3种水产病原弧菌(Vibrio)的16S—23S rDNA间区(IGSs)的克隆、测序与分析

根据细菌16S rDNA3端和23S rDNA5端的高度保守区设计引物,PCR扩增了5株溶藻弧菌、2株河流弧菌和2株创伤弧菌的16S—23S rDNA间区,克隆到pGEM-T载体上,测序;采用BLAST和DNAstar软件对16S—23S rDNA间区序列及其内的tRNA基因进行比较分析研究。结果表明,3种弧菌共测出的16S—23S rDNA间区有33条,类型有6种:IGSGLAV、IGSGLV、IGSIA、IGSG、IGSA和IGS0,其中IGSIA和IGSG最为常见,9株弧菌均包含有此两类IGS;在3种弧菌中,大部分IGS序列tRNA基因两端的非编码区具有较高的种内同源性,可以成为设计种特异性引物和探针的靶区。16S—23S rDNA间区结构的差异为建立一类新的弧菌检测方法奠定了基础。溶藻弧菌的16S—23S rDNA间区序列为首次报道。     

西北太平洋沉积物中细菌多样性的研究

利用提取且纯化的西北太平洋地区深海沉积物DNA为模板,利用细菌通用PCR引物扩增16S rDNA片段,构建其文库,建立阳性克隆子RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)酶切图谱.据酶切图谱选择部分克隆测序,并与数据库中的序列进行比对.结果表明,测序的27个序列分属于4个类群:变形细菌(Proteobacteria)、绿屈挠菌(Chloroflexi)、浮游霉菌(Planctomycetes)和酸杆菌(Acidobacteria);其中以变形细菌最多,占62.96%.     

南沙海区沉积物中细菌和古细菌16S rDNA多样性的研究

采用细菌16SrDNA通用引物和PCR扩增等方法,构建了南海南沙海区沉积物16S rDNA文库,并通过RFLP酶切分型对所获得的70个克隆进行测序。从国际分子生物学数据库中调取相关序列,以PAUP4．0分析软件构建序列同源性矩阵和系统发育树图。结果表明,与细菌文库中克隆相似的微生物属于4个细菌类群：变形细菌(Proteobacteria)(60％)、革兰氏阳性细菌(Gram-positivre bacteria)(13％)、浮霉菌(Planetomycetes)(10％)和无硫绿细菌(Green nonsulfur bacteria)(6％),其中变形细菌(包括δ-、γ-和α-变形细菌)是明显的优势类群。采用Blast程序对所有序列基因数据库进行搜索,发现只有一个克隆与已知序列完全相似,说明文库具有极高的多样性。但是对古细菌文库中所获得的克隆子进行二级结构和序列特征分析的结果表明,这些克隆子均为海洋未获培养的细菌,因此在作者的文库中并未有古细菌的发现。     

宁波北仑港冬季浮游细菌多样性研究

采用分子生物学方法对宁波北仑港冬季水体中的浮游细菌多样性进行了研究.提取水样中细菌基因组总DNA,以细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物经分子克隆、测序与序列分析,对水样中的细菌建立了16S rDNA克隆文库和系统发生树.结果表明,浮游细菌群落具有较高的多样性,34个克隆子分属2个不同的细菌类群,6个克隆子属于未知类群,优势细菌类群为Pro-teobacteria类群（变形菌类群）,占80%;细菌优势类群顺序为β-Proteobacteria类群（32.5%）、γ-Proteobacteria类群（25%）、α-Proteobacteria类群（15%）、ε-proteobacteria类群（7.5%）、Firmicutes类群（厚壁菌类群）（5%）.这一结果与近年来国内外有关港口微生物多样性的报道较为一致.用DNAStar中Clustalw程序从测序的40个克隆子中选出17个OTU进行系统发育分析,同样表明浮游细菌多样性较强.     

以16S和16S—23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) PCR快速检测技术

提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。     

一株海洋细菌MZ0306A1的16S rDNA扩增及序列分析

PCR技术应用于环境监测具有快速、灵敏、准确、简便、特异性强等特点,被广泛应用于水体、气体和土壤的环境污染监测中。将此方法应用于海洋细菌监测中,从浙江南部沿海表层海水中分离到一林海洋细菌MZ0306A1,利用细菌通用引物对其16S rDNA进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测目的DNA片段约为1.5 kb。测序后将所测得的序列在NCBI网站中进行相似性搜索,得到该细菌的结果与Halomonas variabilis strain DSM 3051的相似性最高,为97%,故命名为嗜盐单胞菌属。该细菌的16S rDNA序列已经提交GenBank,序列收录号为EU124745。     

