单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其性质的初步研究

从单环刺中制得单一组分的纤溶活性纤溶酶,并对其性质进行初步研究.单环刺体组织液经离心,超滤,离子交换层析,凝胶过滤等方法进行分离纯化,制得单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE电泳分析,SDS-PAGE电泳分析和飞行质谱分析,鉴定了酶制品纯度和相对分子量,进行了体外溶血栓试验.所得纯品UFEIa水解酪蛋白的比活力为442.0 U/mg,纯化倍数为12.1倍,回收率为27.0%.UFEIa为单一组分,相对分子量约23 800 Da.体外溶血栓实验表明此纤溶活性蛋白酶与蚓激酶相比具有很好的溶血栓活性.     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化出的1组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性。根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3-’RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5-’RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp。该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsindomain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶( UFE)是由本实验室分离纯化出的l组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活件和纤溶活性以及较好的生物安全性.根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3'-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5’-RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp.该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsin domain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶.     

单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达

单环刺螠(Urechis unicinctus)纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化得到的一组有抗凝和纤溶活性及较好生物安全性的纤溶酶。本研究为获得重组表达的UFE,根据该纤溶酶Ⅲ的(UFEⅢ)N端测序结果,设计简并引物,扩增出该蛋白的部分基因编码序列,利用5′-RACE PCR获得(UFEⅢ)的cDNA全长序列863bp,其中开放阅读框编码261个氨基酸。通过生物信息学分析其为丝氨酸蛋白酶家族成员,并与之前实验室提取的UFEⅢ进行同源性分析,推测其为一组同工酶。以PMD18-T-UFE为模板,扩增单环刺螠纤溶酶的成熟肽片段,构建重组表达载体pET32a-UFE和pET28a-UFE,转入Rosetta2(DE3)菌中诱导表达,UFEⅢ分别以可溶蛋白和包涵体的形式得到了表达。     

单环刺螠纤溶酶UFEⅠ药效作用和免疫原性的初步研究

为评价单环刺螠纤溶酶(UFEⅠ)的抗凝血和抗血栓形成作用,并对其免疫原性进行初步研究.文中通过小鼠血液凝固时间实验和大鼠颈动脉血栓形成模型研究UFE Ⅰ抗凝血和抗血栓作用.用纯UFE Ⅰ为抗原免疫小鼠,间接ELISA法测定特异性抗体的动态变化及效价.结果UFE Ⅰ能明显延长小鼠凝血时间,有效抑制大鼠体内的血栓形成,并显著降低大鼠纤维蛋白原含量(FIB),延长活化部分凝血活酶时间(APTT).免疫原性的研究结果为UFE Ⅰ末次免疫小鼠后,产生微量特异性抗体,且抗体水平呈现先升后降的动态变化;方阵法确定了ELISA的优化条件,测定UFE Ⅰ免疫后产生的抗体效价为1∶1 280.本文研究显示,单环刺螠纤溶酶UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用,在小鼠体内产生一过性抗体,但对动物机体不造成负面影响.     

hairy和hedgehog在单环刺蜢幼虫体节形成过程中的表达特征分析

hairy作为成对控制基因参与果蝇等体节动物的体节形成;体节极性基因hedgehog是节肢动物和环节动物体节边界维持的关键基因。本研究分析了单环刺螠hairy的序列特征以及hairy和hedgehog在其幼虫体节发生过程中的时空表达特征,结果显示:单环刺螠Hairy序列中含有保守的HLH结构域、Hairy_orange结构域和四肽WRPW;其mRNA在早期体节幼虫中的表达量显著高于晚期担轮幼虫,并且定位于每个体节的边界处。单环刺螠hedgehog mRNA在体节幼虫中的表达水平显著高于早期体节幼虫,并且呈现保守的体节边界表达特征。研究结果表明,hairy和hedgehog在单环刺螠幼虫体节中的表达图式与小头虫等典型体节动物中的表达图式基本一致。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性

硫化物是1种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶(SQR)是硫化物代谢的关键酶。单环刺螠是1种生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物。本研究为了获得具有活性的单环刺螠SQR,将其基因的开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的表达,后采用稀释复性的方法对重组蛋白进行复性。经IPTG诱导后该重组蛋白主要以包涵体形式存在。用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白。首次通过蛋白复性的方法获得具有活性的单环刺螠SQR,确定最佳稀释复性条件为pH=8.0,蛋白浓度20μg/mL,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽=10∶1,复性时间为96 h。     

