香鱼(Plecoglossus altivelis)肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 基因的分子克隆、鉴定及免疫相关性表达

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)是TNF 超家族成员之一, 在动物机体抵 抗细菌和病毒入侵时发挥重要作用。本研究基于香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组数 据库, 获得了香鱼TNF-α 基因(PaTNF-α)全长cDNA 序列。PaTNF-α 由1932 个核苷酸组成, 包含一 个大的开放阅读框, 编码235 个氨基酸, 预测分子量为26.4 kDa.氨基酸序列多重比对分析表明, PaTNF-α 具有TNF 超家族的特征序列、1 个TACE 酶切位点和1 个保守的二硫键, 与虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)TNF-α 同源性最高, 为53.4%; 系统进化树分析表明, 鱼类TNF-α 形成一个大 簇, PaTNF-α 与虹鳟TNF-α 进化相关性最高。实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 结果显示, PaTNF-α mRNA 在头肾中表达量最高; 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后香鱼肝、脾、头 肾和外周血细胞中PaTNF-α mRNA 表达量显著上调; 香鱼单核/巨噬细胞经鳗弧菌、LPS 和poly(I: C) 处理后, PaTNF-α mRNA 表达量显著上调。原核表达了PaTNF-α 成熟肽, 并制备了抗血清。Western blot 分析表明, 鳗弧菌感染后香鱼血清和单核/巨噬细胞上清中的PaTNF-α 表达量含量也显著增加。 综上, 香鱼TNF-α mRNA 及蛋白的表达与病原体感染密切相关, 为深入研究鱼类TNF-α 的生物学功 能及其在病原体感染中的作用机制提供理论基础。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)致病性类志贺邻单胞菌的分离与生化药敏鉴定

香鱼(Plecoglossus altivelis)是名贵洄游性鱼类,由于高密度养殖等因素导致病害频发。2021年7月强台风"烟花"过境后浙江省宁海县养殖香鱼暴发体表溃烂病,死亡严重。病鱼皮肤、肌肉溃烂并伴有周围皮肤充血。组织切片观察显示病鱼患处肌纤维断裂,周围红细胞、炎性细胞浸润;鳃丝和鳃小片中红细胞增多;肝细胞核呈空泡,部分细胞核染色质边集;脾脏内红细胞数量减少,部分白细胞聚集;肠黏膜上皮细胞脱落。从患病香鱼肠中分离到一株菌(编号NH21),其菌落低突、边缘光滑表面湿润,该菌株为革兰氏阴性菌,菌体呈短杆状、端圆。经生化特性和16S rDNA序列分析鉴定NH21菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。用该菌株对健康香鱼进行回归感染后,人工感染香鱼呈现与本次体表溃烂病香鱼相似的症状,经计算NH21菌株对香鱼的半致死剂量(LD₅₀)为2.51×10⁷ CFU/mL。25种抗生素的药敏试验显示NH21菌株对阿奇霉素、头孢氨苄、新生霉素、多黏菌素B、头孢西丁、呋喃唑酮6种抗生素敏感。从NH21菌株中检出了毒力基因9个、耐药基因8个。综合分析表明,分离得到的类志贺邻单胞菌NH21菌株是本次宁海县香鱼体表溃烂病的病原菌,研究结果为香鱼出现类似病症的预防和治疗提供了基础资料。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)精子的超微结构及其与鲤形目及鲑形目其他鱼类精子结构的比较研究

