静水压力诱导牙鲆( Paralichthys olivaceus)四倍体的条件优化

采用静水压力抑制受精卵第一次卵裂的方法,进行了诱导牙鲆四倍体的研究。结果表明,将受精卵保持在(15.5±0.5)℃,从受精后70min开始用55MPa的压力处理6min后,正常仔鱼孵化率最高达到15.6%,此时的四倍体诱导率也最高达到63.3%。利用获得的最佳诱导条件处理获得了数千尾体长8—15cm的幼鱼,流式细胞仪检测和红血球长径测量结果显示,处理组幼鱼中四倍体约占13.3%,说明四倍体培育成功。该成果为开展牙鲆多倍体育种奠定了基础。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)细菌败血感染症及病原检验与分析

采用调查统计、剖检病变、病原分离鉴定与人工感染健康鱼致病作用试验的方法，对自然发生的养殖牙鲆细菌败血感染症病例，进行了发病情况、临床表现及病理变化等方面的检验，同时取病(死)牙鲆的肝、腹水、腐烂肌肉组织为材料进行细菌分离，对分离于10尾鱼20株纯培养菌的形态特征、理化特性等进行鉴定。结果表明，分离出来的两种细菌，一种是弧菌属(Vibrio Pacini 1854)细菌的一个新种(sp．nov．)并定名为牙鲆弧菌(Vibrio olivaceus sp．nov．)；另一种是气单胞菌属(Aeromonas Kluyver and van Niel 1936)的嗜水气单胞菌(A．hydrophila)。通过人工感染试验等表明该两种分离菌为相应感染症的致病菌。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)红细胞单克隆抗体与五种养殖鱼类血细胞的交叉反应

以牙鲆血细胞为抗原免疫Balb／c小鼠，选用聚乙二醇(PEG)作为细胞融合剂，将免疫的小鼠脾细胞与P3 X63 Ag8U1骨髓瘤细胞融合，筛选、克隆出3株生产抗牙鲆红细胞单克隆抗体(Mabs)的杂交瘤细胞(1C7、286、3A1)。应用免疫荧光抗体法(IFAT)研究3株单抗与5种常见养殖鱼类(大菱鲆、花鲈、真鲷、许氏平鲉、鲫鱼)红细胞的交叉反应，结果显示，3株单抗与5种鱼类红细胞有不同程度的阳性反应；应用Western blotting法分析单抗识别的蛋白分子量，结果显示，单抗1C7与大菱鲆血细胞结合的蛋白分子量为52kD、47kD、45kD、32kD、29kD、27kD，与花鲈、许氏平 结合的蛋白分子量是52kD、29kD，与真鲷结合的为29kD，与鲫鱼结合的为44kD、29kD、28kD；单抗286与大菱鲆、花鲈血细胞结合的蛋白带分子量是30kD、28kD，与真鲷结合的为30kD，与许氏平 结合的为29kD、28kD；单抗3A1没有Western blotting反应。结果表明，这6种鱼红细胞存在相同或相似的抗原决定簇，蛋白成分具有相似性。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)秦皇岛弧菌感染症及其病原细菌研究

采用病原分离与鉴定、人工感染试验等方法,在对养殖牙鲆病例进行发病情况、病理变化特征检验的基础上,进行病原学检验。结果表明,此病例属于由弧菌属(VibrioPacini1854)细菌引起的败血感染症。经对12株纯培养菌(HQ010712-1—HQ010712-12)进行形态特征、理化特性等表观分类学指征的检验,选择代表菌株(HQ010712-1株)进行16S rRNA基因的测定与系统发育学分析等,判定为弧菌属的一个新种。将HQ010712-1株送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了复核鉴定与分类定名,依据分离地定名为秦皇岛弧菌(Vibrioqinhuangdaorasp.nov.);参考菌株为HQ010712-1。     

野生和养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)遗传差异的RAPD和ISSR研究

利用RAPD和ISSR两种分子标记技术,分析了山东威海近海野生和养殖牙鲆的遗传多样性差异。结果表明,用10个RAPD引物对两个样本各30个个体的基因组DNA进行扩增,共获得110个重复性好且带谱清晰的扩增位点,片段大小在200—2500bp之间,野生样本和养殖样本的多态位点比例分别为59.09%和60·91%,Shannon多样性值分别为16·563和16·917,野生样本内平均遗传距离为0·17427,养殖样本为0·17553,样本间遗传距离为0·17419。用6个ISSR引物共在两样本中检测到161个位点,野生样本有111个(68·94%)为多态位点,养殖样本有112个(69·57%)为多态位点,野生和养殖样本的样本内平均遗传距离分别为0·19996和0·20007,样本间遗传距离为0·20002,Shannon多样性值分别为29·254和29·688。平均位点多态率显著性检验标明,无论是利用RAPD还是ISSR技术,两群体间平均位点多态率皆差异不显著,说明第一代养殖群体的遗传结构尚未发生明显变化。     