一种来自海洋细菌的血纤维蛋白溶酶的分离纯化及性质研究

利用硫酸铵分级盐析、DEAE－纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析法对由海洋细菌FE92－8分泌的纤维蛋白溶酶进行了分离纯化，结果得到SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳单一区带。性质研究发现，该酶分子量为12.6kD，等电点为7.45，琼脂糖－纤维蛋白平板法测得该酶作用的最适温度为50℃，最适pH为8.0，在37℃，pH为8.0的情况下表现出很好的稳定性，温度起来50℃热稳定性较差，在碱性环境中稳定性较在酸性环境中稳定性强，阴性平板和阳性平板对比实验发现，该酶只有纤溶活性而无激酶活性，体外实验发现，该酶具有快速溶解血栓的能力。     

海洋假单胞菌纤溶酶的酶学性质的研究

从一株海洋假单胞菌中分离制备出一种具有纤溶活性的酶 ,对其酶学性质进行实验研究结果显示 :该酶的分子量是 2 1k D,等电点是 7.4～ 7.5 ;最适作用 p H是 8.0 ,最适作用温度是 5 0℃。该酶具有降解苯甲酰 - L -精氨酸乙酯盐酸盐 (BAEE)的活性 ,酶的动力学分析表明 :Km =0 .87mmol/ L,Vmax=1.80× 10 -3 mmol/ L s-1。     

硫应激单环刺螠差异表达的初步研究

采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究了100μmol/L硫化物环境与正常海水中耐硫生物单环刺螠mRNA的表达差异,初步筛选出7条体腔液细胞的差异表达基因,其中1个cDNA克隆片段与其它物种的MAP kinase kinase kinase(MAPKKK)有较高同源性。进一步采用RT-PCR技术对其在硫化物刺激前后的表达进行了检测,结果显示该基因在对照和应激后2 h6、h的个体中表达较弱;刺激12 h后表达量增高,并随应激时间增加,呈明显上调趋势。表明单环刺螠MAPK信号通路可被硫化物刺激激活,进而通过该信号通路调节下游生理反应,为进一步研究单环刺耐硫特性的分子机制奠定了基础。     

单环刺螠幼虫的体壁发生和体节形成

研究螠虫动物体壁发生和体节形成,可为阐释其早期发育机制以及体节在螠虫动物进化中的意义提供科学数据。本文以生活于沿海底质U形洞穴中的单环刺螠为材料,研究了单环刺螠幼虫的体壁发生和体节形成过程。研究显示,单环刺螠(Urechis unicinctus)担轮幼虫的体壁由单层上皮组织构成;至体节幼虫时,体壁变为单层上皮组织、结缔组织和纵向分布的肌纤维组成的多层结构,且体壁表面出现明显的分节;蠕虫状幼虫体节消失,体壁单层上皮细胞聚集形成不规则的乳突状结构,上皮中黏液细胞增多、结缔组织和肌纤维增多;至幼螠时,体壁的组织结构与成体基本一致,由复层上皮组织、结缔组织和肌肉组织(外环肌-中纵肌-内环肌)构成;单环刺螠体壁结构的不断分化,体现了其由浮游生活方式向爬行和穴居生活方式转变的适应过程。TUNEL检测发现,在单环刺螠幼虫体节发生过程中未出现明显的细胞凋亡现象。使用细胞增殖标记分子PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)检测单环刺螠体节发生区域增殖细胞的分布时发现：在担轮幼虫中期,其后体部首先出现增殖细胞带,并在随后的发育过程中形成体节细胞增厚区;担轮幼虫晚期...     

单环刺螠GATAB2的基因克隆及表达分析

GATA家族是经典的转录因子家族,因其能特异性的与核苷酸序列T/A(GATA)A/G结合而得名.前期研究在单环刺螠(Urechis unicinctus)中筛选到GATA家族成员GATA B2与硫代谢关键酶硫醌氧化还原酶(Sulfide quinone oxidoreductase,sqr)启动子高转录活性区相互作用....     