为了解香鱼(Plecoglossus altivelis)精子的形态结构特点,采用扫描和透射电镜技术观察了香鱼精子的超微结构,并与鲤形目及鲑形目其他鱼类精子结构进行了比较。结果表明,香鱼精子由头部、中段和尾部组成,全长约23.5μm。头部呈弹头形,由细胞核外包质膜构成,长约1.8μm、宽约0.8μm;细胞核从后端中央向前深凹至核的近前端,形成植入窝,使核呈倒U字形,核的前端无顶体;植入窝内有中心粒复合体及小段起始的鞭毛,中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒(基体)组成,两者之间夹角约135o。中段为"半袖套"结构,长约0.5μm,其内部为一较大的"半套筒"形线粒体。鞭毛起始于远端中心粒,由轴丝及外包轴丝的质膜组成,轴丝为典型的"9+2"微管结构;鞭毛两侧有质膜向外突起形成侧鳍。研究显示,香鱼精子与典型的鲤形目(Cypriniformes)鱼类精子卵圆形或圆球形头部及细胞核、不对称的袖套及尾部鞭毛无侧鳍等结构特征不同,也与鲑形目(Salmoniformes)鱼类精子卵圆形或椭圆形头部及马蹄形或浅U形细胞核、两中心粒相互平行或垂直、袖套结构完整等结构特征不同。香鱼精子结构具有种的特异性。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)CC型趋化因子受体3(CCR3)基因的分子鉴定及其对鳗弧菌感染响应的研究

CC趋化因子受体3（CCR3）是CC型趋化因子的受体,属于G蛋白耦联受体（GPCRs）家族成员,与过敏等多种炎性疾病密切相关。为探讨香鱼CCR3（PaCCR3）在响应鳗弧菌感染时的表达变化,从转录组测序数据中获得了PaCCR3基因全长cDNA序列。序列分析表明,PaCCR3具有7次跨膜结构,与胡瓜鱼CCR3氨基酸序列同源性最高（84.6%）。系统进化树分析表明,哺乳类、两栖类和鱼类CCR3单独成簇,鱼类CCR3形成一个大簇;PaCCR3与胡瓜鱼CCR3进化相关性最高。实时荧光定量PCR结果显示,PaCCR3基因mRNA在单核/巨噬细胞（MO/MФ）中表达量最高;鳗弧菌感染后肝、脾和头肾中PaCCR3基因mRNA表达量显著上调;且香鱼MO/MФ经鳗弧菌体外刺激后,PaCCR3基因mRNA的表达量显著上调。Western blot分析表明经鳗弧菌体外刺激后,香鱼MO/MФ中PaCCR3蛋白的表达量也显著增加。综上,PaCCR3基因mRNA及其编码蛋白响应于病原体感染而被诱导表达。研究结果首次揭示了香鱼CCR3基因mRNA及蛋白的表达响应于鳗弧菌侵染,它可能通过介导MO/MФ的功能活性参与免疫应答,可为深入探究鱼类CCR3的功能及作用机制提供新的切入点。     

高盐突变对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长性能及相关酶活力的影响

为模拟夏季水分蒸发水体盐度快速升高对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长性能及理化调节的影响,试验设置盐度从30突变至35、40、45、50、55及60,以盐度30为对照,突变盐度下养殖28d,每7d检测凡纳滨对虾的存活率、相对增重率、体长增长率,试验结束时检测血清Na+/K+-ATP酶、总ATP酶、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果表明,高盐突变显著抑制凡纳滨对虾的存活率和相对增重率(P0.05),随着突变盐度的升高,凡纳滨对虾的相对增重率逐渐降低,60盐度组仅为对照组的15.53%。盐度突变至50后,凡纳滨对虾存活率显著下降。随着高盐突变幅度的增加,Na+/K+-ATP酶和ACP酶活力受到显著影响(P0.05),其中Na+/K+-ATP酶活力逐渐上升,在突变60盐度时表现为最高;ACP酶表现为先上升再下降的单峰变化趋势。总ATP酶、SOD酶、AKP酶受影响不显著(P0.05)。结果表明,高盐突变幅度越大,凡纳滨对虾存活率越低、生长越缓慢,Na+/K+-ATP酶活力升高,渗透调节能力增强,ACP酶活力升高,说明高盐突变激发凡纳滨对虾机体代谢活力。     