天津近海可培养细菌多样性的初步调查

根据天津近海地理地貌特征设置了5个调查站住,分别采集不同水层的水样,进行了可培养细菌调查和多样性分析.调查结果表明,天津近海海水细菌总数为0.28×107～6.08×107cfu/L.划线培养获得的菌株经16S rDNA扩增后,用RsnⅠ、Msp Ⅰ限制性内切酶酶切,共获得27种酶切谱型.对27种谱型的细菌进行16S rDNA克隆和序列分析表明,天津近海海水可培养细菌分属于3个分类单元,即变形细菌(18种)、厚壁菌(5种)、拟杆菌(4种).对天津近海海水可培养细菌的可能代谢类型进行了比较分析,为今后开发利用海洋生物资源和修复天津近海生态环境提供了数据.     

胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因(18S rDNA)扩增及序列变异初步研究

采用PCR扩增、文库构建、限制性片段长度多态性分析、序列分析和系统学分析等方法，初步研究了夏季胶州湾上层海水浮游桡足类核糖体小亚基RNA基因(18S rDNA)约1．5kb片段的序列变异。从浮游生物混合DNA中选择性扩增桡足类18S rDNA，建立桡足类18S rDNA变异类型文库，并从文库中随机挑选的30个克隆进行分析。结果表明，Vsp Ⅰ限制性内切酶能将这些克隆分成频率分别为0．17、0．23和0．6的3种操作分类单元(OTUs)，遗传多样性指数达到0．95。3条OTU代表克隆序列与甲壳纲桡足亚纲核苷酸差异数在75．4—97．8之间，而与其他亚纲的差异都高于100。3条OTU代表克隆序列均属于桡足亚纲，其中，AY437861和AY437862属于哲水蚤目。3条OTU代表克隆序列可分为2个高变异区和3个相对保守区，其GC％分别为47．37％、48．16％和48．57％。研究结果表明，混合DNA提取方法简单，设计的引物可选择性地扩增浮游桡足类18S rDNA，根据18S rDNA序列序列变异描述浮游桡足类多样性是可行的。研究结果也为在浮游桡足类分类中引入18S rDNA序列奠定了基础。     

基于16S rDNA和看家基因序列分析技术的鲍鱼养殖水体弧菌种类的鉴定

采用TCBS选择性培养基从厦门某鲍鱼养殖场的养殖水体中分离到19株细菌.经16S rDNA序列分析,所有菌株均属于弧菌属（Vibrio）,且与最近似的弧菌模式种的同源性都在98.99%以上.由于弧菌种间16S rDNA序列相似度极高,无法仅靠16S rDNA序列比对来鉴定这些菌株到种的水平.16S rDNA序列的系统发育分析也显示,大多数菌株与弧菌模式种无法归为一簇,表明16S rDNA基因在弧菌种的分类鉴定上分辨率不高.进一步采用基于4种看家基因（rpo A、pyr H、gap A和top A）的多位点序列分析技术（MLSA）对分离到的弧菌菌株进行分类鉴定,结果显示19株海洋弧菌归于溶藻弧菌（Vibrio alginalyticus）与魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）2个种,表明这两种弧菌是该鲍鱼养殖场水体环境中的优势弧菌种,在鲍鱼养殖弧菌病害防治方面需要重点关注.此外,看家基因与16S rDNA基因的多态性分析表明,4种看家基因的多态位点比率均高于16S rDNA.4种看家基因串联后的多态位点比率高达41.1%,远高于16S r DNA基因的13.4%,表明看家基因相较于16S rDNA基因有着更高的分辨率,更适合于海洋弧菌的分类鉴定.     

从养殖贝类和大菱鲆分离的海洋发光弧菌的分类地位分析

海洋发光弧菌是海水养殖中重要的条件致病菌。从福建省晋江市附近水产养殖场花蛤、牡蛎软组织及波罗地海大菱鲆肠道内含物中分离得到16 株发光细菌, 采用ARDRA（amplified ribosomal DNArestriction analysis）、16S rDNA 序列测定、Biolog 碳源代谢分析及药敏试验等方法对...     

东太平洋海隆深海热液区沉积物微生物多样性的研究

提取东太平洋海隆区深海热液系统沉积物样品的总DNA,构建沉积物中的细菌16S rDNA 克隆文库,通过PCR-RFLP分析与序列测定,对沉积物中的微生物类群及其与环境的关系进行了分析.结果表明,该海区沉积物中的36个克隆代表的22种基因型分别属于7个主要类群,其中变形菌(Proteobacteria)的γ-亚群为优势菌群,α-和β-亚群也均有分布;而硫氧化相关共生菌的属(sulfur-oxidizing symbionts)为优势种属.系统发育分析表明,在该沉积物中细菌主要是跟共生有关、跟C、S代谢相关,大多还能在无氧和高温环境的条件下生存,说明采样点具有典型的深海热液生态系统的特点,甲烷代谢和硫代谢在该区域的深海物质能量循环中占据着重要地位.另外大量新的极端微生物的存在,预示着该区域的微生物资源有着非常大的开发潜力.     