一株单环刺螠致病弧菌的分离鉴定、生长特性研究及药敏分析

对患病的单环刺螠幼体3 000～4 000只/kg肠道内病原菌进行分离鉴定、生长特性研究及药敏分析,为人工养殖单环刺螠幼体过程中出现的疾病提供治疗依据。对患病幼体肠道内的病原菌进行分离纯化、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析、人工回接感染试验、生长曲线测定、最适生长温度、pH、盐度的探究;采用K-B纸片扩散法对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、头孢唑林、四环素中度敏感,对阿奇霉素、新霉素、万古霉素、利福平、红霉素、克林霉素、阿莫西林进行药敏试验;并对抑菌效果最好的药品进行安全性检测。分离纯化后经生理生化鉴定获得一种弧菌命名为菌株SX-1,16S rRNA基因序列分析极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrioneocaledonicus),人工回接感染试验表明SX-1是单环刺螠幼体从沙底钻出,活动能力减弱,体表变红症状的致病菌,生长特性研究表明其最适生长温度、pH、盐度分别为30℃, 6.0, 35;药敏试验结果表明, SX-1对氯霉素、羧苄西林、氧氟沙星、头孢曲松高度敏感,安全性检测实验表明,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。从单环刺螠肠道内分离获得了一种极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrio neocaledonicus)的致病菌SX-1。对于感染该种弧菌的单环刺螠,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。我们的实验结果对于预防并治疗人工养殖过程中单环刺螠患病提供理论依据和治疗模式,因而具有实际指导意义。     

单环刺螠Bcl-xL基因的鉴定及对硫化物的应激反应

Bcl-xL是Bcl-2家族中一类重要的抗凋亡因子,其功能主要是抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生。为了探知Bcl-xL在生物硫化物应激中的作用,本实验以耐硫生物单环刺螠(Urechis unicinctus)为研究对象,RACE扩增获得一个长度为1 426 bp的单环刺螠Bcl-xL全长c DNA序列,推导的氨基酸序列包含Bcl-xL4个保守的BH结构域和1个跨膜区域。使用该c DNA的完整开放阅读框序列,构建了原核表达载体p ET28a-Bcl-xL,体外诱导表达该重组蛋白;镍柱纯化得到纯度为90%的纯化蛋白,并制备多克隆抗体。Western blotting结果显示:单环刺螠暴露于50μmol/L硫化物中2 h-24 h内其呼吸肠中Bcl-xL含量显著增加(P0.05),然而在150μmol/L硫化物中48 h-72 h内其呼吸肠Bcl-xL含量显著降低(P0.05),暗示Bcl-xL抑制细胞凋亡途径在单环刺螠应对低浓度硫化物暴露时发挥作用,而在高浓度硫化物暴露下Bcl-xL不能发挥抑制细胞凋亡的作用。     

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究

以本实验室分离的产壳聚糖酶YJ02菌株出发,制备壳聚糖酶发酵液,经离心、(NH4)2SO4分级盐析、Q-SepharoseFast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离纯化步骤,SDS-PAGE显示为一条带,壳聚糖酶纯化了28.9倍,收率为47.6%。该酶的性质研究表明,该酶的分子量为66.2KD,最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0;Mn2 对酶活力有明显的促进作用,Cu2 ,Fe3 ,Hg2 对酶活力有抑制作用;小分子有机物EDTA和SDS对酶活力有抑制作用,而IAA和β-巯基乙醇对酶活力稍有促进作用。该壳聚糖酶对高脱乙酰度壳聚糖底物水解作用强,酶解位点可能为NGlc-NGlc,酶最大反应速度Vmax=4.1μmol/min,常数Km为64mmol/L。此壳聚糖酶水解壳聚糖制备的壳寡糖数均分子量为2 400Da。     

单环刺螠转录因子基因Sp8的克隆、原核表达和重组蛋白纯化

转录因子Sp是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员,可与某些基因的上游调控序列结合,参与基因的转录调控。本研究采用同源克隆和RACE技术,获得单环刺螠的Sp8的全长cDNA,该序列长1 913bp,开放阅读框1 521bp,编码506个氨基酸;将其开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃条件下,经1mmol/L IPTG诱导表达4h,获得以包涵体形式存在的重组蛋白pET28a-SP,使用8mol/L尿素溶解包涵体,并通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白,SDS-PAGE分析该蛋白的分子量约为50kD。Sp8蛋白体外表达的成功将为研究单环刺螠相关基因的转录调控打下基础。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶相互作用蛋白质的筛选

