白斑综合症杆状病毒(WSBV)PCR检测方法的改进及应用

斑节对虾Penaeusmonodon白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒 (WSBV)所致。患有典型白斑综合症的斑节对虾 ,用两种提取病毒模板DNA的方法 ,进行PCR扩增 :一种是用传统的方法 ,即蛋白酶K ,CTAB等消化 ,酚 /氯仿抽提 ,乙醇沉淀得到DNA ;另一种是用改进的煮沸法提取病毒DNA。对比发现后一种方法稳定性及敏感性比前者高 ,重复性好。用后一种方法对病虾的复眼进行检测 ,PCR结果为阳性。应用后一种方法还对病虾的各组织器官及人工感染的虾进行检测 ,发现病虾中除肝胰腺外 ,附肢、肌肉、心脏、鳃、胃、中肠、神经、复眼、表皮结果均为阳性。感染实验中 ,出现阳性结果注射感染比投喂感染早 ,而且肌肉和附肢较敏感。     

白斑综合症杆状病毒致病性特征

对白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）致病性特征的研究结果表明：ＷＳＢＶ的致病性与斑节对虾Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ个体大小无关,ＷＳＢＶ的致病力与感染方式和病毒数量有关;在盐度为１４、温度为２８－３２℃的海水中,游离ＷＳＢＶ在４ｈ内失去感染活性;体长７ｃｍ的白斑综合症死亡斑节对虾,其携带的ＷＳＢＶ在５７ｈ失去感染活性;体长７ｃｍ死亡斑节对虾经２８℃空气干燥,其携带的ＷＳＢＶ在５０ｈ失去感染活性;ＷＳＢＶ不能通过体表感染健康斑节对虾,而斑节对虾摄食一定数量病毒才能导致感染;水不能作为游离ＷＳＢＶ的载体传播ＷＳＢＶ。     

白斑综合症杆状病毒致病性特征

对白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）致病性特征的研究结果表明,ＷＳＢＶ的致病性与斑节对虾个体大小无关,ＷＳＢＶ的致病力与感染方式和病毒数量有关,在盐度为１４,温度为２８￣３２℃的海水中,游离ＷＳＢＶ在４ｈ内失去感染活性;体长７ｃｍ的白斑综合症死亡斑节对虾,其携带的ＷＳＢＶ在５７ｈ失去感染活性;体长７ｃｍ死亡斑节对虾经２８℃空气干燥,其携带的ＷＳＢＶ在５０ｈ失去感染活性;ＷＳＢＶ不能通过体表感染健康斑节     

利用WSBV的引物扩增中国对虾的杆状病毒DNA

利用台湾报道的ＷＳＢＶ的ＰＣＲ引物,成功地扩增出了１４００ｂｐ左右的中国对虾的杆状病毒的ＤＮＡ片段,与预计的产物长度吻合。该引物对经初步离心处理的病虾组织也能扩增出特异性ＤＮＡ条带,而对正常虾组织ＤＮＡ、昆虫杆状病毒（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡ进行扩增,均获得阴性结果。说明该引物的特异性较高,对中国对虾的杆状病毒的检测具有一定的实际应用价值。实验结果同时说明ＷＳＢＶ与中国对虾的杆状病毒有同源序列存在,具有一定的保守性;用该引物进行的ＰＣＲ扩增为中国对虾的杆状病毒与其他相关病毒的比较研究提供了一种技术手段。     

一种对虾杆状病毒形态及形态发生的研究

以患病死亡的甲壳上具白斑的斑节对虾(Penaeusmonodon)虾头及从中提取的病毒悬液分别感染中国对虾(Penaeuschinensis)幼虾及日本对虾(Penaeusjaponicus)。感染后此2种对虾均发病死亡 ,且甲壳上均有白斑。电镜下对人工感染的中国对虾幼虾及日本对虾的组织器官进行观察发现了大量的病毒。此病毒为杆状 ,具囊膜 ,无包涵体 ,大小为295nm×105nm。此病毒的形态发生起始于细胞核 ,并可分为4个阶段 :病毒基质的形成、囊膜的形成、病毒的装配和完整的病毒粒子的形成。病毒的装配过程是与其大量迅速繁殖相适应的。     

