大珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝(Pinctada maxima)微卫星DNA文库,随机挑选1200个菌落,经PCR筛选得到298个候选克隆,成功测序246个,分析获得251个微卫星序列,其中完美型、非完美型和混合型分别占63%、32%和5%。除探针中使用的CA重复外,还得到AT、GT、TC、AG、GC、TAA、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、CGTC、GACG、CTGT等重复序列。设计引物90对,挑选其中30对合成并筛选出21对能在大珠母贝基因组有效扩增的引物。种群PCR扩增后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测,获得了10个多态位点,共检测出59个等位基因,片段长度范围为133~444 bp。各位点等位基因数2~8个,平均等位基因数5.9个;有效等位基因数为1.342 3~6.000 0,平均为4.124 0;多态性信息含量(CPI)为0.222 5~0.811 8,平均0.7179;期望杂合度(He)为0.259 3~0.847 5,平均0.717 9;观测杂合度(Ho)为0.300 0~0.800 0,平均0.533 3。这些微卫星多态性标记的获得,为进一步开展大珠母贝遗传育种、保护生物学和种群遗传多样性等研究奠定了一定基础。     

刺参（Apostichopus japonicus）野生及两代选育群体间遗传变异的微卫星标记研究

应用微卫星DNA技术对野生刺参和两代选育刺参群体遗传多样性进行了研究。9对微卫星引物在三个刺参群体中共扩增获得43个等位基因,每个微卫星座位检测到的等位基因数为2—7个。三个群体的观测杂合度的平均值分别为0．6556、0．6704和0．6148,多态信息含量平均值分别为0．6654、0．5929和0．5275。结果表明...     

海湾扇贝微卫星标记开发及其分离方式分析

利用尼龙膜吸附杂交法构建了海湾扇贝的(AC)_(15)、(AG)_(15)微卫星富集文库,随机挑取3 000个克隆,经菌落原位杂交二次筛选共获得阳性克隆1 268个(42.3%).经序列测定和生物信息学分析后得到521个独立的阳性克隆,其中微卫星506个,小卫星15个.微卫星中,完美型248个,占总数的49.0%;非完美型216个,占42.7%;复合型42个,占8.3%;其中AG/TC重复占70.4%(356个),AC/TG重复29.6%(150个).选择其中的55条序列设计引物,筛选出其中的20对引物检测它们在海湾扇贝CC10家系的双亲和94个子代个体中的分离情况,结果表明:(1) 其中6个位点在母本和子代中发生分离,10个位点在父本和子代中发生分离,4个为双亲共享位点;(2) 2个位点存在无效等位基因;(3) 16个位点符合孟德尔遗传定律,4个位点的子代个体基因型频率偏离孟德尔遗传定律.上述结果表明,这些微卫星引物可以用于构建海湾扇贝的遗传连锁图谱,并且所构建的富集文库适用于微卫星标记的大规模开发.     

基于FIASCO技术的合浦珠母贝微卫星标记分离与筛选研究

用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了合浦珠母贝Pinctada fucata基因组微卫星标记的分离与筛选研究.合浦珠母贝基因组DNA经限制性内切酶MseI酶切后与接头连接, 用生物素标记的(CA)15探针与其杂交, 然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段, 经PCR扩增后形成双链, 最后进行克隆转化, 构建微卫星富集文库.挑选克隆用探针引物(CA)15 和载体引物进行第2次筛选, 获得阳性克隆357个, 测序结果表明, 297个克隆(83.2%)含有微卫星序列, 包括479个微卫星DNA结构域.其中完美型微卫星有370个(77.3%), 非完美型95个(19.8%), 复合型14个(2.9%).合成引物49对, 有31对(63%)扩增出目的产物, 其中9 对在种群中(n=32)具有扩增多态性, 其多态信息含量PIC值在0.375―0.809之间, 平均为0.536;等位基因数在2―9个之间, 平均为4.889个;观测杂合度介于0.200―0.600之间, 平均为0.415;期望杂合度的变化范围为0.454―0.844, 平均为0.598.表明FIASCO技术适合于合浦珠母贝微卫星标记的分离与筛选.     