温度突变对大海马(Hippocampus kuda)幼体生长、组分及酶活力的影响

以大海马幼体为实验材料,通过设置不同的温度突变组(温度从23℃突变至15℃、28℃和33℃)的方法,对其生长、生化组分以及酶活力的影响进行了研究。结果表明,实验结束后,28℃温度组的大海马幼体生长指标、蛋白含量、能值显著高于23℃对照组(P<0.05),而15℃、33℃温度组的各项指标则显著低于对照组(P<0.05);此外,温度突变组的大海马幼体的酶活力均有先升后降的趋势,在1d后出现峰值,4—6d各个温度组趋于稳定,到实验第15天时,28℃温度组的SOD、ACP活力和MDA的含量已处于23℃对照组水平(P>0.05),CAT、AKP活力显著高于23℃对照组(P<0.05)。而15℃、33℃温度组的SOD、CAT活力降至低于23℃对照组水平(P<0.05),15℃温度组的ACP、AKP活力则低于23℃对照组水平(P<0.05),MDA的含量在15℃、33℃温度组随时间延长而增加。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)精子冷冻前后的活力及超微结构变化

采用两步降温法超低温冷冻保存大黄鱼精子,并用透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤.结果表明,大黄鱼冻精的激活率、运动时间及寿命与鲜精相比无显著差异.鲜精中28.5％的精子形态结构异常,冻精中37％的精子形态结构异常.形态结构正常的精子表现为质膜与核膜结构完整、无膨胀现象,袖套、轴丝及中心粒结构正常,线粒体形态完整、嵴较发达;形态结构异常的精子表现为质膜破裂、脱落,质膜膨胀,核膜破裂、脱落,核局部受损伤,线粒体膨胀、嵴退化或消失,线粒体移位或脱落.结果显示,以Cortland溶液为稀释液,10％ DMSO为抗冻剂,对大黄鱼精子具有较好的抗冻保护作用.     

海蜇(Rhopilema esculentum)浮游幼体对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)卵和初孵仔鱼捕食的比较研究

利用实验生态学方法研究不同个体大小的海蜇浮游幼体[平均伞径(2.5±0.1),(4.1±0.2),(11.7±0.5),(21.1±0.6)mm]对不同密度(10,30,50,80ind/L)的褐牙鲆卵[卵径(0.92±0.01)mm]和初孵仔鱼[全长(3.01±0.08)mm]的捕食率,解析海蜇浮游幼体对初孵仔鱼的捕食率随捕食时间(0.5,1,2,3,4,5h)的变化特征。结果表明,各个体组海蜇浮游幼体对卵的捕食率均显著低于对仔鱼的捕食率;它们对卵的捕食率与卵密度和海蜇个体大小的关系不显著,但对仔鱼的捕食率随海蜇个体大小及仔鱼密度的增大而显著升高;伞径21.1mm的个体对仔鱼的捕食率在开始捕食后1h时达到最大值[17.3ind/(predator.h)],此后随捕食时间的延长而逐渐下降。在自然水域中,如果二者发生时空上的匹配关系,海蜇浮游幼体对仔鱼的捕食可能影响褐牙鲆的早期存活及其资源补充量的变动。     

黑鲪(Sebastes schtegeli)遗传多样性的等位酶研究

应用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术,对分别取自青岛、日照、荣成、长岛的野生黑鲪及荣成黑鲪人工繁育的F1代共5个群体的等位酶多态性进行分析.结果表明,分析的5个群体13种等位酶的25个基因座位中,多态位点比例(P)为36.0%-20.8%,平均每个位点的预期杂合度(He)为0.076-0.036,平均每个位点的实际杂合度(Ho)为0.063-0.040,证明所选5个群体具有较高的遗传多态性.5个群体之间遗传距离(D)为0.024-0.001,根据遗传距离进行UPGMA聚类分析,5个群体聚类次序与亲缘关系和地理位置表现出明显的正相关关系,长岛群体与其它四个群体间遗传距离最大(0.024-0.020),达到居群间差异水平.     