实验微粒饲料中花生四烯酸含量对牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚鱼生长、存活的影响

采用花生四烯酸即廿碳四烯酸（AA, 20∶4n-6）含量梯度法,制备了四种n-3HUFA含量相等、DHA/EPA比例相同、AA含量分别为0.06%、1.00%、1.5%、2.0%的实验微粒饲料,进行了AA的不同含量对牙鲆仔稚鱼生长、存活、体内相关成分以及对外部压力耐受性的影响研究.26天的养殖试验结果表明,当牙鲆仔稚鱼实验微粒饲料中AA的含量为1.5%时,牙鲆仔稚鱼的生长、存活以及对不同压力的耐受性都达到最佳.养殖试验结束后,对稚鱼体内相关成分的分析结果表明,稚鱼体内AA的含量随着实验微粒饲料中AA含量的增加而增加.     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)TLR21 基因在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达特征

应用荧光定量PCR技术, 检测了TLR21 基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染迟缓爱德华 氏菌(Edwardsiella tarda)后, 在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、6 d 后, 在心脏、肝脏、脾脏、 头肾、鳃、小肠、肌肉和血的时空表达特征, 并探讨了它们与牙鲆先天免疫反应的关系。结果表明, 大 多组织在感染病原6 h 后TLR21 基因表达明显上调, 尤其是头肾和小肠。头肾6 h 的表达量达到了 对照组的59.3 倍, 小肠6 h 的表达量为对照组的38.6 倍。迟缓爱德华氏菌感染引起牙鲆体内各组织 中TLR21 的上调表达和变化, 为研究牙鲆对迟缓爱德华氏菌的防御机制提供了理论依据。     

温度、光照及仔鱼个体大小对稚海蜇(Rhopilema esculentum)捕食褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) 仔鱼的影响

利用实验生态学方法,研究温度(15、19和23℃)、光照(明和暗)、仔鱼大小[全长(3.01±0.08)mm初孵仔鱼和(3.79±0.13)mm孵化后5天仔鱼]对稚海蜇[伞径(21.1±0.4)mm]捕食褐牙鲆仔鱼的影响。结果表明,稚海蜇对初孵仔鱼的捕食率随着水温升高而显著升高。光照条件在各仔鱼密度(10,30,50和80ind/L)下均不显著影响稚海蜇对初孵仔鱼的捕食率,说明光条件并不显著改善稚海蜇捕食仔鱼的能力。在高仔鱼密度(50和80ind/L)下,稚海蜇对孵化后5天仔鱼的捕食率显著低于对初孵仔鱼的捕食率;但在低密度(10和30ind/L)下,稚海蜇对两个不同发育阶段仔鱼的捕食率之间无显著差异。在低仔鱼密度下,稚海蜇对仔鱼的捕食率较低,这会降低仔鱼个体大小对稚海蜇捕食率作用的显著性。这既表明仔鱼逃避被稚海蜇捕食的能力随其发育生长而提高,也反映了稚海蜇对不同个体大小仔鱼捕食作用受仔鱼密度制约。     

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。     

ISSR 标记在牙鲆(Paralichthys olivaceus)与石鲽(Kareius bicoloratus)种间杂交一代的分离方式分析

利用ISSR标记对牙鲆♀与石鲽♂单对杂交亲本及其子一代(全同胞家系)的分离方式进行了研究。结果表明,8个ISSR引物共扩增出181个标记,其中116个为多态性,占总数的64.09%;标记在F1代呈三种分离方式:符合孟德尔分离比例、偏离孟德尔分离比例和异常分离。符合孟德尔分离比例的情况包括:不分离(代表了亲本基因型的5种组合:AA×AA、AA×Aa、Aa×AA、AA×aa、aa×AA);1︰1分离(代表了亲本基因型的2种组合:Aa×aa、aa×Aa);3︰1分离(代表了亲本基因型的1种组合:Aa×Aa)。偏分离的标记包括:亲本中呈多态而在子代中偏离1︰1分离的标记和亲本均有而在子代中偏离3︰1分离的标记。异常分离的标记包括:F1代出现双亲均不具备的标记和双亲或单亲有而子代却无的标记。3种分离位点出现的频率和数量分别为:82.87%、150,11.05%、20,6.08%、11;双亲共有标记中85.33%的不发生分离,单亲特有标记中28.57%—35.85%发生正常分离,该研究结果可为进一步利用该群体构建牙鲆和石鲽遗传连锁图谱奠定良好的工作基础并提供一定的理论依据。     