对虾白斑综合征病毒分子生物学研究进展

对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus．WSSV)是引起对虾白斑综合症的主要病原。对虾白斑综合症于20世纪90年代初首先在中国台湾地区发生,1994年扩展到整个亚洲的对虾养殖地区。1995年11月,西半球首先发现该病毒,1999年美国中部和南部也有类似的报道。2001年欧洲和澳洲都检测到了WSSV。短短10余年,对虾白斑综合症席卷了全球的对虾养殖地区,给世界对虾养殖业造成了不可估量的损失。     

白斑综合症病毒的生物学特性

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）是第一个测得基因组序列的海洋生物病毒 ,也是迄今已知的最大动物病毒［１］。该病毒遍及亚洲主要对虾养殖国家和地区 ,并已传播到中美洲和南美洲 ,给对虾养殖造成了巨大的损失。自１９９３年以来随着病毒学的发展以及现代分子生物学技术在对虾病毒研究领域的广泛应用 ,国内外学者对白斑综合症病毒的研究和认识也愈来愈深入 ,取得了一些突破性的进展。根据近１０ａ的文献资料 ,本文对白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的生物学特性进行综述 ,以期为深入开展白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的研究提供参考。１白斑综合症病毒…     

对虾白斑杆状病毒（WSBV）对斑节对虾 的实验感染与病理学 …

用取自发病虾塘患典型白斑病的病虾为毒源,对健康斑节对虾Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ进行人工感染,按Ｋｏｃｈ氏法证实了对虾白斑杆状病毒（ＷＳＢＶ）是白斑病的病原。对人工感染ＷＳＢＶ后的组织病理变化和宿主细胞感染ＷＳＢＶ后的超微病变过程。结果表明：感染ＷＳＢＶ后病虾 的不同组织均存在广泛的变性、坏死,上皮细胞大量解体、脱落;部分细胞核肿大、游离;结缔组织糜烂,呈现空泡化;未发现包涵体。航向电镜照片显     

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。     

斑节对虾一种新球形病毒的研究

应用电镜超薄切片技术，发现斑节对虾肝胰腺上皮、肠上皮和淋巴样细胞质中一种新的球形形病毒，称之为斑节对虾球形病毒。病毒粒子为球形，直径２８－３５ｎｍ，核衣壳直径２１－２８ｎｍ，囊膜光滑无纤突，包涵体多数为球形，体积差异颇大，外有单位膜包被。ＭＳＶ与ＭＢＶ混合感染，造成严重理变化。     

对虾白斑综合症病毒的诊断和检测

对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）也叫白斑综合症杆状病毒（WSBV）、系统外胚层和中胚层杆状病毒（SEMBV）、日本对虾杆状核病毒（RV-PJ）、对虾杆状DNA病毒（PRDV）、皮下及造血组织坏死杆状病毒（HHNBV）、中国对虾杆状病毒（PCBV）、淋巴样细胞核性杆状病毒（LNBV）（陈秀男等，1994；Wongteerasupaua等，1995；Inouye 等，1994、1996；黄倢等，1995a；战文斌等，1995；陈细法等，1997），是全球对虾养殖业危害性最大的病毒之一。自1992年WSSV暴发性流行以来，造成了对虾养殖业的严重萎缩。鉴…     

检测cDNA文库克隆中插入片段大小的简易方法

在ｃＤＮＡ文库克隆的大规模测序之前 ,一般需对克隆中插入片段的大小进行检测。传统的检测方法是首先用煮沸法［１,２］或碱裂解法［１,３］提取质粒ＤＮＡ ,然后用限制性内切酶进行酶切分析。在对大量的克隆进行检测时 ,这种方法则显得十分烦琐、费时。Ｚｏｎ等［４］于１９８９年提出了一种基于ＰＣＲ技术的直接用于克隆检测的方法。与传统的酶切检测法相比 ,此种方法相对简单、快速得多。但是它仍然需要提取质粒ＤＮＡ ,而且实验成本较高。新近 ,Ｔａｒｉｇ［５］等对Ｚｏｎ等的方法进行了进一步的改进。改进后的方法不需要提取质粒Ｄ…     

15个斑节对虾家系生长及抗白斑病毒分析

为研究斑节对虾生长速度和抗病性的关系,按照1尾雌虾对1尾雄虾的比例建立15个全同胞家系,通过这15个斑节对虾全同胞家系生长、抗白斑病毒( WSSW)试验,选出具有生长优势的家系394,053,抗病性强的家系242,007,480.对抗病免疫相关因子超氧化物岐化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)的分...     

