副溶血弧菌胶体金快速检测试纸的研制及应用

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海水养殖动物弧菌病的主要病原菌之一。为实现对该菌的现场快速检测,本文以制备的兔抗副溶血弧菌多克隆抗体作为金标抗体,提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌蛋白,以不同浓度的4种抗原蛋白作为4条检测线(T1~T4),特别在T4线设置全菌蛋白,基于竞争免疫层析原理研制出副溶血弧菌胶体金快速检测试纸。使用该试纸检测了副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri),检测结果表明其能够准确鉴别副溶血弧菌感染,排除其他菌的交叉反应干扰。副溶血弧菌快速检测试纸的最低检测限为5×105 cfu·mL^-1,感染副溶血弧菌的牙鲆组织的检测结果与ELISA结果一致。本文研制的试纸具有较高的特异性与准确性且操作简单,为现场快速检测副溶血弧菌提供了有力工具。     

迟缓爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制

本研究用纳米胶体金颗粒标记抗迟缓爱德华氏菌(AL60306NA1)单克隆抗体3A7并制备金标垫,将抗迟缓爱德华氏菌(AL60306NA1)单克隆抗体4F11与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,建立迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、海安气单胞菌、产碱假单胞菌、无乳链球菌、大肠埃希杆菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、类志贺邻单胞菌、鲁氏不动杆菌等15种水产常见病原菌没有交叉反应,与迟缓爱德华氏菌特异性反应,检测灵敏度为1×105cfu.mL-1,检测所需时间低于20min。所制备的迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。     

6种海洋致病性弧菌36kDa外膜蛋白特性分析

研究本着筛选和制备弧菌共同外膜蛋白亚单位疫苗,用十二烷基肌氨酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和创伤弧菌(V.vulnificus)6种海洋致病性弧菌的主要外膜蛋白, SDS-PAGE图谱比较发现这6种弧菌都存在36 kDa的外膜蛋白条带.通过电泳洗脱分离纯化这6种弧菌的36 kDa外膜蛋白,并制备了鳗弧菌菌株SJ060621的36 kDa外膜蛋白多抗.ELISA和Western-blot印迹结果显示,仅鳗弧菌SJ060621、S010610-1和哈维氏弧菌的36 kDa外膜蛋白存在免疫交叉反应;双向电泳分析了鳗弧菌SJ060621、S010610-1、哈维氏弧菌和溶藻弧菌的36 kDa外膜蛋白,2-DE图谱显示出鳗弧菌SJ060621和S010610-1均由3种等电点相近的蛋白组成,存在很高的同源性,2株鳗弧菌与溶藻弧菌和哈维氏弧菌在蛋白质组成数量和等电点上都存在较大的差异,结果说明通过主要外膜蛋白的分子量和免疫特性研究,可为筛选不同弧菌共同外膜蛋白的亚单位疫苗提供有利参考.     

4 种病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析

利用十二烷基磺酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、河口弧菌(V.aestuarianus)、霍乱弧菌(V.cholerae)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)4种致病性弧菌的主要外膜蛋白,通过SDS-PAGE分析比较4种弧菌主要外膜蛋白的组分。结果表明:4株弧菌的外膜蛋白电泳图谱一般可得到5～10条蛋白带,分子量多数集中在26~40 kD和48~85 kD。对所提取的4种弧菌主要外膜蛋白进行SDS-PAGE后,分别与自制的兔抗鳗弧菌血清、抗河口弧菌血清、抗副溶血弧菌血清进行Western-blotting印迹分析。结果显示每种全菌抗血清可与相应菌的外膜蛋白部分组分发生免疫反应,并与其他3种弧菌外膜蛋白的部分组分产生交叉免疫反应,这些反应条带分子量主要集中于30~48 kD之间。本研究为进一步研究致病性弧菌外膜蛋白免疫学特性提供参考。     

大黄鱼病原菌——溶藻弧菌的EuSA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌(0.05%甲醛,30℃,8h)制成菌苗,注射免疫实验兔获得抗血清.该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应.用该抗血清进行溶藻弧菌ELISA检测,其最低检测极限为97000cfu/ml.将该方法应用于养殖现场,检测结果为海水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%,表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

CPA-核酸试纸条快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)方法的建立及其在海产品检测中的应用

本研究将交叉引物恒温扩增技术(cross priming amplification,CPA)与核酸试纸条相结合建立一种副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)快速可视化检测方法。针对副溶血性弧菌特有的不耐热溶血素基因tlh的六个不同区域设计两对特异性引物和一对检测探针,通过优化反应条件确定了最佳反应体系。CPA-核酸试纸条方法对副溶血性弧菌的检测具有较强的特异性,对纯培养物的检测灵敏度达到58 cfu/m L,对污染牡蛎中副溶血性弧菌的检测灵敏度为5.2 cfu/g,比传统的PCR技术灵敏度提高了10倍,且具有较高的稳定性。交叉引物恒温扩增技术与核酸试纸条相结合的方法操作简便、特异性强、灵敏度高且能有效防止污染,可用于现场及基层单位副溶血性弧菌的快速检测。     