泥蚶(Tegillarca granosa)GT微卫星位点的筛选和性质鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从泥蚶基因组DNASau3A1酶切的500—1000bp片段中筛选GT/CA微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序。在139条序列中有115条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到82.7%。其中perfect类型微卫星最大的重复次数为35次。在112条非冗余序列中,共有100条(88.5%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。     

许氏平鲉微卫星标记与体长、体质量、体高的相关性分析

为了解许氏平鲉(Sebastes schlegelii)微卫星标记与生长性状的相关性,选取26个微卫星标记在海捕许氏平鲉群体中进行微卫星筛选,每个微卫星位点的等位基因数(Na)在3~21,有效等位基因数(Ne)为1.1815~15.5676;观测杂合度(Ho)范围为0.0417~0.9999;期望杂合度(He)范围为0.1581~0.9456;多态信息含量(PIC)范围为0.1509~0.9320。利用单标记分析法分析了多态性较高(PIC0.5)的22个标记与体长、体质量、体高的相关性,结果显示3个标记与生长性状显著相关,其中HJ2-32与体长、体质量和体高显著相关(P0.05),并推断等位基因D与C对于体质量、体长、体高分别具有重要的正向与负向影响;HJ7-2与体质量显著相关;HJ7-22与体长显著相关,并推测等位基因F对体长具有正向影响,等位基因B对体长有负面影响。这些标记可为许氏平鲉分子标记辅助育种提供基础。     

海带微卫星引物对裙带菜群体分析适用性的初步研究

为获得用于裙带菜种质结构和遗传多样性研究的微卫星标记,采用近缘物种转移法分析了15个海带微卫星引物在裙带菜中的应用情况。对38个裙带菜个体进行多样性分析,结果显示:标记SSR002和SSR115不能扩增裙带菜基因组,位点SSR194能扩增,但不具有多态性,其他12个标记均能扩增裙带菜DNA,且都具有检出多态性,其中9个符合哈迪-温伯格平衡。这9个海带微卫星标记检出的等位基因数为34个,从3～5个不等,平均每个位点扩增得到3.8个等位基因。观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量值(PIC)的范围分别为0.238～1.000、0.500～0.692、0.413～0.780,9个位点提供的多态性较高,适用于裙带菜遗传学研究。     

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的(CA)15寡核苷酸探针从波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)基因组DNA Bsp143Ⅰ酶切位点的400~1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到73.33%。其中完美型(perfect)类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中,共有28条(31.82%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选,其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析,其中4对引物扩增产物为单态,20对扩增产物呈多态性;20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2~12,平均有效等位基因数为3.5。该波纹唇鱼群体的PIC、Ho、He的平均值分别为0.0782、0.8513、0.5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。     

基于高通量测序的青石斑鱼基因组微卫星开发及评价

本研究采用基因组高通量随机测序的方法对青石斑鱼(Epinephelus awoara)微卫星标记进行了发掘,结果共获得青石斑鱼(Epinephelus awoara)基因组原始数据2.860G。采用MISA(MIcroSAtellite)软件进行微卫星位点搜索,获得967 657条微卫星序列。随机选取了96条微卫星序列设计引物并利用8尾青石斑鱼个体进行多态性位点筛选,共获得60个具有多态的微卫星标记。利用其中16个微卫星标记对一个青石斑鱼亲鱼群体的种群遗传学特征进行评价,共检测到129个等位基因,单个标记的表观等位基因数(NA)分布范围为2~14,平均为7.167;表观杂合度(HO)分布范围为0.422~1.000,平均为0.678 6;期望杂合度(HE)分布范围为0.481~0.893,平均为0.676 8。有5个标记的等位基因频率不符合"哈迪-温伯格平衡",其中EAW-55596、EAW-21755、EAW-30334 3个标记表现为杂合子显著缺失(P0.05),而EAW-33674和EAW-52520 2个标记表现为杂合子显著过剩(P0.05)。连锁不平衡检测表明各位点间无连锁不平衡现象。多态信息含量(PIC)分布范围为0.362 3~0.872 2,平均PIC=0.639 70.5,说明该亲鱼群体的遗传多样性比较高。而这些微卫星标记将对于青石斑鱼的遗传变异分析、亲缘关系鉴定提供了技术支持,这也将为青石斑鱼的分子遗传育种奠定了基础。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)微卫星位点的分离和序列分析

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从三疣梭子蟹基因组DNA的Sau3A1酶切的500-1000bp片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.在56条测序序列中有49条非冗余序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到87.5%.其中perfect类型微卫星最大的重复次数为47次.在47条非冗余序列中,共有40条(85.1%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计.本研究中筛选的微卫星位点将为下一步的三疣梭子蟹种群遗传结构分析、经济性状的QTL定位提供遗传标记.     

