单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其性质的初步研究

从单环刺中制得单一组分的纤溶活性纤溶酶,并对其性质进行初步研究.单环刺体组织液经离心,超滤,离子交换层析,凝胶过滤等方法进行分离纯化,制得单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE电泳分析,SDS-PAGE电泳分析和飞行质谱分析,鉴定了酶制品纯度和相对分子量,进行了体外溶血栓试验.所得纯品UFEIa水解酪蛋白的比活力为442.0 U/mg,纯化倍数为12.1倍,回收率为27.0%.UFEIa为单一组分,相对分子量约23 800 Da.体外溶血栓实验表明此纤溶活性蛋白酶与蚓激酶相比具有很好的溶血栓活性.     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化出的1组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性。根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3-’RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5-’RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp。该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsindomain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶( UFE)是由本实验室分离纯化出的l组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活件和纤溶活性以及较好的生物安全性.根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3'-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5’-RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp.该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsin domain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶.     

单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达

单环刺螠(Urechis unicinctus)纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化得到的一组有抗凝和纤溶活性及较好生物安全性的纤溶酶。本研究为获得重组表达的UFE,根据该纤溶酶Ⅲ的(UFEⅢ)N端测序结果,设计简并引物,扩增出该蛋白的部分基因编码序列,利用5′-RACE PCR获得(UFEⅢ)的cDNA全长序列863bp,其中开放阅读框编码261个氨基酸。通过生物信息学分析其为丝氨酸蛋白酶家族成员,并与之前实验室提取的UFEⅢ进行同源性分析,推测其为一组同工酶。以PMD18-T-UFE为模板,扩增单环刺螠纤溶酶的成熟肽片段,构建重组表达载体pET32a-UFE和pET28a-UFE,转入Rosetta2(DE3)菌中诱导表达,UFEⅢ分别以可溶蛋白和包涵体的形式得到了表达。     

一种来自海洋细菌的血纤维蛋白溶酶的分离纯化及性质研究

利用硫酸铵分级盐析、DEAE－纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析法对由海洋细菌FE92－8分泌的纤维蛋白溶酶进行了分离纯化，结果得到SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳单一区带。性质研究发现，该酶分子量为12.6kD，等电点为7.45，琼脂糖－纤维蛋白平板法测得该酶作用的最适温度为50℃，最适pH为8.0，在37℃，pH为8.0的情况下表现出很好的稳定性，温度起来50℃热稳定性较差，在碱性环境中稳定性较在酸性环境中稳定性强，阴性平板和阳性平板对比实验发现，该酶只有纤溶活性而无激酶活性，体外实验发现，该酶具有快速溶解血栓的能力。     

纤溶酶原:结构、功能与进化

纤维蛋白溶解系统是凝血系统的重要组成部分,对于维持血液的流动性和血管的完整性起着至关重要的作用。作为纤溶系统中心组分的纤溶酶原在其激活剂的作用下转变为活性形式的纤溶酶,进而降解纤维蛋白原,并能溶解血栓。纤溶酶也参与金属蛋白酶类和脂氧合酶类激活作用,还与细胞许多迁移相关的生理和病理过程相关诸如癌症、血管增生、卵子成熟、胚胎发生、伤口愈合以及病原侵入相关。本文简要概述了纤溶酶原和纤溶酶的结构、功能及其进化的研究进展。     

单环刺螠纤溶酶UFEⅠ药效作用和免疫原性的初步研究

为评价单环刺螠纤溶酶(UFEⅠ)的抗凝血和抗血栓形成作用,并对其免疫原性进行初步研究.文中通过小鼠血液凝固时间实验和大鼠颈动脉血栓形成模型研究UFE Ⅰ抗凝血和抗血栓作用.用纯UFE Ⅰ为抗原免疫小鼠,间接ELISA法测定特异性抗体的动态变化及效价.结果UFE Ⅰ能明显延长小鼠凝血时间,有效抑制大鼠体内的血栓形成,并显著降低大鼠纤维蛋白原含量(FIB),延长活化部分凝血活酶时间(APTT).免疫原性的研究结果为UFE Ⅰ末次免疫小鼠后,产生微量特异性抗体,且抗体水平呈现先升后降的动态变化;方阵法确定了ELISA的优化条件,测定UFE Ⅰ免疫后产生的抗体效价为1∶1 280.本文研究显示,单环刺螠纤溶酶UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用,在小鼠体内产生一过性抗体,但对动物机体不造成负面影响.     