大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测

用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

基于rGroEL和rOmpC的牙鲆迟缓爱德华氏菌血清学诊断试纸条的制备

本实验旨在制备一种基于重组抗原rGroEL和rOmpC的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)血清学诊断试纸条,用于定性检测牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体水平。前期研究发现分子伴侣蛋白GroEL和外膜蛋白OmpC是迟缓爱德华氏菌的重要免疫保护性抗原。本研究重组表达获得高纯度的rGRoEL和rOmpC,以其免疫健康牙鲆制备抗血清,同时制备获得牙鲆抗迟缓爱德华氏菌全菌血清。ELISA结果显示rGroEL和rOmpC不存在抗原交叉,抗rGroEL和rOmpC血清均可与全菌发生阳性结合,且全菌抗血清也能识别rGroEL和rOmpC。将rOmpC、rGroEL及羊抗鼠IgG划线于NC膜分别作为检测线T1、检测线T2和质控线C,同时以制备的胶体金标记的鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体2D8固定于结合垫,构建获得胶体金免疫层析试纸条。将试纸条分别用以检测不同稀释度的各抗血清,检测过程可在15min内完成,结果显示制备的灭活全菌、rGroEL和rOmpC牙鲆抗血清分别最高稀释200、600与400倍时,均可使检测线T1与T2显红色。同时,以试纸条检测牙鲆免疫全菌灭活疫苗后不同时间点的抗血清,结果显示3、4、5周检测结果为阳性,且检测线颜色随着免疫后时间延长而加深。实验结果表明,制备的基于重组抗原rGroEL和rOmpC迟缓爱德华氏菌血清学诊断试纸条,操作简单,结果快速可见,可以定性检测牙鲆血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体水平,可应用于全菌灭活疫苗、rGroEL和rOmpC亚单位疫苗免疫效果的评价,同时也具有牙鲆爱德华氏菌病的潜在诊断价值。     

大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌（0.05%甲醛，30℃,8h）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应，用该抗血清进行溶藻水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%，表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病，也可能检测无病症带菌大黄鱼。     

应用LAMP-LFD技术可视化检测河流弧菌(Vibrio fluvialis)的研究

以河流弧菌(Vibrio fluvialis)为检测对象,将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)联合应用,建立了快速便捷的LAMP-LFD方法。该方法以河流弧菌的外膜蛋白omp U基因作为检测靶标,在其保守区域设计6条特异性引物(上游内引物由生物素标记),并在两条外引物的有效扩增区段内设计1条特异性探针,由异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记。使用引物进行有生物素标记的LAMP反应,产物与FITC标记的探针完成杂交,杂交产物在LFD上进行结果展示。结果表明,LAMP-LFD方法可特异性地检出河流弧菌,对近似物种如创伤弧菌等弧菌病原以及迟缓爱德华菌等其他水产养殖病原的检测均呈阴性。经优化,LAMP的反应条件为63°C反应25min,加上5min的探针杂交和3—5min的LFD显色,整个检测时程约35min。利用该方法最低可检测到1.0×10~2 CFU/m L的河流弧菌纯培养物,能够从污染强度为5.0×10~2 CFU/m L的组织样品中检测到该病原。该方法设备依赖性更低,仅需简单的恒温加热设备即可完成。因此,本研究建立的河流弧菌LAMP-LFD方法,具有操作便捷,设备依赖性低、灵敏度高和检测快速等优点,在河流弧菌的基层检测中具有良好的应用前景。     

溶藻弧菌的PCR快速检测方法

为建立溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR快速检测方法,本研究根据弧菌toxR基因的高变区序列设计1对扩增片段为161 bp的引物,进行了特异性和敏感性试验.结果表明该方法能特异地检测溶藻弧菌,每个PCR反应检测的敏感度为0.01 pg的DNA和3.7CFU的细菌.用溶藻弧菌人工感染大菱鲆,以建立的PCR方法检测感染鱼的肝、脾、肾阳性检出率为100%.该方法可用于对感染溶藻弧菌的水生动物疾病进行诊断.     

