中国明对虾体壁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)的分离纯化及其酶学性质,作者以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)体壁为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、SephadexG-100柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂,纯化酶比活力为3938.56U/mg。通过SDS-PAGE凝胶电泳,测得该酶亚基分子量为48.88 kD。酶的最适pH为6.0,最适温度为45℃;该酶在pH 6.0~9.0区域较稳定,温度稳定性范围是20~35℃,45℃下处理1 h酶活力丧失65.04%。酶水解对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的Km为0.229 mmol/L,Vmax为5.00μmol/(L·min)。进一步研究金属离子对酶活力的影响,结果表明:Li+、Na+和Ba2+对酶没有明显影响,Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Al3+对酶均有不同程度的激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb2+对酶呈抑制作用,1.0 mmol/L Hg2+对酶呈激活作用,而10 mmol/L Hg2+使酶活力降低42.37%。     

僧帽牡蛎碱性磷酸酶性质的研究

从僧帽牡蛎分离纯化出一种碱性磷酸酶,采用Sephadex G-200凝胶过滤柱层析法测得该酶分子量为1.57×10~5.以对硝基苯磷酸为底物,该酶的最适温度为43℃,最适pH值为10.0.在37℃和pH值为10.0的条件下,酶催化反应的米氏常数(K_m)为9.68×10~(-4)mol/dm~3,活化能(E_a)为45.85kJ/mol,温度系数(Q_(10))为1.80(30～40℃).对该酶的热稳定性研究表明:其在45℃以下较为稳定,50℃以上明显失活,并测定了该酶的热失活速度常数.金属离子对酶活力的效应研究结果表明:Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Co~(2+)对酶有激活作用,Ag~+、Hg~(2+)、Zn~(2+)表现为抑制作用,Cd~(2+)几乎没有影响.Mg~(2+)是较有效的激活剂,表现为部分非竞争性效应,激活常数(K_a)为2.48×10~(-4)mol/dm~3,有Mg~(2+)存在时该酶活性中心的转换数量是无Mg~(2+)时的4.0倍.几种效应物对酶的抑制机理研究表明:HPO_4~(2-)、HAsO_4~(2-)、Cys为竞争性,其抑制常数分别为1.61、1.18和0.15mmol/dm~3;L-Phe为反竞争性,抑制常数为3.26mmol/dm~3.     

中国明对虾蛋白酶的分离纯化及其酶学性质研究

以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)肝胰脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-100和DEAE-32柱层析纯化,经PAGE获得蛋白酶,该酶的比活力为96.752U/mg。SDS-PAGE显示一谱带,测得酶亚基分子量为36.3kDa,凝胶层析法测得酶分子量为100.9kDa,推断该蛋白酶由3个相同亚基组成,等电聚焦电泳法测得酶的等电点pI为9.65。以酪蛋白为底物,研究蛋白酶催化反应的动力学参数。结果表明:蛋白酶的最适pH、最适温度、Km和Vmax分别为8.0、65℃、4.578mg/mL和0.273U/min;酶在pH为5.0~10.0范围内较稳定,在20~45℃之间具有较好的热稳定性,在50℃以上热稳定性迅速下降。Mg2+对酶活力没有影响,Ca2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+和Hg2+对酶有不同程度的抑制作用,其中Hg2+的抑制作用最强,10mmol/L Hg2+可使酶活力完全丧失,而Fe2+对酶有激活作用。EDTA对酶活力没有影响,推断该蛋白酶为非金属蛋白酶。     

产甲壳素酶菌株的发酵条件、酶的分离纯化及酶学性质研究

利用甲壳素为唯一碳源从土壤中筛选得到1株产甲壳素酶活力较高的菌株HD002,初步鉴定其为Massilia属。确定菌株产甲壳素酶的最适培养基组成为(g/L):(NH4)2SO45,K2HPO40.7,KH2PO40.3,MgSO4.7H2O 1,胶体甲壳素10;最适产酶培养条件为:培养基起始pH值6.0,培养时间192 h,发酵液酶活力达1.314 U/mL。采用70%饱和度硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析对该甲壳素酶进行纯化,SDS-PAGE证明达到电泳纯。该甲壳素酶的分子量为60.2 kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH值为5.0,Cu2+和Fe3+对酶活力有明显的抑制作用,Ca2+和Na+对酶活力有明显的促进作用。     

镉和汞两种重金属离子对四角蛤蜊的急性毒性

采用毒理学实验方法,比较研究了Cd~(2+)和Hg~(2+)对四角蛤蜊(Mactra veneriformis Reeve)急性毒性效应的差异,以期为进一步评价重金属离子对四角蛤蜊的毒性效应和作用机理等提供理论依据.死亡概率单位和实验液浓度对数的线性回归分析表明,Cd~(2+)对四角蛤蜊在24、48和96 h的半致死浓度(LC_(50))分别为15.961、5.149和2.383 mg/L,Hg~(2+)的LC_(50)分别为3.714、0.607和0.207 mg/L;Cd~(2+) 和Hg~(2+) 对四角蛤蜊的安全质量浓度分别为0.023 8 mg/L和0.002 1 mg/L,分别是我国渔业水质标准(GB11607-89)限定量的4.76倍和4.02倍.     