深圳海域水体和九龙江口沉积物中TCBS菌群与弧菌相关性的研究

通过传统的TCBS培养基平板计数法、16S rDNA-RFLP( 16S rRNA基因的限制性酶切图谱多样性分析)及16S rDNA序列分析等方法对深圳海域水体和九龙江口沉积物中弧菌数量分布进行研究.结果表明TCBS菌群数中弧菌所占的比例因不同采样地点、不同季节而呈现较大差异.在深圳西海域及九龙江口上游盐度较低(盐度＜...     

16S rDNA克隆文库解析刺参(Apostichopus japonicas)苗种培育池中生物絮团的细菌群落结构*

提要 通过采集东营和蓬莱地区采用生物絮团技术的刺参(Apostichopus japonicas)苗种培育池(DYt和PLt)及其对照池(DYc和PLc)海水样品,构建细菌16S rDNA 克隆文库,对其中细菌群落的多样性和群落组成结构进行了分析。结果表明,四个文库Coverage值在34.7%～54.8%之间,文库丰富度指数(Chao)66.2～314.1,shannon多样性指数从3.01～4.07变动,Pielou均匀度指数0.68～0.85,样品的细菌群落均具有很高的多样性,蓬莱刺参苗种培育池细菌多样性均高于东营;生物絮团文库中细菌包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形细菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)等八个菌门和未知类群,黄杆菌群(Flavobacteria)、α-变形菌群(Alphaproteobacteria)芽孢杆菌纲(Bacilli)为主要优势菌群;DYt和PLt处理组文库细菌多样性减少并出现特征菌群,生物絮团调控技术改变了刺参苗种培育环境的微生物群落结构。生物絮团的细菌群落结构研究,为揭示生物絮团的作用机制并进一步有效利用提供研究基础和依据。     

对虾养殖前期5种类型水体中细菌的组成和比较研究

本文对天津和河北沧州地区的5种类型养虾水体(淡水、盐碱地水、浅层盐碱水、海水、高盐海水)养殖前期的细菌数量及组成进行比较研究。结果为:(1)5种水体中异养细菌、弧菌、氨化细菌、反硝化细菌、硫酸还原菌数量差异明显,异养细菌总数高低的顺序为:海水高盐海水浅层盐碱水盐碱地水淡水;弧菌总数:高盐海水海水浅层盐碱水盐碱地水淡水;氨化细菌总数:海水浅层盐碱水盐碱地水淡水高盐海水;反硝化细菌总数:盐碱地水淡水海水浅层盐碱水高盐海水;硫酸还原菌总数:浅层盐碱水=淡水海水盐碱地水高盐海水。(2)不同水体中细菌种类及相对数量存在差异,淡水中气单胞菌属、邻单胞菌属、肠杆菌科为主要菌群,分别占总数的21.34%,18.57%,17.14%;盐碱地水中产碱菌属、弧菌属、肠杆菌科、棒杆菌属为主要菌群,分别占总数的29.27%,19.51%,14.63%,14.63%;浅层盐碱水中弧菌属、气单胞菌属为主要菌群,分别占总数的23.08%,15.38%;海水中弧菌属、肠杆菌科为主要菌群,分别占总数的19.35%,16.13%;高盐海水中弧菌属、假单胞菌属为主要菌群,分别占总数的38.71%,12.90%。研究表明,养殖前期,5种类型养虾群体中的细菌组成结构存在明显差异。     

黄海西北近岸沉积物中细菌群落空间分布特征

采用16S rDNA文库和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,对黄海西北部3个近岸站位沉积物中细菌群落多样性及空间分布特征进行了调查和解析。对表层沉积物16S rDNA序列统计表明,各站位细菌群落多样性很高,γ-和δ-变形菌纲分别占克隆序列总数的20%~32%,是沉积物中的绝对优势类群。DGGE图谱分析表明,同一站位中不同深度的细菌群落结构相似性较高,而不同站位间群落结构相差较远。研究表明在黄海西北近岸沉积物中细菌群落多样性较高,优势类群明显,在较小尺度范围内群落结构的垂直变化不明显。     