单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性

硫化物是1种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶(SQR)是硫化物代谢的关键酶。单环刺螠是1种生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物。本研究为了获得具有活性的单环刺螠SQR,将其基因的开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的表达,后采用稀释复性的方法对重组蛋白进行复性。经IPTG诱导后该重组蛋白主要以包涵体形式存在。用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白。首次通过蛋白复性的方法获得具有活性的单环刺螠SQR,确定最佳稀释复性条件为pH=8.0,蛋白浓度20μg/mL,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽=10∶1,复性时间为96 h。     

海洋假单胞菌纤溶酶的酶学性质的研究

从一株海洋假单胞菌中分离制备出一种具有纤溶活性的酶 ,对其酶学性质进行实验研究结果显示 :该酶的分子量是 2 1k D,等电点是 7.4～ 7.5 ;最适作用 p H是 8.0 ,最适作用温度是 5 0℃。该酶具有降解苯甲酰 - L -精氨酸乙酯盐酸盐 (BAEE)的活性 ,酶的动力学分析表明 :Km =0 .87mmol/ L,Vmax=1.80× 10 -3 mmol/ L s-1。     

虾头几丁质酶的研究

用中国对虾Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ虾头经处理制得几丁质酶酶液，再经抽提、沉淀和精制几丁质亲和层析，纯化倍数达１０８倍，比活３４４ＩｍＵ·ｍｇ－１蛋白质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，测得分子量为４４７００，等电点为４．５，最适ｐＨ为５，最适温度５５℃。本法简单易行，可应用于大规模生产中。     

虾头几丁质酶的研究

用中国对虾Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ虾头经处理制得几丁质酶酶液，再经抽提、沉淀和精制几丁质亲和层析，纯化倍数达１０８倍，比活３４４ＩｍＵ·ｍｇ＾－１蛋白质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，测得分子量为４４７００，等电点为４．５，最适ｐＨ为５，最适温度５５℃。本法简单易行，可应用于大规模生产中。     

单环刺螠转录因子基因Sp8的克隆、原核表达和重组蛋白纯化

转录因子Sp是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员,可与某些基因的上游调控序列结合,参与基因的转录调控。本研究采用同源克隆和RACE技术,获得单环刺螠的Sp8的全长cDNA,该序列长1 913bp,开放阅读框1 521bp,编码506个氨基酸;将其开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃条件下,经1mmol/L IPTG诱导表达4h,获得以包涵体形式存在的重组蛋白pET28a-SP,使用8mol/L尿素溶解包涵体,并通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白,SDS-PAGE分析该蛋白的分子量约为50kD。Sp8蛋白体外表达的成功将为研究单环刺螠相关基因的转录调控打下基础。     

利用色谱和飞行时间质谱方法分离并鉴定七鳃鳗血清中凝集素

本研究利用阳离子交换和分子筛的方法成功分离鉴定出分子量为105kDa,以多聚体形式存在七鳃鳗凝集素。实验结果表明,首先运用阳离子交换色谱方法能够将七鳃鳗血清混合组分进行初步分离,结合凝集活性鉴定方法,鉴定凝集活性最强组分存在于第二峰中。其次;利用分子筛方法将具有凝集活性组分进一步分离,最终得到分子量为105kDa左右具有凝集活性组分。结合Native-PAGE和SDS-PAGE结果表明,凝集活性组分以三聚体形式存在。同时,飞行时间质谱方法鉴定结果为凝集素（gi:13094239）。最终,体外鉴定结果表明七鳃鳗凝集素对兔红细胞和山羊红细胞均具有较强的凝集活性。七鳃鳗凝集素的分离纯化对研究七鳃鳗先天免疫防御机制和可变淋巴受体介导的适应性免疫防御机制均具有重要意义。     