镉胁迫条件下大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)外周血微核标记及肝脏过氧化物酶标记的变化

采用静态毒性实验方法,研究重金属镉胁迫条件下大弹涂鱼外周血微核率和肝脏过氧化物酶活性的变化。结果表明,在0.05mg/L Cd2 浓度组,10d时检测到微核率极显著升高;0.5mg/L和5mg/L组5d时就可检测到微核率极显著升高,到10d时微核率达到最高值;10d时转入清洁海水后,3个组在15d再次出现一个微核率的最高值。大弹涂鱼肝脏过氧化物酶标记包括谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽转硫酶(GST)。3个组的GSH-Px酶活性和5mg/L浓度组GST酶活性在12h后显示出极显著变化,3个组GST酶活性在24h检测到极显著差异;在转入清洁海水5d时,3个组GSH-Px酶活性和对照组相比可检测到极显著差异,而3个组的GST酶活性均无显著差异。研究结果表明,大弹涂鱼外周血微核标记和肝脏过氧化物酶标记能够灵敏地指示水环境中的镉污染;大弹涂鱼外周血微核标记和肝脏内过氧化物酶标记具有一定的互补作用。     

香鱼(Plecoglossus altivelis) JNK1基因克隆及其在成熟卵过熟进程中的表达变化

c-Jun氨基端激酶(c-JunN-terminalkinases,JNKs)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)蛋白超家族成员之一,参与细胞骨架构建、细胞凋亡等多种细胞活动。本研究克隆了香鱼(Plecoglossusaltivelis)JNK1基因cDNA序列,并检测了其成熟卵在排入体腔保存不同时间(0—96h)的过熟过程中JNK1基因的表达变化。结果显示,香鱼JNK1基因cDNA序列全长1670bp,含一个长度1155bp的开放读码框,编码384个氨基酸,预测蛋白分子质量约44.2kDa、理论等电点6.61。氨基酸序列多重比对显示硬骨鱼类中JNK1氨基酸序列高度保守,香鱼与黄鳝的JNK1序列相似性最高(97.6%)。系统进化树分析显示各种脊椎动物的JNK1、JNK2、JNK3分别聚为一簇;本研究获得的香鱼JNK1位于JNK1大簇中并与黄鳝JNK1优先相聚,表明二者进化关系较近。RT-PCR检测结果显示健康香鱼JNK1基因在脑和性腺中高表达,肝和鳃中无表达。实时荧光定量PCR检测显示香鱼成熟卵JNK1基因的表达变化与卵的受精率、孵化率随保存时间延长而降低之间存在相关性:成熟卵随保存时间的延长JNK1表达量逐渐升高、在48h时达到峰值(24h、48h时的表达量分别为0h时的1.49倍和2.55倍),在此期间卵有较高的受精率和孵化率(48h时分别为88.99%和67.32%);保存时间继续延长时卵内JNK1基因都处于高表达水平,72h和96h时的表达量分别为0h时的2.32倍和1.53倍,而卵的质量也在保存超过48h后急剧下降(72h时受精率和孵化率分别为50.2%和25.54%)直至基本失去受精、孵化能力(96h时受精率和孵化率分别为10.83%和0.54%)。综上,香鱼JNK1基因表达上调与香鱼成熟卵的过熟凋亡过程密切相关,为深入研究香鱼JNK1基因的功能及卵过熟机制提供了基础资料。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)铁蛋白的分子鉴定、表达及功能研究