褐牙鲆卵黄原蛋白免疫胶体金技术的开发及其在环境雌激素检测中的应用

为快速检测海洋环境雌激素,本研究利用20 nm胶体金颗粒和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) Vtg单/多克隆抗体开发了夹心法免疫胶体金检测试纸条,并对胶体金标记条件、T线和C线抗体浓度等参数进行了优化,构建了褐牙鲆Vtg的快速检测技术。实验结果表明该胶体金试纸条工作范围为15.7～1 000 ng·mL^-1(R²>0.98),检出限为7.8 ng·mL^-1。本研究制备的胶体金试纸条检出限与目前常用的多种Vtg的ELISA方法相近,但是检测时间仅为15 min,比常规方法节省了约14 h。此外,该试纸条在存放30和90 d后,对Vtg的检测结果并无明显偏差,表现出较好的稳定性和可重复性。最后,通过测定多种常见环境雌激素(双酚A、雌二醇、乙炔雌二醇)暴露对雄性成年褐牙鲆血浆中Vtg的诱导情况,进一步验证了该试纸条在海洋环境雌激素活性检测中的应用。     

应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌

用灭活的河流弧菌(Vibrio fluvialis)抗原,注射免疫实验兔,制得凝集价为1∶5 120的抗血清。用试管凝集法检测了抗血清的特异性,再用免疫吸附法去除交叉反应,从而得到高效价、高特异性的抗河流弧菌血清。用所制备的抗血清在实验室中建立起河流弧菌荧光抗体检测技术(FAT),在荧光显微镜下可清楚地看到被标记的病原菌,整个检测过程只需3h。用河流弧菌感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),24 h后,用FAT测定牙鲆的血液、肾脏和肝脏中的河流弧菌,在血液中河流弧菌的检出率最高,其次是肾脏,肝脏的检出率最低。以上结果表明:荧光抗体技术可以快速、灵敏、准确地检测出牙鲆体内的河流弧菌。     

利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。     

溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测

建立了大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体检测方法，溶藻弧菌的特异性抗血清由新西兰兔制备，试管凝集法测定抗血清及交叉反应效价，吸附离心法去除交叉反应，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白，现场检测对具典型弧菌病表症大黄鱼病原检出率为100％，表观健康大黄鱼病原检出率为30％，养殖海水检测结果均为阴性，结果表明，间接荧光抗体检测法不仅可以用于已感染发病大黄鱼的快速检测，而且还能用于已感染未发病大黄鱼的检测。     

抗鲶爱德华氏菌多克隆抗体的制备及特性分析

利用2株黄颡鱼"红头病"病原菌——鲶爱德华氏菌的灭活疫苗作为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体特性进行了分析。测定获得多抗效价分别为1∶215和1∶214,2株病原菌之间存在很强的交叉反应,且2种多抗均与鲶爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、火神弧菌、河流弧菌、创伤弧菌标准菌株存在交叉反应,与粪肠球菌、大肠杆菌、酿脓链球菌、海豚链球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、类产碱假单胞菌标准菌株均无交叉反应。免疫印迹实验结果表明,2株病原菌的主要抗原决定簇相同,分子量分别为61.1,46.6,41.3,28.8和19 kDa。本实验得到了黄颡鱼"红头病"致病菌高效价的多克隆抗体,可以作为初步筛选"红头病"病原菌的工具,为建立快速有效的疾病监测方法和进一步的免疫学防病研究提供了依据,奠定了基础。     

3种致病弧菌感染对大黄鱼7种酶活性的影响

大黄鱼溃疡病主要由3种致病弧菌引起:溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈维弧菌V. harveyi和副溶血弧菌V. parahaemolyticus。为了解大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理,对其疾病防御提供重要的理论基础,本实验将健康的大黄鱼随机分为3个实验组和1个对照组,分别注射0.2 mL的哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水。在人工感染后的第0,1,2,4,7,10,13,16,20天分别采样,通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性,比较这3种致病弧菌对大黄鱼影响的差异性。结果表明:在感染后的1～10 d,实验组大黄鱼血清中血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性变化,总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于-致的现象,且不同病原菌之间存在-定的时效差异。 碱性磷酸酶(AKP)对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感,ACP、POD和MPO对溶藻弧菌反应较敏感,LSZ和PO对副溶血弧菌反应较敏感。     

养殖近江牡蛎致病弧菌的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌,人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组.3株细菌均为革兰氏阴性,短杆状,能运动.常规生理生化和Biolog 细菌鉴定系统测试结果表明,菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V. proteolyticus亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V. carchariae亲缘关系最近.为了进一步确定它们的分类学地位,分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列,分析相关细菌相应序列的同源性,并构建系统进化树.结果表明, 菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近,菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近,菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近.因此菌株A3G-2、A2G-5B 和B1X-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌.组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊,表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落,管腔扩大,进而管壁解体,消化盲囊出现大面积受损.     

分子鉴定方法研究大亚湾水体弧菌种类变化

借助分子鉴定方法监测大亚湾水体中弧菌Vibrio种类季节性动态的变化规律.通过增菌培养、菌株分离,在224份海水中共分离出弧菌368株,并用分子生物学辅助生化鉴定方法鉴定弧菌菌株.结果表明,在大亚湾海域水体中鉴定的弧菌种类有溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈氏弧菌V.harveyi和创伤弧菌V.vuinificus,没有检测到霍乱弧菌V.cholerae、拟态弧菌V.mimicus、河流弧菌V.fluvialis和霍利斯弧菌V.hollisae.溶藻弧菌和副溶血弧菌为优势菌群,分别占弧菌总数的27.99%和21.74%.