大菱鲆Hepcidin基因的克隆和真核表达载体的构建

Hepcidin是鱼类的一种重要的抗菌肽.通过比较GenBank中不同Hepcidin基因的同源相似性,设计出特异性的引物,以我国海水养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus L)肝脏为模板利用RT-PCR 技术克隆获得了一条基因.使用生物信息学手段对该基因序列进行了比对和分析,证实这条基因为Hepcidin1 precursor基因,属于Hepcidin基因家族.通过设计引物在Hepcidin基因的5′和3′端分别引入EcoR I和NotⅠ酶切位点.经过双酶切后获得具有EcoR I和Not I酶切位点的Hepcidin成熟肽片段,并与同样使用该酶线性化的表达载体pPIC3.5K连接.构建了表达载体pPIC3.5K/Hepc1,并将其导入到酵母基因组中,完成了真核表达载体的构建,为Hepcidin的真核表达作了基础性的准备工作.     

大菱鲆钙激活型钾离子通道基因TSKCa的克隆和序列分析

钙激活型钾离子通道蛋白(KCa)是位于细胞膜表面调节细胞功能的一类膜蛋白.通过设计特异性引物,以我国海水养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)血液cDNA为模板,利用RT-PCR 技术克隆获得了一条基因片段.生物信息学分析证实该片段来自钙激活型钾离子通道基因SKCa (小电导钙激活型钾通道)家族.设计巢式PCR引物,通过5′RACE和3′RACE分别克隆得到了该基因的5′端序列和3′端序列.使用生物学软件拼接3段序列得到了大菱鲆钙激活型钾离子通道TSKCa基因的全长序列.TSKCa基因cDNA全长为1 698 bp,其中开放阅读框长度为1 632 bp,编码的TSKCa蛋白有544个氨基酸.比对TSKCa蛋白与GenBank中已有的SKCa蛋白序列,证实其序列同源性很高.使用网络DAS和srsbin服务器对TSKCa蛋白进行跨膜结构预测和疏水性分析,并结合已有的研究结果推测TSKCa蛋白的结构由S1～S6六个跨膜结构域和一个孔道区(P区)组成.     

企鹅珍珠贝Creb2基因的克隆及表达分析

CREB(cAMP response element binding protein)是一种真核生物中广泛存在的调控因子。为了探讨企鹅珍珠贝(Pteria penguin)Creb基因的序列和表达特征,为进一步阐述Creb的生理功能提供科学依据,本研究利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝一个Creb基因的全长序列,分析其理化性质和进化地位;利用荧光定量PCR分析Creb基因在各组织中的表达特征。结果表明,该企鹅珍珠贝Creb基因的c DNA全长为1484 bp,其中开放阅读框(ORF)为1071 bp,编码356个氨基酸,5′非编码区为218 bp,3′非编码区为195 bp,C端包含一个碱性亮氨酸拉链结构(basic region leucin zipper,b ZIP)。预测其分子质量为39.49 k D,等电点为4.43。序列比对显示该企鹅珍珠贝Creb基因与欧洲平牡蛎(Ostrea edulis)和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的Creb2同源性(identity)最高,分别为46.3%和46.1%,故命名为pp Creb2;系统进化树分析结果与传统形态学分类结果相吻合。荧光定量PCR分析显示,pp Creb2在企鹅珍珠贝的各个组织中组成性表达,其中在足中表达量最高,鳃中其次。     

口虾蛄高血糖激素基因全长cDNA的克隆及表达分析

本文首次采用RACE技术获得口虾蛄(Oratosquilla oratoria)眼柄部高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)基因cDNA全长序列,共2 421 bp,5'UTR长度为180 bp,3'UTR 为1 821 bp,开放阅读框(ORF)长420 bp,编码139个氨基酸。预测蛋白二级结构α-螺旋23.74%,延伸链占23.02%,无规则卷曲占53.24%,预测分子量为15.47 kD,等电点(pI)为7.049。CHH成熟肽包含6个CHH家族中位置保守的Cys残基,C端为GK,推断为ES型CHH基因。聚类分析表明:口虾蛄CHH和十足目CHH聚为同一个分支的两亚群,具有较近的亲缘关系。荧光定量PCR分析结果表明,CHH基因在肠中表达量最高,在眼柄、触角中有较高的表达量,在肌肉中表达量相对较低,在卵巢中表达最低,而在精巢中不表达。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因的cDNA克隆及表达分析