久效磷对单环刺螠体内几种酶活性影响的初步研究

运用冰冻切片技术和酶组织化学的方法研究了长期暴露于不同质量浓度久效磷(0,50,100,150ng/L)下的单环刺螠(Urechisunicinctus)体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、细胞色素C氧化酶(CCO)、碱性磷酸酶(AKP)的活性变化。实验表明,AChE在单环刺螠的体壁上呈现出较强的酶活性,活性位点处为红棕色的颗粒沉淀、并随久效磷胁迫浓度的提高显色越来越深;消化道切片上基本上没有AChE的活性。CCO在单环刺螠的体壁及肠道上都呈现出较强的酶活性,活性位点显示为棕色;肠道上,不同质量浓度组由低到高其CCO活性位点依次增多、显色也依次加深。低质量浓度久效磷(<150ng/L)胁迫对单环刺螠体内的AKP活性没有明显的影响。     

一株单环刺螠致病弧菌的分离鉴定、生长特性研究及药敏分析

对患病的单环刺螠幼体3 000～4 000只/kg肠道内病原菌进行分离鉴定、生长特性研究及药敏分析,为人工养殖单环刺螠幼体过程中出现的疾病提供治疗依据。对患病幼体肠道内的病原菌进行分离纯化、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析、人工回接感染试验、生长曲线测定、最适生长温度、pH、盐度的探究;采用K-B纸片扩散法对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、头孢唑林、四环素中度敏感,对阿奇霉素、新霉素、万古霉素、利福平、红霉素、克林霉素、阿莫西林进行药敏试验;并对抑菌效果最好的药品进行安全性检测。分离纯化后经生理生化鉴定获得一种弧菌命名为菌株SX-1,16S rRNA基因序列分析极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrioneocaledonicus),人工回接感染试验表明SX-1是单环刺螠幼体从沙底钻出,活动能力减弱,体表变红症状的致病菌,生长特性研究表明其最适生长温度、pH、盐度分别为30℃, 6.0, 35;药敏试验结果表明, SX-1对氯霉素、羧苄西林、氧氟沙星、头孢曲松高度敏感,安全性检测实验表明,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。从单环刺螠肠道内分离获得了一种极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrio neocaledonicus)的致病菌SX-1。对于感染该种弧菌的单环刺螠,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。我们的实验结果对于预防并治疗人工养殖过程中单环刺螠患病提供理论依据和治疗模式,因而具有实际指导意义。     

单环刺螠中肠和后肠交替氧化酶对硫化物的应激反应

外源性硫化物可通过抑制或阻断线粒体电子传递经典途径而对生物体产生损伤甚至致死,交替氧化酶(Alternative Oxidase,AOX)是线粒体硫化物氧化电子传递分支途径中的1个关键酶。为了研究硫化物环境中单环刺螠的生存对策,本文利用间接竞争性ELISA和酶活性分析等技术检测了单环刺螠在硫化物应激前后中肠和后肠中AOX的蛋白含量以及活性的变化。结果显示:在未处理的单环刺螠中,后肠的AOX蛋白含量和酶活性均高于中肠。当单环刺螠暴露在硫化物(50和150μmol·L-1)环境中时,2个器官的AOX含量和酶活性水平均随着硫化物浓度的提高和暴露时间的延长而提高,并且150μmol·L-1硫化物处理组的单环刺螠2个器官AOX蛋白含量和酶活性普遍高于相同处理时间下的50μmol·L-1组。结合已报道的单环刺螠硫化物应激下细胞色素c氧化酶活性的变化,提出单环刺螠体内存在线粒体电子传递分支途径;提高组织线粒体中AOX活性是其应对环境硫化物毒性的对策之一。     

