大菱鲆幼鱼肌肉中的氨基酸和脂肪酸组成有所改善,其蛋白质和脂肪质量得到提高。研究成果可为大菱鲆渗透压调节的能量代谢机制及肌肉营养品质的环境调节机理积累基础资料。     

盐度变化对杜氏盐藻的游离氨基酸和脂肪酸含量的影响

研究了盐度对杜氏盐藻(Dunaliella salina)的生理生化效应。结果表明该藻适于生活在盐度为6-7倍海水的试验水中(海水盐度为33．5)。在此盐度中其光合速率、细胞增长速率、光合色素增长速率,游离氨基酸总量及多聚不饱和脂肪酸总量均高于生活在其它盐度的藻。     

南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13引导糖基转移酶基因表达对环境因子变化的响应

为了探讨胞外多糖在南极微生物低温适应性中的作用与机制,克隆了南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13的引导糖基转移酶(GTF)核心片段,并采用Real-Time PCR的方法研究了温度、冻融循环、盐浓度、pH等条件对该糖基转移酶基因(gtf)表达的影响。结果表明,低温有利于gtf的表达,短时的低温刺激(2℃)1 h后,gtf的表达量即上调为对照的1.5倍;而该菌经4和10℃培养24 h后gtf的表达量约为20℃时的8~12倍;经过冻融循环gtf的表达量上调,在第2个冻融循环后gtf 的表达量较对照提高了3.667倍;盐浓度对gtf的影响表现为低促高抑,即NaCl含量为6.0 %时gtf 的表达量是对照(3.0%)的3.59倍,当NaCl含量达9.0 %时gtf 表达量则显著下调;在一定范围内(pH5.0~8.0),pH的改变会促进gtf 的表达,当pH为6.0时gtf 表达量约为pH7.0时的2倍。该结果为探讨胞外多糖在南极微生物环境适应性中的作用与机制提供了科学依据。     

南极冰藻 Chlamydomonas sp.ICE-L的 cDNA文库构建及品质检测

为构建南极冰藻Chlamydomonassp.ICE-L的cDNA文库,提取对数生长期南极冰藻ICE-L的总RNA,以此为模板,通过PowerScript逆转录酶逆转录合成第一链cDNA;再以第一链cDNA产物为模板,用LD-PCR合成第二链cDNA。该cDNA产物经分级分离转入大肠杆菌中,即获得南极冰藻ICE-L的cDNA原始文库,其滴度为1.6×106cfu/mL。扩增后的cDNA文库的滴度为1.0×1010cfu/mL。用PCR方法测得文库的重组率大于97%,插入cDNA的长度为0.5~1.8 kb,0.9 kb以上插入片段占50%以上。取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取72个独立菌落,对其中22个独立菌落所插入的cDNA进行测序,克隆到了一个具有5′和3′非编码区的40S ribosomalprotein S5全长基因序列,GenBank收录号为AM167929。     

缺氮培养条件对胶球藻C-169油脂积累及其脂肪酸组成的影响

随着石油资源短缺的加剧,利用微藻生产生物柴油获得了全世界范围的关注,其中筛选高含油藻种是微藻能源产业的基本环节。本文研究了缺氮培养对胶球藻C-169在生长速率、油脂含量以及脂肪酸组成等方面的影响,结果显示,氮缺乏条件下,C-169从第3天开始生长速率明显低于正常培养组,10d后细胞密度维持在大约1.6×107cells/mL,为初始细胞密度的约33倍。而根据尼罗红荧光显微观察其在培养的第12天油脂积累达到最高,此时总脂中脂肪酸的含量由开始的0.089ng/1 000cells增长到1.135ng/1 000cells,而三酰甘油(TAG)占总脂比例达到的74.6%,其中以C16或C18饱和或单不饱和脂肪酸为主,其中油酸(18:1)的量占据了中性脂TAG的一半以上,符合生产高品质生物柴油的要求。     

温盐变化对北极海冰细菌质膜的影响研究

从第4次北极科学考察采集的海冰样品中分离筛选得到3株菌株,通过GC-MS检测法研究了温度和盐度对菌株质膜脂肪酸组成的影响,并应用荧光偏振法测定了不同条件下质膜流动性.这3株菌在低温培养时,细胞膜流动性无显著性变化,膜脂肪酸组分中总不饱和脂肪酸和支链脂肪酸质量分数显著升高,表明菌株通过调节膜脂肪酸不饱和度和支链化程度来维持低温下质膜流动性,增强对冷的耐受性;高盐条件下,3株菌细胞膜流动性与对照组基本相同,支链组分显著升高,单不饱和脂肪酸C16∶1质量分数显著升高.在低温、高盐环境下,海冰细菌可通过改变细胞膜脂肪酸组成来调节膜流动性和相结构以适应环境的变化.     