通过RT-PCR及Smart?TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因cDNA全长序列。该基因cDNA全长1662bp,编码一个由492个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点为6.348,分子量大小为56.68kD。氨基酸序列中含有CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。经氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,与岸蟹(Carcinus maenas)的同源性最高,达到75%。实时荧光定量PCR结果表明,CYP2基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。肌肉注射磺胺嘧啶后,三疣梭子蟹高、中、低三剂量组CYP2基因表达较对照组都有上调,并具有时间差异性,低剂量组表达量逐渐降低,趋于对照组,中剂量组和高剂量组表达量先升高后降低,6h后同一时间点,均是高剂量组表达最高,低剂量组最低。表明磺胺嘧啶可诱导三疣梭子蟹CYP2基因,CYP2基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。     

文蛤C型凝集素基因(Mm-Lec1)的克隆与表达分析

文蛤(Meretrix meretrix)是我国重要的滩涂养殖贝类,病害严重影响文蛤增养殖业,研究文蛤的免疫机制有助于解决文蛤的病害问题。C型凝集素(C-type lectin)参与先天免疫,在识别病原相关分子模式和激活体液免疫因子等方面发挥重要作用。本研究检索已构建的文蛤全长cDNA 文库,经过Blast比对得到了文蛤C型凝集素1(Mm-Lec1)基因的全长cDNA序列。Mm-Lec1序列全长586 bp,5'和3'非翻译区(UTR)的长度分别为21 bp和79 bp,开放阅读框长度为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.65 kD,理论等电点为4.98。预测的氨基酸序列中含有信号肽(Met1-Ser19)、糖识别结构域(CRD)和糖结合位点(QPN)。Mm-Lec1的三级结构是紧凑型,含有β片层结构。同源性分析结果表明,Mm-Lec1与其他物种C型凝集素相似度在20%~32%;邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进化树分析结果表明,Mm-Lec1与紫贻贝CTL 6和栉孔扇贝CTL A聚为一支。实时荧光定量分析结果显示,Mm-Lec1在文蛤鳃、肝胰腺、闭壳肌、外套膜、性腺和血细胞中均表达,其中鳃表达量最高,血细胞次之,性腺中表达量最少;在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激实验中,6 h时Mm-Lec1在血细胞中的表达量最低,48 h表达量最高,暗示Mm-Lec1参与文蛤抵御细菌入侵的免疫过程。     

真蛸FAXDC2基因的克隆及其表达分析

FAXDC2(fatty acid hydroxylase domain-containing protein 2)是脂肪酸羟化酶家族中的成员,在脂肪酸的合成与代谢中发挥重要功能。真蛸(Octopus vulgaris)是中国南方近海的经济种类,为了研究饥饿对真蛸FAXDC2(OvFAXDC2)基因表达的影响,本研究从课题组真蛸转录组数据库中筛选获得OvFAXDC2基因序列。采用从头至趾方法进行验证,最终获得OvFAXDC2的cDNA全长序列共1384 bp。它包含100 bp的5′非编码区(UTR)、228 bp的3′UTR和1056 bp的开放阅读框(ORF), ORF共编码351个氨基酸,预测其分子量为3.98 kDa,理论等电点为8.93。系统进化树分析显示,真蛸和加州双斑蛸(O. bimaculoides)聚为一支,而与其他无脊椎动物分开。实时荧光定量PCR分析表明, OvFAXDC2在消化腺中表达量最高,在鳃和鳃心中次之。在幼体饥饿试验中,随着时间的推移, OvFAXDC2表达量先升后降,在第三天达到最高,表明OvFAXDC2表达量的变化趋势可作为幼体代谢是否正常的一个指标。     

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库, 利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列, 并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明, 泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp, 开放阅读框为708bp, 编码236个氨基酸; 蛋白结构预测显示, Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域, SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成, SH3结构域主要由β-折叠片组成, 具备典型的结构特征; 氨基酸序列比对发现, Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%, 而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示: Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达, 而在血液中的表达量极显著地高于其它组织; 在泥蚶的不同发育阶段中, Tg-GRB2 mRNA在 2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量, 而在D形幼虫中表达量最高, 表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。     