单环刺螠Bcl-xL基因的鉴定及对硫化物的应激反应

Bcl-xL是Bcl-2家族中一类重要的抗凋亡因子,其功能主要是抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生。为了探知Bcl-xL在生物硫化物应激中的作用,本实验以耐硫生物单环刺螠(Urechis unicinctus)为研究对象,RACE扩增获得一个长度为1 426 bp的单环刺螠Bcl-xL全长c DNA序列,推导的氨基酸序列包含Bcl-xL4个保守的BH结构域和1个跨膜区域。使用该c DNA的完整开放阅读框序列,构建了原核表达载体p ET28a-Bcl-xL,体外诱导表达该重组蛋白;镍柱纯化得到纯度为90%的纯化蛋白,并制备多克隆抗体。Western blotting结果显示:单环刺螠暴露于50μmol/L硫化物中2 h-24 h内其呼吸肠中Bcl-xL含量显著增加(P0.05),然而在150μmol/L硫化物中48 h-72 h内其呼吸肠Bcl-xL含量显著降低(P0.05),暗示Bcl-xL抑制细胞凋亡途径在单环刺螠应对低浓度硫化物暴露时发挥作用,而在高浓度硫化物暴露下Bcl-xL不能发挥抑制细胞凋亡的作用。     

铜离子对单环刺螠的毒性及对体壁抗氧化酶活性的影响

本文研究了重金属Cu2+对单环刺螠毒性效应。通过急性毒性试验,确定了Cu2+对单环刺螠24h、48h、72h及96h的半致死浓度,并计算得到其安全浓度为0.0675mg/L,高于渔业水质。通过酶活测定,发现Cu2+对单环刺螠抗氧化酶活性有影响。实验结果表明当暴露于0.25mg/L及0.50mg/L浓度的Cu2+中,24h时,单环刺螠体壁SOD、GPx活性显著提高(P<0.05);之后,随着暴露时间的增长,SOD、GPx、CAT三种酶活性均有所下降,除SOD外,其余两种酶活性均低于对照组,其中0.50mg/L组96h时CAT的活性显著低于对照组(P<0.05),说明Cu2+抑制了GPx及CAT的活性,并导致了虫体的死亡。     

酶解蓝圆鲹蛋白制备降血压肽的工艺研究

以蓝圆(Decapterus maruadsi)鱼肉蛋白为原料,选用6种蛋白酶在各自适宜的条件下酶解制备鲹降血压肽,通过检测酶解产物对血管紧张素转化酶(ACE)的体外抑制活性,筛选出木瓜蛋白酶为制备蓝圆降血压肽的最佳用酶。考察了不同水解度的酶解产物对ACE抑制效果,当水解度为13.7%时,产物对ACE的最高抑制活性可达67.4％。在此基础上,分别了考察酶解时间、初始酶用量、初始底物浓度、酶解温度和 pH 值对酶解工艺的影响,鲹得到制备蓝圆降血压肽的适宜酶解工艺为：初始酶用量鲹为7000 U/g,初始底物浓度为25 g/L,酶解温度为45℃, pH为7.0,酶解240 min。采用超滤技术对酶解产物活性组分进行分离富集,发现产物中高活性部分均可富集于10 kDa和5kDa渗透液中,且高活性组分分子量主要集中在5 kDa以下,该组分对ACE的活性抑制率为88.47%。     

甘糖酯对大鼠尿激酶型纤溶酶原激活物活性的诱导作用

为了研究甘糖酯对大鼠体内尿激酶型纤溶酶原激活物 (urokinase PlasminogenActivator,u PA)活性的影响 ,采用溶解圈中和抑制法和发色底物法检测了大鼠口服甘糖酯后体内u PA活性的变化情况。结果表明 :甘糖酯可提高大鼠体内血液的纤溶活性 ,主要表现为 u PA活性升高。以不同剂量的甘糖酯连续喂药 10 d后 ,发现喂药组大鼠 u PA活性明显高于对照组 ,喂药组大鼠血浆 u PA活性升高同喂药剂量正相关 ,在 0～ 10 0 mg/ kg的剂量范围内 ,随喂药剂量增加而升高。提示在一定的剂量范围内甘糖酯可提高大鼠体内 u PA活性 ,激活纤溶系统 ,提高血液纤溶活性 ,表现出良好的抗栓作用