海洋细菌QY202产κ-卡拉胶酶的分离纯化和性质研究

为获得高效降解卡拉胶菌株,从青岛太平角海域采集的角叉菜表面分离到1株高产κ-卡拉胶酶的海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)QY202,经硫酸铵沉淀、脱盐、DEAE阴离子交换层析等步骤从该菌株发酵液上清中分离纯化得到1种专一性降解κ-卡拉胶的κ-卡拉胶酶,并研究了该酶的基本酶学性质.结果表明该酶被纯化了23.1倍,回收率为43.9%,分子量大小为33.2 kDa.酶的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH为8.0,在0～40 ℃,pH=7.0～8.0之间酶活力较稳定.酶对底物κ-卡拉胶的米氏常数Km值为1.6 mg/mL.Na~+、K~+对酶活有促进作用,而Hg~(2+)、Cu~(2+)强烈抑制酶的活性.酶解κ-卡拉胶的主产物为硫酸新κ-卡拉二糖和硫酸新κ-卡拉四糖.     

长牡蛎碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

本文以长牡蛎为酶源提取材料,用正丁醇抽提,硫酸铵分级分离,DEAE-52和Sephadex G-100柱层析,得到一定纯度的碱性磷酸酶,提纯倍数为61.96,比活力达1.326U/mg.该酶的最适pH值9.6,最适温度38℃,初速度6.8μmol/(dm~3·min),米氏常数Km值为1.30mmol/dm~3.实验结果表明,Mg~(2+)对该酶有明显的激活作用;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)对该酶有明显的抑制作用.     

海洋芽孢杆菌Bacillus sp. CAMT22370所产葡萄糖氧化酶的分离纯化与表征

前期筛选获得一株海洋源Bacillussp.CAMT22370高产葡萄糖氧化酶菌株,本研究进一步通过离子交换及分子筛层析使Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶纯化了2.12倍,酶活得率32.37%,比活力达到8.47 U/mg,分子质量约为50 kDa。酶学特性研究表明,此酶在低温下有较好的催化活性,最适温度为30℃,超过30℃时酶活迅速下降, 45℃保温2 h活力降至75%左右;最适pH为6.0,在5.0以下和7.0以上时酶活迅速降低, 9.0时损失35%; Ca~(2+)和Mn~(2+)有明显激活作用, Na~+和Zn~(2+)有轻微激活作用, K~+和Mg~(2+)对酶活无显著影响,而Fe~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)对酶活有明显抑制作用,酶动力学参数Vmax及Km值分别为26.85 (μmol/(L·min))和109.26 (μmol/(L·min)),以上酶学特性与现有酶制剂存在明显不同,研究结果为该葡萄糖氧化酶的开发利用奠定了初步基础。     

弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现了异源表达,对重组酶VRALG1的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明：重组酶VRALG1最适温度为35℃,在5～50℃范围内相对酶活力达到80%以上,最适pH为6.5～7.5,在pH为6.0～9.0范围内保温1 h后相对酶活力在90%以上;重组酶VRALG1最大反应速率为5.919 mmol/(L·min),米氏常数为3.712 mmol/L,最适条件下比活力为5.874 U/mg; K⁺、Cs⁺、Na⁺、咪唑和乙醇对酶活性影响较小,5 mmol/L或50 mg/mL浓度下相对酶活力保持90%以上,EDTA对酶的抑制作用明显,1 mmol/L浓度下可使酶完全失活;重组酶VRALG1对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性,TLC分析显示产物主...     

一株源于红树林根际土壤产纤维素酶芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质分析

从红树林根际土壤中筛选出一株产纤维素酶的革兰氏阳性菌,通过形态、生化特征及16S r RNA基因序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对其产纤维素酶能力进行分析,发现该菌株所产纤维素酶的最适反应温度为55°C,最适p H为6。酶学性质分析发现,在反应温度为55°C时,该菌株产生的纤维素酶稳定性最好,保温120min后仍具有80%以上的相对酶活力;在p H为5—7时,酶活性相对稳定,相对酶活力均维持在80%左右。Cu~(2+)对该酶有一定的抑制作用,Zn~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)和Co~(2+)均对酶有一定的促进作用。本研究显示这株芽孢杆菌具有良好的应用前景,为该菌株在水产饲料添加剂中的进一步研究与应用提供参考依据。     