海洋沉积物氨氧化菌群落结构的测序分析

本文以氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)特征基因氨单加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)α亚基基因(amoA)为目标基因(～491bp),分别采用克隆文库、454高通量测序和illumina测序技术对其群落结构进行了比较研究。结果表明, 454高通量测序和illumina测序技术得到的菌群多样性及丰富度均高于克隆文库技术。在菌群组成方面,虽然3种测序技术检测到的优势类群均为亚硝化螺菌,但在菌群丰度方面存在差异。3种测序技术中,克隆文库技术在很大程度上可能高估物种丰度,且对部分低丰度类群的检测能力有限;illumina单端测序由于其测序片段较短,可能存在物种注释错误、不能准确区分各物种间序列差异等问题;比较而言, 454高通量测序技术能较为全面和准确地反映海洋沉积物中AOB的菌群结构特征。     

青岛近岸特征环境中海洋异养细菌的分布规律及其分子鉴定

研究海洋微生物特征,从青岛近岸养殖密集区、工业区、洁净区分离了428株海洋异养细菌,采用BIOLOG技术对其进行了鉴定和聚类,从中选出13株具有代表性的菌株,克隆其16SrDNA片段,进行分子鉴定。结果表明,它们分别属于弧菌属(Vibrio)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、海单胞菌属(Oceanimonas)、噬纤维菌属(Cellulophaga)、赤细菌属(Erythrobacter)和Rhodovirga。在3种特征环境中,海洋异养细菌的分布具有一定的规律性:其中洁净区的特征类群属于弧菌属(Vibrio),工业区的特征类群属于弧菌属(Vibrio)和不动杆菌属(Acinetobacter),养殖密集区的特征类群属于弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseu-domonas)、海单胞菌属(Oceanimonas)、赤细菌属(Erythrobacter)、噬纤维菌属(Cellulophaga)和噬冷菌属(Algoriphagus)。     

黄海冷水团可培养细菌的多样性研究

本文研究了2008年7月黄海冷水团海域可培养细菌的多样性。AODC和DVC计数总菌数和活菌数分别为(1.3~4.8)×105/mL和(0.6~1.6)×105/mL;2216E平板以菌落计数法可培养细菌浓度为(0.56~2.2)×103cfu/mL。从分离到的475株中选取163株进行16S rDNA扩增,并用HhaⅠ酶进行ARDRA(扩增性rDNA限制酶切片段分析)多态性分析,取114株不同带型测序。结果显示,冷水团细菌归为4个细菌类群:变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Acti-nobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),共24个属,其中包括α-,β-,γ-变形菌纲;非冷水团细菌也归为这4个门类,共15个属,但未分离到β-变形菌纲。γ-变形菌纲在冷水团和非冷水团区域的不同深度都是优势菌群,不同的是冷水团区域α-变形菌纲比例较高(26.8%),而非冷水团区域α-变形菌纲比例相对较低(15.6%)。这表明黄海冷水团和非冷水团区域细菌多样性都很丰富,但其群落组成和优势菌群有所不同。此外,16S rDNA测序结果表明,6株细菌可能为海洋细菌新种。     

胶州湾海域表层沉积物细菌多样性

采用16S rDNA文库结合PCR-RFLP分析的手段,对胶州湾4个站位沉积物中的细菌多样性和群落特征研究分析。结果表明,沉积物中细菌种类丰富,最多包含分布于14个已知门类的细菌,和一些未被认知的序列;各站位沉积物中优势菌群均为变形菌门和酸杆菌门,其中γ-和δ-变形菌纲为变形菌门中的绝对优势类群,在4个文库序列中平均占42%和16.75%;此外,拟杆菌门、浮霉菌门和放线菌门的种类也较为大量存在。各细菌种群有较明显空间分布差异,可能与不同区域胶州湾环境条件相关。     

枸杞岛海藻场冬季细菌群落结构分析

从枸杞岛海藻场和对照点贻贝场分别采取表层及底层水样,利用细菌通用引物,提取样品总DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,采用16SrDNA文库技术,对其细菌群落进行鉴定和分析。结果表明,海藻场表层和底层细菌群落分为5和6个门,贻贝场表层和底层细菌群落分为3和4个门,海藻场中细菌分类门数多于贻贝场内,优势菌均为变形细菌门,分别占克隆文库的比例为40.7%、50%、59.1%和48.1%。γ-变形菌纲为变形细菌门的优势亚群,各个文库中均含有许多未确定其分类的序列,即含有许多未被认知的微生物类群。变形菌门、厚壁菌门和放线菌门为所有水样共有,但在水层垂直分布及不同地理位置间存在较大差异。不同功能类群可能与其特殊生境密切相关。