硫化物是沿海水域中常见的有害物质,对于多数生物来讲,其在微摩尔级水平便可导致生物体中毒。硫醌氧化还原酶(SQR)是一种谷胱甘肽还原酶家族的膜结合黄素蛋白,为硫化物氧化解毒的一种关键酶。本研究以体外原核表达并复性的单环刺螠SQR为材料,采用His-pulldown技术和SDS-PAGE分析,从单环刺螠体壁细胞裂解液中筛选出两个可能与SQR结合的蛋白质,分子质量分别为40 ku和60 ku。通过毛细管液相色谱-离子肼质谱分析,初步判断其为细胞色素P450(cytochrome P450)和腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter),并初步探讨了其可能的功能。     

单环刺螠soxb基因的克隆及其在幼虫发育中的表达特征

SOXB作为重要的转录因子,参与了动物内胚层分化、消化道形成、神经细胞和感官细胞分化的调控。本研究利用RACE技术克隆了单环刺螠(Urechis unicinctus)2个soxb亚族基因soxb1(Uu-soxb1)和soxb2(Uu-soxb2)的cDNA全长序列,大小分别是1871 bp和2906 bp。在两个推导的氨基酸序列中均包含SOX家族的HMG-box结构和SOXB亚族蛋白特有的Group B homology序列,进化树分析它们分别与SOXB1和SOXB2聚类。原位杂交结果显示,Uu-soxb1和Uu-soxb2为母源表达基因;二者在担轮幼虫中的表达图式存在差异,其中早期担轮幼虫中Uu-soxb1 mRNA广泛分布于虫体中,Uu-soxb2 mRNA则集中于顶纤毛束基部和虫体后部(口后纤毛环之后),中期担轮幼虫中,Uu-soxb2阳性信号主要位于纤毛环及虫体的下半球;而Uu-soxb1 mRNA主要位于虫体下半球;之后的发育中二者的表达位点基本一致,即:晚期担轮幼虫中主要位于虫体后部,体节幼虫和蠕虫状幼虫中主要分布于消化道和体壁处。本研究结果表明,单环刺螠soxb在消化道发育过程中的表达模式与其他已报道动物类似,提示其在消化道发育中具有保守的功能。     

单环刺螠生殖腺的发生及雌体的生殖周期

采用组织学方法观察单环刺螠(Urechis unicinctus)生殖腺的发生、卵巢的结构及其年周期变化.结果显示:3.5cm幼螠中,原始生殖细胞迁至后肠管壁外的结缔组织膜处,并数个集群与该处的体细胞共同构成性腺原基;至4 cm幼螠,性腺初具雏形;随着个体的生长和成熟,构成卵巢的细胞不断增殖,于虫体尾部后肠腹侧形成长条形膜状的卵巢,外周为卵原细胞,中央为结缔组织,其两端分别与后肠管壁外侧和体壁内侧相连.根据卵巢的组织学和体腔液中雌性生殖细胞的细胞学特征,单环刺螠的卵巢发育可划分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期.单环刺螠生殖腺为低等的定型类型,其卵巢成熟期较生殖期早半个月.     

久效磷对单环刺螠体内几种酶活性影响的初步研究

运用冰冻切片技术和酶组织化学的方法研究了长期暴露于不同质量浓度久效磷(0,50,100,150ng/L)下的单环刺螠(Urechisunicinctus)体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、细胞色素C氧化酶(CCO)、碱性磷酸酶(AKP)的活性变化。实验表明,AChE在单环刺螠的体壁上呈现出较强的酶活性,活性位点处为红棕色的颗粒沉淀、并随久效磷胁迫浓度的提高显色越来越深;消化道切片上基本上没有AChE的活性。CCO在单环刺螠的体壁及肠道上都呈现出较强的酶活性,活性位点显示为棕色;肠道上,不同质量浓度组由低到高其CCO活性位点依次增多、显色也依次加深。低质量浓度久效磷(<150ng/L)胁迫对单环刺螠体内的AKP活性没有明显的影响。