中国鲎(Tachypleus tridentatus)微卫星标记筛选及种群遗传多样性和遗传结构分析

采用FIASCO方法构建了中国鲎(Tachypleus tridentatus)(CA)_n微卫星富集文库,对214个阳性克隆进行测序,筛选获得60条含有微卫星的序列,其中可设计引物的序列共38条。38对微卫星引物在37个中国鲎个体中PCR检测发现,只有9个位点具有多态性,其等位基因数为5—14个,每个位点平均具有8.1个等位基因。9个位点之间不存在连锁。利用该9个具有多态性微卫星标记分析了中国沿海9个中国鲎地理群体的种群遗传多样性和遗传结构。结果表明:中国沿海的中国鲎种群遗传多态性水平仍较高, 9个地方群体间无遗传差异,它们之间未见显著分化,且有着较高的基因流;推测人为的迁移是造成遗传无分化的主要原因。我们建议中国鲎已绝迹的海域可从其他海域引入中国鲎个体来恢复地方群体资源。     

中国鲎基因组微卫星富集文库的构建及分析

本研究旨在从DNA分子水平上研究中国鲎(Tachypleus tridentatus)种群遗传多样性及种群结构等相关信息,以期为保护其野生群体种质资源提供科学依据。本研究通过生物素—磁珠富集法筛选微卫星标记,构建中国鲎基因组微卫星文库。基因组DNA经Fast Digest Tru1I酶切后,选取400 bp~1000 bp片段,用生物素标记的(GT)15、(CT)15混合探针与其杂交,杂交复合物与链霉亲和素磁珠结合,捕获含有重复序列的微卫星片段,纯化后连接PMD19-T载体克隆,构建基因组微卫星文库。从334个阳性克隆中随机选取196个片段大于400 bp的阳性克隆进行测序,共获得127个微卫星序列,其中完美型占69.3%、非完美型占11.0%、复合型占19.7%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到多碱基GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA的重复序列。根据微卫星序列设计选择合成40对引物,结果显示其中3对具有较高多态性,可作为进一步评价中国鲎野生种质资源等遗传信息的有效遗传标记。     

日本蟳(Charybdis japonica)微卫星位点的分离及遗传多样性分析

采用磁珠富集法,以生物素标记的(cA)12寡核苷酸为探针,构建了日本蟳基因组微卫星富集文库.通过PCR法从文库中共筛选出89个微卫星位点,其中完全型(perfect)共75个,占84.27%;不完全型(imperfect)12个,占13.48%;复合型(compound)2个,占2.25%.根据微卫星位点的侧翼序列,设...     

基于SLAF-seq技术开发蓝圆鲹微卫星标记及跨物种扩增检测

采用基于高通量测序平台的SLAF-seq技术开发蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)微卫星标记,从获得的1 450个四至六碱基重复微卫星位点中随机挑选93个位点进行引物合成和多态性检测,最终开发出31个多态性微卫星标记.群体遗传学检测结果表明,31个位点的等位基因数为4~29(均值13.48),观测杂合度(Ho)为0.281~0.875(均值0.650),期望杂合度(He)为0.557~0.958(均值0.838),多态信息含量值(PIC)为0.456~0.939(均值0.803),表明所开发的31个微卫星位点均具有较高的多态性.Hardy-Weinberg平衡检测表明,17个位点符合HWE("哈迪-温伯格"平衡),且各位点间不存在连锁不平衡现象.跨物种扩增结果显示,分别有27、20、20、18、9个微卫星标记在颌圆鲹(Decapterus macarellus)、长身圆鲹(Decapterus macrosoma)、无斑圆鲹(Decapterus kurroides)、竹荚鱼(Trachurus japonicus)及金带细鲹(Selaroides leptolepis)中具有较好的通用性.本研究开发的多态性长碱基重复微卫星标记可为蓝圆鲹渔业资源的科学管理和保护提供有力的遗传学评估手段,亦可为圆鲹属和鲹科鱼类系统进化研究提供新的分析手段.     

合浦珠母贝基因组微卫星富集文库的构建与分析

采用生物素标记的(AC)_(15)探针和磁珠富集法构建合浦珠母贝(Pinctada fucata)基因组DNA微卫星富集文库。随机挑选2097个克隆进行筛选,得到483个候选克隆(23.03%),对其中135个阳性克隆测序分析发现122个克隆含有微卫星重复单元(90.37%)。进一步通过序列比对,最终得到65个具有特异微卫星序列的阳性克隆(53.28%),其中包含85个微卫星DNA结构域,其中完美型(perfect)70个,占82.36%;非完美型(imperfect)7个,占8.24%;混合型(compound)8个,占9.41%,重复次数主要分布在5~20(95.74%),平均重复次数为7.83,(AC/GT)n重复所占比例最高(75.53%)。基于微卫星两端的侧翼序列,利用Primer Premier 5.0设计引物,获得11对具有多态性的微卫星引物。本研究为开展合浦珠母贝分子育种及资源评价分析提供了基础资料。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)微卫星克隆快速分离及特性分析