青蛤(Cyclina sinensis)TLR2基因的克隆与表达分析

利用转录组文库分析得到青蛤(Cyclina sinensis)的Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)基因序列,采用荧光定量PCR法分析该基因的表达过程。结果显示,青蛤TLR2基因的cDNA开放阅读框为2082bp,编码693个氨基酸,具典型的LRRs、单次跨膜区和TIR结构域。该基因在血淋巴中的表达量最高,与肝脏、鳃、外套膜、闭壳肌和性腺有显著性差异(P0.05)。在鳗弧菌和Poly I:C刺激下,青蛤血淋巴中TLR2基因3h开始升高,48h达到最大值,与对照组和空白组有极显著性差异(P0.01);藤黄微球菌刺激下,血淋巴中CsTLR2基因3h开始升高,48h亦达到最大值,实验组与对照组有显著性差异(P0.05)。     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

褐藻低聚糖对提高大菱鲆免疫机能的作用

研究了在养殖过程中投喂酶解制备的褐藻低聚糖对大菱鲆(Scophthalmus maximus)鱼苗免疫机能的影响,对大菱鲆鱼苗血液中的酸性磷酸酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和头肾淋巴细胞吞噬能力进行了测定。实验发现,褐藻低聚糖能够提高大菱鲆血液中酸性磷酸酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活力;头肾淋巴细胞吞噬率较对照组提高15.4%,吞噬指数则无显著差异。结果表明在大菱鲆鱼苗的养殖过程中褐藻低聚糖可作为一种非特异免疫调节剂提高大菱鲆机体的免疫能力。     

养殖大菱鲆腹水病病原的研究

从患腹水病的大菱鲆(Scophthalmus maximus)肝和腹水中分离得到优势菌株CW-7,人工感染证实该菌株对大菱鲆幼苗有较强的致病性,腹腔注射1.4×103cfu/尾,即可引起感染鱼100%的死亡,症状与自然发病鱼相似;病原菌为革兰氏染色阴性,直杆状(0.4~0.8)×(0.6~2.0)μm,周生鞭毛运动,氧化酶阴性,兼性厌氧菌,兼具葡萄糖氧化和发酵(O/F)2种代谢途径,其生理生化特征与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)一致;对该菌的16SrDNA序列克隆、测序后在GenBank中进行了序列对比分析,结果与迟缓爱德华氏菌的序列高度一致(99.92%),进化树分析表明属于同一类群,确定该菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。该菌株对庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素B等14种抗生素敏感,而对青霉素、萘啶酸、复方新诺明等14种药物均具有抗性。     

转“全鱼”溶菌酶基因大菱鲆的研究

用大西洋条鳕(Macrozoarces americanus)抗冻蛋白启动子opAFP promoter和牙鲆(Paralichthys olivaceus)c型溶菌酶基因构建“全鱼”溶菌酶基因元件opAFP—ly，首次应用电脉冲精子介导法将该基因片段导入到大菱鲆(Scophthalmus maximus)受精卵内，获得原代转基因大菱鲆。先后采用单因子方法和正交实验方法，重复实验确定了最适导入条件：脉冲电压为400V／cm，脉冲次数为5，脉冲宽度为25ms，外源DNA浓度为50mg/L。利用最适导入条件，实现基因元件大规模转移。采用PCR技术对1月龄的原代转基因大菱鲆仔鱼的染色体DNA进行分析，结果表明外源基因的整合率可达28％。     

牛蒡寡糖对大菱鲆生长和免疫机能的影响

将自主研发的牛蒡寡糖作为添加剂添加到大菱鲆的基础饲料中,探讨其对大菱鲆(Scophthalmus maxi-mus)的生长和免疫机能的影响。经过60 d不同剂量(1.0%,2.0%,4.0%,6.0%)的饲喂试验,分别从每组随机抽取鱼体,测定其生长指标和血清中ACP,AKP,LSZ,SOD和PO等多种免疫相关酶的活力以及血液中白细胞的吞噬活性。结果表明,牛蒡寡糖作为一种非特异性免疫调节剂对大菱鲆表现出优良的促生长作用,还能显著提高大菱鲆的免疫相关酶活力和白细胞的吞噬活性,从而提高大菱鲆的非特异性免疫力,其适宜添加量为4.0%。牛蒡寡糖可以开发成为水产动物的促生长剂和免疫增强剂。     

Ciliate Uronema marinum is the causative agent of scuticociliatosis in farm raised turbot Scophthalmus maximus

To identify the pathogen that causes scuticociliatosis in farmed-raised turbot Scophthalmus maximus , we isolated a ciliate from the brain tissue of an infected turbot and identifi ed it as Uronema marinum based on morphological and molecular evidence. We then infected the turbots in artifi cial laboratory settings with pure cultured U . marinum . The infected turbots showed syndromes similar to those observed in naturally infected ones. Furthermore, microscopic examination and PCR detection confi rmed the presence of the ciliate in the tissues of those laboratory-infected turbots. To our best knowledge, this is the fi rst report of scuticociliatosis caused by U . marinum in farm-raised turbot S . maximus in China.     