产甲壳素酶菌株HD001的发酵条件研究及酶的分离纯化

通过对降解甲壳素菌株 HD001 的发酵条件研究,确定了其产甲壳素酶最适培养基组分为 ( w/v ):( NH4 ) 2SO4 2.0%, NaCl 0.5%, K2HPO4 0.07%, KH2P O4 0.03%, MgSO4·7H2O 0.05% 以及葡萄糖 0.1%、酵母粉 0.3% 和胶体甲壳素 1.5%;最适产酶培养条件为:培养基起始 pH 值 6.0,培养温度 30 ℃,培养时间 120 h,发酵液酶活力达 376.2 U/mL.采用硫酸铵分级盐析、DEAE-纤维素离子交换层析、Sephacryl S-100 凝胶过滤层析对该酶进行纯化后,SDS-PAGE电泳显示单一条带,其相对分子质量约为 85.7 kDa.     

南极产碱性淀粉酶菌株NJ270的选育及酶学性质

从南极中山站排污口沉积物样品中筛选到一株产碱性淀粉酶的耐冷菌株NJ270,结合形态学观察和16S rDNA序列分析表明该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas).发酵试验发现添加淀粉能使产酶量提高8.42倍.采用硫酸铵沉淀、Q Sepharose XL离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析对假单胞菌NJ270淀粉酶进行了纯化,获得电泳纯的淀粉酶,SDS-PAGE检测结果表明该酶大小约为55 kDa.酶学性质研究表明其最适pH值为9.0,最适作用温度为50℃.在低于40℃的条件下具有较高的热稳定性,属于碱性中温淀粉酶.该酶可水解可溶性淀粉生成麦芽五糖.酶活力受多种金属离子和螯合剂的影响,其中Mg2+可使酶活力提高10%,而Fe3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、EDTA则能抑制酶活性,抑制率均为60%左右.该酶的性质特征表明其在洗涤剂制造等工业生产中有一定的应用潜力.     

中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究

为了探讨中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)活性的必需基团,采用了化学修饰法进行研究,分别以甲醛、乙酸酐、三硝基苯磺酸、对氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、二巯基苏糖醇、乙酰丙酮、溴代乙酸、碘代乙酸、N-溴代琥珀酰亚胺等10种修饰剂,在特定环境中对中国鲎NAGase进行化学修饰。结果表明:中国鲎NAGase中赖氨酸的ε-氨基、组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基和丝氨酸的羟基经修饰后,酶活力几近丧失,这些氨基酸基团为酶活性的必需基团,且可能处于酶的活性部位;半胱氨酸的巯基经修饰后不完全失活,说明半胱氨酸的巯基是NAGase催化活性所必需的,但可能不处于酶的活性部位;酶的二硫键被修饰后,酶活力明显下降,说明二硫键在维系NAGase的三维空间构象中起重要作用;而精氨酸的胍基经修饰后酶的活性基本不变,因此,精氨酸不是NAGase的必需基团。     

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶,SDS-PAGE显示为单一条带,提纯倍数为14.42,比活力达到131.08U/mg。酶学性质研究表明:该酶亚基分子量约44kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为9.0,米氏常数Km为0.098mmol/L,最大反应速度Vmax为1.01μmol/(mL·min)。Ca2+、Mg2+对酶活力表现出显著的激活作用。     

超嗜热古菌耐热酸性α-淀粉酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp.HJ21)菌株进行了α-淀粉酶发酵条件的优化和酶学性质的研究.该菌株发酵9h后到达产酶高峰,产酶温度范围为60-90℃,其最适产酶温度为80℃.产酶pH范围为5.0-9.0,最适产酶pH为7.5.产酶NaCl浓度范围为0.5-4.0%,2.5%为最适宜NaCI浓度.糖原、淀粉、麦芽糖、酵母膏和蛋白胨促进产酶.该菌株产生的α-淀粉酶的分子量为51.4 kDa,酶的最适作用温度为95℃,在100℃仍有60%的酶活力.酶在90℃的半衰期为5 h,在100℃ 2 h仍有40%的残余酶活,酶的热稳定性不依赖Ca2+.酶的最适作用pH为5.0,pH 4.5仍有80%的酶活力,pH在5.5-7.0较稳定(80℃ 4 h).金属离子1 mmol/L的Mg2+、Co2+、Sr2+、Ba2+、K+、Na+对酶有激活作用,Cu2+、Pb2+、Hg2+、zn2+、Al3+对该酶均有抑制作用.     