温度、光照、pH值对后棘藻生长及脂肪酸含量的影响

报道了环境因子对富含 EPA (2 0∶ 5ω3)的海洋微藻后棘藻 (Ellipsoidion sp.) 70 - 0 1的生长速度、总脂及脂肪酸含量的影响。结果表明 ,后棘藻具有较快的生长速度和较高的脂肪酸含量 ,总脂含量为 31～ 36 % ,主要脂肪酸为 14∶ 0、16∶ 0、16∶ 1、18∶ 1ω9、18∶ 1ω7、18∶ 2 ω6、2 0∶ 4 ω6、2 0∶ 5ω3。生长的温度范围为 15～ 30℃ ,2 5℃时生长速度最快。温度对总脂含量影响很小 ,但对EPA和 PUFA含量影响较大。在 2 5℃时有最大的 EPA和 PUFA含量。适宜光强为 10 8.75μmolm-2 s-1～ 2 4 4 .15μmolm-2 s-1,在 145.54μmolm-2 s-1时 EPA产率较大。在起始 p H6 .5～ 9范围内 ,p H8.5时有最大的生长速率和总脂含量 ,而 EPA和 PUFA在起始 p H7.5时最大 ,分别占脂肪酸的 18.77%和 2 3.38%。实验条件下后棘藻 EPA产率最大的条件为温度 2 5℃ ,光强 145.54μmolm-2 s-1,p H为 7.5～ 8.5。     

莱茵衣藻叶绿体型磷酸甘油醛脱氢酶过表达对其储能物质生产的影响

叶绿体型磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)光合固碳生产储能物质的关键酶,加深对该酶生物学功能的认识对探索微藻光合固碳有着重要意义。本文首先构建了2种叶绿体型GAPDH过表达转化株,实现了持续稳定和生长偶联2种不同模式的叶绿体型GAPDH的表达;通过对比分析2种转化株与野生株的生长(OD与干重)、叶绿素荧光参数Fv/Fm、碳水化合物含量以及脂肪酸种类与含量的变化规律,考察过表达GAPDH对莱茵衣藻储能物质生产能力的影响。研究表明,过表达叶绿体型GAPDH实现了转化株碳水化合物和脂肪酸产率的明显提升。与野生株相比,稳定过表达GAPDH的转化株不仅能够积累较高含量的碳水化合物,且脂肪酸最大产率提升了55%,最大储能物质产率提升了75%。本研究首次从实验角度证实,莱茵衣藻叶绿体型GAPDH的过表达可显著提升其储能物质生产能力,本研究对基于微藻光合固碳的合成生物学的发展起到推动作用。     

吲哚乙酸对微拟球藻生长和脂肪酸含量的影响

研究不同浓度吲哚乙酸(Indole-3-Acetic Acid,IAA)对微拟球藻(Nannochloropsis oculata)生长和脂肪酸组成的影响。结果表明:在0.1 mg/L时,低于0.5 mg/L时IAA促进微拟球藻生长,但不影响叶绿素和不饱和脂肪酸合成;IAA促进生长作用最显著,最大比生长率为2.33 d-1。随浓度进一步增加,IAA促生长作用越来越小,并抑制叶绿素和不饱和脂肪酸合成;在5 mg/L时,IAA极显著抑制EPA合成。添加适当浓度IAA可促进藻细胞生长,缩短其生长周期。     

细胞生长时期对两种海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成的影响

报道海洋微藻后棘藻 (Ellipsoidion sp.7- 14)和眼点拟微球藻 (N annochloropsis oculata)细胞生长时期对细胞内总脂含量和脂肪酸组成的影响。结果表明 ,两种微藻的总脂均在稳定期含量最高 ,分别占干重的 54.5%和 4 3.3% ,而 EPA、ω- 3多不饱和脂肪酸和总 PUFA的最高比例均出现在对数早期 ,EPA占总脂肪酸的比例可分别高达 2 7.3%和 2 7.7% ,同时总脂的含量却最低 ,分别占干重的 2 2 .9%和 2 2 .0 %。在生长对数期中 EPA是脂肪酸的主要成分 ,而在稳定期中16∶ 0、16∶ 1ω9和 18∶ 1ω9是脂肪酸的主要成分。     

南极适冷菌Psychrobacter sp.G 普遍胁迫蛋白(USP)基因的克隆及其胁迫条件下的应答特征分析

根据南极适冷菌Psychrobacter sp.G基因组测序草图发现并克隆到了1个普遍胁迫蛋白(Universal StressProtein,USP)基因Usp1141。该基因ORF长462bp,编码153个氨基酸,蛋白理论分子量为17kDa,pI为5.23。通过多序列比对发现该USP含有交替排列的4个α螺旋和5个β折叠,以及与ATP结合相关的氨基酸残基,表明该蛋白可能通过与ATP结合而发挥作用。利用实时定量PCR技术对该蛋白在不同胁迫条件下的表达情况进行分析发现,温度变化对Usp1141基因的表达没有显著影响;低盐度(0,15)胁迫会显著抑制其表达,而高盐度(90,120)胁迫则会显著促进其表达;在温度与盐度协同胁迫条件下,当培养基盐度低于菌株生长的最适盐度时,无论温度高低,Usp1141基因的表达均受到抑制,而当培养基盐度高于最适盐度时,无论温度高低,Usp1141基因的表达均会提高。实时定量PCR研究表明,Usp1141基因可能在南极适冷菌Psychrobactersp.G对环境渗透压变化的适应性中发挥作用。