大菱鲆2种类胰岛素样生长因子结合蛋白基因克隆及在成鱼和早期发育期中的表达

类胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)在调节IGF的生物学功能上起着重要的作用,利用简并引物扩增及RACE克隆技术,首次克隆得到大菱鲆IGFBP-1,-2基因cDNA全长序列。两个基因氨基酸序列都分为保守的N端和C端以及高度特异的L区域3个部分,其中N端和C端共包含18个半胱氨酸残基,N端存在一段保守的(GCGCCXXC)结构,C端存在一段保守的(CWCV)结构,这些结构在与IGF相互作用以及调节与IGF结合的亲和性和稳定性起重要作用。组织表达分析表明,igfbp-1主要在肝脏及脾中大量表达,在其他组织中表达量较少,igfbp-2除在肌肉中没有检测到表达外,在其他组织中均有表达,其中肝脏脑、心、肾、肠中表达量较高。广泛的组织表达模式表明IGFBP是通过自分泌和旁分泌来调节IGF的功能。对于胚胎发育期表达分析表明,igfbp-1在整个发育期均检测到表达,igfbp-2在胚体期开始有表达,结果表明igfbp-1和igfbp-2在胚胎发育过程中的细胞生长以及组织器官分化都起着重要的生理学作用。     

Estimation of genetic parameters for upper thermal tolerances and growth-related traits in turbot Scophthalmus maximus

An abnormally high temperature produces a stress response in turbot causing large economic losses in the turbot aquaculture industry of China. A genetic improvement of the upper thermal tolerance (UTT) of turbot could allow cultured fi sh to adapt. A genetic evaluation of UTT is required for determining the practicability of including this trait into a breeding program. In this study, data were recorded from a temperature tolerance test conducted on 3 200 individual turbots from 32 full-sib groups. A cross-sectional linear model and a cross-sectional threshold probit model were used to analyze the test-period survival and a cross-sectional threshold logit model was used to analyze the test-day survival. In addition, phenotypic and genetic correlations between body weight and survival data were estimated. The estimated heritability values obtained from the cross-sectional linear model (CSL), the cross-sectional threshold (probit) model (THRp), and the cross-sectional threshold (logit) model (THRl) were 0.247 9±0.108 3, 0.288 3±0.161 2, and 0.106 9±0.045 2, respectively. The correlation coeffi cients among the full-sib family estimated breeding values (EBVs) obtained from the three models were greater than 0.998 6 and all models produced an almost identical family ranking. The accuracies of selection obtained with the CSL, THRp, and THRl model were 0.773 8, 0.775 4, and 0.784 4, respectively, the greatest from the THRl model. The genetic correlations between body weight and survival data EBVs from the CSL, THRp, and THRl models were 0.020 1,-6.201 1×10^-4 , and -3.115 4×10^-4 , respectively, and the phenotypic correlations between the two traits were -0.837 1 and -0.667 1, respectively. The findings of this study provide background information to determine the best strategy of selection for the genetic improvement of UTT in turbot.     

壳寡糖对大菱鲆生长和免疫功能的影响

以基础饲料中添加500mg/kg壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)喂养初始体质量为(12.2±0.01)g的大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)8周,研究COS对大菱鲆生长、血清免疫相关酶活性和抵抗迟缓爱德华氏菌感染能力的影响。结果表明:饲料中添加壳寡糖后,大菱鲆成活率得到提高,特定生长率和增重率分别提高了15.79%和25.26%。相比对照组,饲料中添加壳寡糖饲养的大菱鲆血液中性粒细胞的吞噬指数提高了4.51%,酸性磷酸酶活性提高了32.89%,同时,大菱鲆抵抗迟缓爱德华氏菌感染的免疫保护力显著增强(P<0.05)。研究表明,在饲料中添加壳寡糖能够提高大菱鲆的生长、非特异性免疫功能和免疫保护力。