铁蛋白(Ferritin,Fer)是一类广泛存在于生物体内、并与铁代谢密切相关的铁储存蛋白。本研究通过香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组测序获得铁蛋白亚基基因(Pa Fer)c DNA全序列,结果显示,Pa Fer由943个核苷酸组成,开放阅读框为531bp,编码176个氨基酸,预测相对分子质量为20.4k Da,等电点为5.46。氨基酸序列多重比对结果显示,Pa Fer具有保守的铁蛋白样双铁结构域,与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鲑(Salmo salar)Fer M亚基(Fer-M)同源性最高,均为92%;系统进化树分析表明,Pa Fer与胡瓜鱼、大西洋鲑和虹鳟的Fer-M聚为一个小簇,与虹鳟Fer-M进化相关性最高。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)结果表明,Pa Fer m RNA主要在香鱼脾脏中表达量最高,肾脏、鳃、脑和心脏中次之;鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后,香鱼肝脏、脾脏和肾脏等组织中Pa Fer m RNA表达显著上调。原核表达了Pa Fer重组蛋白(r Pa Fer),r Pa Fer以包涵体形式表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,尿素梯度透析法复性r Pa Fer。铁螯合实验结果显示,当r Pa Fer浓度为4μg/m L时,螯合铁的能力最大,为43.96%。抑菌实验结果表明,r Pa Fer对鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的最小抑菌浓度分别为1.5625、25.0和100.0μg/m L。综上,Pa Fer与香鱼抗病原感染的免疫反应紧密相关,可能通过调控铁代谢参与鱼类抵抗微生物的宿主自身免疫过程。本研究为进一步研究鱼类Fer的功能及在病原菌感染免疫中的分子机制奠定基础。     

虎斑乌贼( Sepia pharaonis )胚胎发育及孵化历期观察

采捕虎斑乌贼野生卵群进行室内培育,采用显微成像系统,观察其胚胎发育过程,并详细描述各发育期的特征。结果显示:虎斑乌贼卵长径(30.7±2.4)mm,短径(13.4±1.3)mm,胚胎发育过程共分为卵裂、囊胚期、原肠期、器官芽原基出现、眼色由无色到黑色等30期,探讨了主要器官(眼、漏斗等)的发生变化过程。在胚体生长期间,胚体长度随时间逐渐增加,而卵黄大小则随之减小。从7—20d,胚体长度由2.5mm增至11.3mm,而卵黄直径由8.9mm减至4.5mm,胚体与卵黄长度比例由0.28增至2.51。在水温(23±0.5)℃,盐度28,pH7.41条件下,孵化高峰期为20—24d,孵化率为85.3%,初孵乌贼幼体平均体长(13.5±0.3)mm,平均胴体长(8.6±0.3)mm,平均体重(0.18±0.02)g。     

东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)对中华哲水蚤(Calanus sinicus)摄食和消化酶活性的影响

采用单养和混养的方法,在实验条件下研究了东海原甲藻对中华哲水蚤摄食和消化酶活性的影响.结果表明:(1)中华哲水蚤对东海原甲藻存在一定摄食行为,藻类密度对摄食率有明显的影响.实验密度下,中华哲水蚤对东海原甲藻的最大摄食率为930cells/(ind·h).滤水率随着藻密度的增加而呈单一性的下降;(2)混养条件下,中华哲水蚤对金藻和东海原甲藻的摄食率均较单养时下降,滤水率的变化与摄食率相似;(3)不同藻密度下,昆布多糖酶活性都明显高于麦芽糖酶和纤维二糖酶的活性,而麦芽糖酶活性又稍高于纤维二糖酶的活性.与金藻相比,东海原甲藻实验组中华哲水蚤3种消化酶活性明显升高(P<0.05).     

盐度胁迫对大海马(Hippocampus kuda)幼体生长、组分及酶活力的影响

在盐度为25的条件下,以大海马幼体为实验材料,通过设置不同的盐度胁迫组(盐度从25胁迫至5、15和35)的方法,对其生长、生化组分以及酶活力的影响进行了研究。结果表明:15盐度组大海马幼体的体重、生化组分、能值与对照组(盐度25)相比差异不显著(P>0.05),体长、成活率指标则显著高于对照组(P<0.05),然而5、35盐度组的生长指标、成活率、生化组分等则显著低于对照组(P<0.05)。15盐度组的SOD、CAT酶活性低于对照组水平(P<0.05),MDA的含量变化不显著(P>0.05);而5、35盐度组SOD、CAT和MDA含量与对照组相比,随着时间的延长,呈现逐渐升高的趋势(P<0.05);随着盐度的升高,AKP酶活性具有逐渐升高的趋势,而ACP酶活性则呈现降低趋势。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)脾脏酪氨酸激酶SYK的鉴定及其介导的MAPK信号通路研究