采用磁珠杂交选择和PCR筛选法，从长牡蛎DNA选择片段文库中，快速分离含有微卫星序列的阳性克隆。结果表明，在筛选的200个白色菌落中，56个克隆含有重复次数5以上的微卫星序列，其中41个(20．5％)有随机侧翼区，可以进行引物设计，12个缺乏足够的侧翼序列，3个为中断的微卫星序列。此外，还获得两个小卫星克隆。在获得的微卫星序列中，完全的占54．7％，不完全的占20．8％，复合的占24．5％。除探针中使用的CA重复单元外，还观察到CT、ACT、CGCA、CACT、GACT、GCAC、CCTTA和CCTCA的重复序列。微卫星重复次数主要集中在5-30次之间，占71．7％，最高为60次。本研究中构建的长牡蛎(CA)n富集微卫星文库将为以后开发未知微卫星标记提供帮助。     

龙须菜微卫星DNA的初步研究

为从龙须菜中分离含微卫星DNA的片段采用了2种方法,总共筛选了1 100个克隆。其中应用地高辛标记探针,通过菌落原位杂交方法,筛选得到13个克隆,测序结果显示仅有1个克隆含有微卫星DNA;PCR方法筛选出28个克隆,测序显示有23个克隆含有微卫星DNA。在总共测序的24个克隆中共有77个微卫星序列,每个克隆中含有的微卫星DNA在1～7个不等。核心序列重复次数在10次(含10次)以上的微卫星有38个,重复次数在10～38不等,重复次数在7～9次之间的微卫星有39个。在获得的微卫星序列中GA重复占97%,CA重复仅占3%。完全型微卫星55个,占71.4%;不完全型微卫星21个,占27.3%;复合型微卫星1个,仅占1.3%。龙须菜微卫星DNA的含量较低。     

刺参(Apostichopus japonicus)EST序列中微卫星分布分析及其标记的筛选

利用微卫星查找软件对现已公布的6632条刺参ESTs的数据库中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行筛选,进而对其微卫星的丰度和分布进行比较研究。共发现微卫星序列416个,占整个ESTs数据库的6.48%;其中含双碱基重复序列146个,数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的65.86%;三、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的26.68%、1.68%、0.24%、5.53%。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列利用Primer软件结合人工方法设计合成引物21对,其中13对有扩增产物且均为多态位点。扩增产物变性聚丙烯酰胺胶电泳,统计每个微卫星标记等位基因数目,计算等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度等统计学指标的评价。结果表明,在13个微卫星位点上,等位基因的数目从3到8不等,等位基因长度从175—382bp,观测杂合度和期望杂合度分别为0.158—0.650和0.198—0.841,所筛选微卫星标记可于遗传分析。     

细角螺微卫星DNA 富集文库构建及特征分析

采用生物素磁珠富集法,用生物素标记的(GT)15和(CT)15两种探针与细角螺基因组 MseI 酶切的300~1200bp 片段杂交,杂交复合物与链霉亲和素磁珠结合,捕获含有重复序列的微卫星片段。最后将磁珠捕获到的重复序列与PMD19-T载体连接后克隆到DH5α中构建微卫星基因组文库。通过PCR检测出354个阳性克隆,从中随机选取248个片段大于500bp的阳性克隆进行测序,结果显示,在220个成功测序的阳性克隆中共获得278个微卫星序列,其中完美型171个,占61.5%;非完美型81个,占29.1%;复合型26个,占9.4%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到三碱基GTT、TGG、GAA、CAA;四碱基TCTA、ACAG、TAGA、GTGA、GTCT、GATA及五碱基TTTTG的重复序列。在278条序列中共有82条可以设计引物。     

基于微卫星的泥蚶5个地理群体遗传多样性分析

为了研究泥蚶不同地理群体的系统发育关系和遗传多样性,运用微卫星DNA标记,对浙江温州(ZJ)、山东日照(SD)、韩国釜山(KR)、广西企沙(GX)、海南海口(HN)等5个泥蚶地理群体进行了17个基因位点的遗传多样性分析。结果显示,从17对引物中共检测出115个等位基因,每个位点等位基因数(Na)2~12个。有效等位基因数(Ne)为1.192~7.849,平均观测杂合度(Ho)为0.430~0.516,平均期望杂合度(He)为0.573~0.656,5个群体的平均多态信息含量(PIC)为0.525~0.608。Hardy-Weinberg平衡检验表明,51.2%的微卫星位点偏离平衡状态(P0.05)。5个群体间的种群遗传分化系数(FST)为0.012~0.062,呈现出较低的遗传分化。UPMGA聚类分析表明,浙江群体和韩国群体首先聚在一起,亲缘关系最近,然后与海南群体聚合;广西群体和山东群体亲缘关系较近,聚为一支,然后与上面三个群体聚合。