有机溶剂来源污染物对中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)是几丁质酶系的主要组成分之一,节肢动物周期性脱皮生理和生长发育与NAGase密切相关.为了探讨有机溶剂对中国鲎(Tachypleus tridentatus)NAGase的影响,从中国鲎内脏分离提取了NAGase,研究甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、乙二...     

泥蚶(Tegillarca granosa)重组铁蛋白富集重金属离子的特性及化学传感器的研究

利用泥蚶(Tegillarca granosa)铁蛋白原核表达工程菌获得的重组铁蛋白,通过圆二色光谱分析蛋白二级结构,扫描电镜和电感耦合等离子质谱研究重组铁蛋白富集Fe~(2+)、Mn~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(3+)、Hg~(2+)、Pb~(2+)和As~(3+)等7种重金属离子的特性,同时探索利用重组铁蛋白修饰丝网印刷电极,设计和制备重组铁蛋白检测Pb~(2+)和Cd~(2+)浓度的电化学生物传感器。结果表明复性成功的铁蛋白多为完整的?-螺旋结构,而复性不成功的蛋白聚集体则多为无规卷曲。重组铁蛋白的直径和形态与富集的离子种类有关。泥蚶铁蛋白对单一金属离子Fe~(2+)和Mn~(2+)的富集凸显优势。对两种混合金属离子的富集大多表现为竞争关系。但重组铁蛋白对Hg~(2+)和As~(3+)混合组的富集量明显高于单一金属离子组的富集量,对Hg~(2+)和As~(3+)混合组的富集表现出协同促进作用。重组铁蛋白传感器对Pb~(2+)和Cd~(2+)溶液的最低检测限为10μg/L。     

不同养殖期的凡纳滨对虾外壳膜NAGase基本性质比较

以不同生长期的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的外壳为材料，分离提取外壳膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（EC3．2．1．52，NAGase），测定分析不同生长期的外壳膜NAGase的酶比活力及其性质的变化．结果表明：不同生长期的酶活力、最适温度、催化反应的动力学参数（Km、vm）、活化能等均存在差异．不同生长期酶的最适pH均为5．5．不同生长期的对虾外壳膜NAGase对Cu^2＋、Zn^2＋和Hg^2＋的敏感性也不同．Cu^2＋对养殖8周对虾外壳膜NAGase的激活作用最为显著，可以使酶活力提高到400％．Zn^2＋对不同生长期的酶活力均有抑制作用，但对成体对虾酶抑制作用最为显著，可以使酶活力下降80％．Hg^2＋对各个生长期的酶活力影响效果也不一样，当浓度为0．1mmol／dm^3时，仅对养殖6、8、9周的对虾的酶有激活作用，当Hg“浓度为1．0mmol／dm^3时，五个生长期的虾皮NAGase活力均受到不同程度抑制．     

海藻工具酶研究Ⅱ.褐藻酸酶的制备、性质及对裙带菜细胞的解离研究

褐藻酸降解菌埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)菌株Al01,通过发酵培养制备褐藻酸酶.该酶作用的最适pH为7.0,最适温度为40℃,最适底物浓度为1%～2%;在离子浓度为0.5mmol/dm3时,Mn2+对酶促反应稍有促进作用,Ca2+、Hg2+则有明显的抑制作用.该酶用于裙带菜单细胞和原生质体解离时,以酶液组成为褐藻酸酶1%、纤维素酶1%,45×10-3的NaC1为渗透剂,酶解温度25℃,pH7.0,酶解3-4h效果最好.     

中华管鞭虾(Solenocera crassicornis)蛋白酶的纯化及其生化特性研究

采用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L,pH7.5)抽提、Q-sepharose F.F.阴离子交换层析、Sephacryl S-300凝胶过滤层析、SDS-PAGE等方法,进行中华管鞭虾虾头蛋白酶的分离纯化、酶学性质及其动力学特性的研究。结果表明,中华管鞭虾虾头蛋白酶粗提物经层析后,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的一酶组分。该蛋白酶的比活力从359.39U/mg增加到8277.83U/mg,提高了23.03倍,回收率达37.69%,SDS-PAGE显示该蛋白酶只含一条谱带,相对分子量为24.50kDa。以偶氮酪蛋白作为底物,该酶的米氏常数Km值为0.28mg/ml,最适温度为55℃,最适pH为7.5;蛋白酶在60℃以下比较稳定,放置1h后活性仍保持在60%以上,而在60℃以上时蛋白酶活性急剧下降,80℃放置1h后,酶活性只残留21.32%。10mmol/L Cu2 、Zn2 和EDTA对该蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率分别约为97%、96%和55%,10mmol/LMg2 能显著促进蛋白酶活性,而10mmol/LFe2 、Ba2 、Ca2 对蛋白酶活性的影响不大。推测中华管鞭虾蛋白酶可能为一种金属蛋白酶。