脾脏酪氨酸激酶(SYK)是一种非受体型酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinase, NRTK)。在哺乳动物中,SYK是重要的细胞信号通路接头分子,其在免疫细胞活化,胞外刺激的信号转导和病原体识别等多种生命过程中扮演重要角色,然而在鱼类中却鲜有报道。本研究以香鱼(Plecoglossus altivelis)为研究对象,探讨了其SYK(PaSYK)在应对病原微生物感染及在活化免疫信号通路中的作用。我们克隆获得了香鱼SYK的cDNA序列,并利用多重序列比对、构建进化树等生物信息学方法分析PaSYK的进化地位;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析PaSYK在健康组织及鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后的表达变化;亚细胞定位检测PaSYK在HEK293T细胞的分布情况;在香鱼头肾单核/巨噬细胞(Monocyte/macrophage,MO/MΦ)中过表达PaSYK,研究其对炎症细胞因子表达的调控作用并在HEK293T细胞及香鱼头肾MO/MΦ中研究PaSYK对MAPK信号通路的活化作用。多重序列比对结果显示,SYK的蛋白质序列和结构域在进化...     

不同模式凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘沉积物酶活性及其微生物群落结构分析

采用现场测定、磷脂脂肪酸(PLFA)法及基质脱氢酶活性测定等方法,对4种不同养殖模式的凡纳滨对虾池塘的水质、沉积物酶活性及微生物群落结构进行了分析和研究。结果表明:养殖末期,凡纳滨对虾淡水混养和海水混养池塘水质较好,海水集约化池塘水质最差;其中海水集约化池塘沉积物基质中有机质含量、微生物生物量、微生物活性和酶活性都很高,真菌、G+菌的相对含量则很低。主成分分析(PCA)表明:第一主成分主要与脲酶、有机质含量、微生物活性、总PLFA、B/F有显著的正相关关系(r>0.9),而与Gram+/Gram-、pH、18:1ω9C/T、单不饱和/支链却存在显著的负相关关系(r>0.9);第二主成分主要与脱氢酶有显著正相关关系(r>0.8),四种池塘在PCA图中分散开,说明其微生物群落结构及环境状况存在明显差异。     

三种养殖模式下日本鳗鲡(Anguilla japonica)养成品血清生化指标和脏器消化酶、抗氧化酶活力的差异

随机选取池塘专养(M1)、日本沼虾套养(M2)以及水库放养(M3)三种养殖模式养成的肛长(25.91±3.26)cm的日本鳗鲡(Anguilla japonica)作为研究材料,采用生物化学方法测定并比较了不同养殖模式日本鳗鲡养成品血清生化指标和脏器消化酶与抗氧化酶活力。结果表明:(1)在所测16项血清生化指标中,三者间均无显著差异的为TP、ALB、GLB、ALT和CHE(P>0.05),均具显著差异的为CK、CREA和α-HBDH,它们的测定值依次呈M3>M2>M1(P<0.05)、M3>M1>M2(P<0.05)和M2>M1>M3(P<0.05);(2)所测消化酶中,三者均具显著差异的为肝脏蛋白酶、胃蛋白酶、肝脂肪酶及胰腺脂肪酶,它们的测定值均呈M1>M2>M3(P<0.05);(3)所测抗氧化酶中,三者间均无显著差异的为心脏SOD、CAT、POD和肝脏CAT活力(P>0.05),均具显著差异的仅为肝脏POD活力,其测定值呈M1>M3>M2(P<0.05)。