牙鲆体内消化酶活性的研究

采用生化方法对一年龄牙鲆胃、肠中不同消化酶的活性进行了研究。实验组I的牙鲆平均体重为 ( 35 0± 2 0 )g ,实验组II的牙鲆平均体重为 ( 4 60± 30 )g。结果表明 ,在牙鲆的胃、前肠、中肠、后肠中可以检测出蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性。胃中的蛋白酶主要为酸性蛋白酶 ,肠中的蛋白酶主要为碱性蛋白酶。肠中蛋白酶活性由前肠向后肠递减 ,前肠与中肠的酶活性没有显著差异 (P >0 .0 5 ) ;牙鲆肠中脂肪酶活性较胃中的高 ,在肠的不同部位脂肪酶的活性无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;牙鲆前肠中的淀粉酶活性最高 ,胃次之 ,中肠、后肠中淀粉酶活性较低。随着牙鲆的生长 ,蛋白酶、脂肪酶活性增强 ,淀粉酶活性减弱。对产生上述实验结果的原因进行了初步分析。     

重组酵母菌对牙鲆生长及血清激素含量的影响

于１９９８年１０－１１月间在荣成市寻山养殖场实验了饲喂具有大麻哈鱼生长激素基因的酵母菌对牙鲆的生长及其血清激素的影响。实验分为对照组和三组实验组,其中对照组的铒料中不含重组酵菌,实验组的铒料中分别含有重组酵母菌０．２５‰、０．５０‰、０．７５‰（Ｗ／Ｗ）。实验表明,通过投喂重组酵母菌,可以增加牙 血清生长激素的含量,牙促进牙鲆的生长。重组酵母菌的含量不同,对牙鲆血清甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸的影响     

牙鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆、表达及鉴定

采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。     

重组酵母菌对牙鲆非特异性免疫能力的影响

于１９９９年１０－１１月间在荣成市寻山养殖场实验了饲喂含有大麻哈鱼生长激素基因的重组酵母对１龄牙鲆非特异性免疫能力的影响。实验分为对照组和３个实验组,对照组的饵料中不含重酵母菌,实验组我饵料中分别含有重组酵母菌０．２５‰、０．５０‰、０．７５‰（Ｗ／Ｗ）。实验表明,通过投喂重组酵母菌,可以增加牙鲆血清蛋白的含量,增强牙鲆血清中深菌酶及抗蛋白酶物质的活性,这种影响与重组酵母菌的含量成正相关。     

人工诱导雌核发育牙鲆的染色体及核型证明

于1994-1996年,分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的3－5龄牙鲆亲鱼,采用紫外线照射法使牙鲆精子遗传物质失活,并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放,从而获得雌核发育二倍体牙好。原肠期采用空气干燥法、Giemsa染色,得到雌核发育二倍体、正常二倍体及单倍体的染色体制片,进行染色体和核型的分析。结果表明,牙鲆的雌核发育二倍体和正常二倍体的染色体数均为2n=48,核型为48t,即48条端部着色点染色体,臂数NF=48,两者的核型设有明显差异;单倍体为24条端部着丝点染色体;在3个组别中,第一号染色体上都有一明显的次缢痕。雌核发育二倍体牙鲆的诱导率为98％。     

山东近海牙鲆同工酶的生化遗传分析

１９９６年５月,１９９７年１月、１２月和１９９８年４月在山东青荣成近海采集了１３１尾活牙鲆共７１０个生化样品,采用水平淀粉胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,对牙鲆的２５种同工酶进行了分析。结果检测出ＬＤＨ、ＭＤＨ、ＭＥＰ、ＩＤＨＰ、Ｇ３ＰＤＨ、ＡＫ、ＣＫ、ＡＣＰ、ＰＧＭ、ＳＤＨ、ＡＤＨ、ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＧＤＨ和ＧＰＩ等１５处同工酶在牙鲆眼睛、肌肉、心脏、肝脏、胸鳍和肾脏等６种组织或器官听表达情况,     

雌核发育牙鲆同工酶基因的重组及父方基因的表达

于1998年4、5月在山东省荣成市寻出水产公司养鱼场人工采集牙Ping成熟精卵，紫外线灭活精子遗传物质，冷休克诱导，获得雌核发育牙Ping。1999年5月收集57尾雌核发育牙Ping生化样品，采用淀粉胶电泳分析了LDH、IDHP、PGM、ACP、ADH、SDH、GDH、CAT等8种在野生种群中为多态的同工酶。结果表明，牙Ping雌核发育群体的Ldh-C、Cat两个基因座位发生了重组，基因座位与着丝点之间的重组率分别为52．6％和29．8％；Idhp－1有父方基因表达现象，说明雌核发育过程中父方基因可能在分子水平整合。牙Ping雌核发育群体的多态座位比例和平均杂合度分别为7．0％和0．035，远低于野生种群；研究表明，通过抑制第二极体排出获得的牙Ping雌核发子代尚有一定基因杂合，不能用于培育纯系。