对虾病毒病害研究的新进展

本世纪70年代以来,世界沿海各国对虾养殖业蓬勃发展,在许多国家甚至成为经济发月的支柱产业。然而,由于盲目的高密度放养,养殖的生态环境不断恶化等原因,使得对虾n害,特别是对虾病毒性病害在世界养虾国家迅速蔓延。近几年来,一些毒力强、宿主范围厂泛的对虾病毒如白斑综合症病毒（WSSV）、黄头症病毒（YHV）、Taura综合症病毒（TSy）宰相继出现。伴随对虾种苗与水产品国际贸易交流增多,许多原本是地区性的病毒逐步变成＃界性的暴发病并广泛流行。它们除了给沿海养殖业带来巨大的经济损失之外,而且对海洋级源的可持续发展造成严…     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中一氧化氮合成酶的鉴定及其在白斑综合症病毒感染过程中的变化

诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在生物机体免疫，特别在无脊椎动物免疫中的作用近来得到了广泛的关注，由其催化产生的一氧化氯(NO)除具有已知的神经传导、松弛平滑肌等功能外，还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫等作用。作者通过硝基四氯唑蓝(NBT)法和血细胞形态观察等方法，对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中存在的诱导型一氧化氮合成酶进行了初步鉴定。在此基础上，通过亚硝酸盐法和L-瓜氨酸法对比，研究了感染白斑综合症病毒(WSSV)后中国明对虾血细胞中一氧化氯合成酶的变化情况。结果显示，中国明对虾在感染WSSV后，iNOS活性在12h内有上升趋势，实验36h后酶活性显著下降，至60h后酶活性降至对照组的一半左右。同时，被脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮合成酶活性与对照相比也有显著下降。与此对应的是，核酸探针斑点杂交法检测病毒的结果显示：实验36h后在对虾体内能够检测到白斑综合症病毒。对照组中国明对虾血细胞的iNOS在实验过程中基本保持稳定。这说明WSSV在感染中国明对虾初期可以诱导血细胞产生iNOS，但随着WSSV在中国明对虾体内的大量增殖及其对血细胞的破坏，使得iNOS活性显著降低，对虾也趋于死亡。因此，iNOS能够作为反映对虾在病毒感染过程中健康状况的有效指标。     

中国对虾一种C型杆状病毒随机扩增多态性DNA分析

于１９９４年和１９９５两年的７月从青岛崂山上马镇养虾场中染病的中国地虾中分离纯化出一种Ｃ型杆状病毒。为建立中国对虾病毒的鉴别和检测技术，利用随机扩增多态性ＤＮＡ技术对电泳纯化的病毒ＤＮＡ进行分析和研究。将病虾匀浆、经差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化获得完整病毒粒子；从病毒中提取ＤＮＡ后再进行电泳纯化，收集长度完整，均一的病毒ＤＮＡ：在其他参数保持不变的情况下，对Ｏｐｅｒｏｎ生产的１０碱基随机引物Ｋ试     

对虾白斑杆状病毒(WSBV)对斑节对虾的实验感染与病理学研究

用取自发病虾塘患典型白斑病的病虾为毒源 ,对健康斑节对虾Penaeusmonodon进行人工感染 ,按Koch氏法证实了对虾白斑杆状病毒 (WSBV)是白斑病的病原。对人工感染WSBV后患典型白斑病的斑节对虾的胃、肠及皮下结缔组织进行石蜡切片和超薄切片 ,研究WSBV引起的组织病理变化和宿主细胞感染WSBV后的超微病变过程。结果表明 :感染WSBV后病虾的不同组织均存在广泛的变性、坏死 ,上皮细胞大量解体、脱落 ;部分细胞核肿大、游离 ;结缔组织糜烂 ,呈现空泡化 ;未发现包涵体。透射电镜照片显示 :感染WSBV后的病虾在感染前期 ,靶细胞核膨胀 ,核仁消失 ,核外膜破损 ,染色质靠边分布 ,内质网断裂 ,核糖体脱落 ,线粒体肿胀 ,高尔基体萎缩 ,溶酶体空泡化 ;感染中期 ,病毒粒子在细胞核内大量复制 ,直至充满整个核 ,细胞核内无结构化 ,核膜及质膜皱缩 ;感染后期 ,核胀破 ,病毒粒子从核内释放 ,细胞核呈空囊状 ,胞质内髓样结构明显 ,细胞器解体 ,细胞功能丧失。     

核酸探针原位杂交检测白斑综合症病毒的组织特异性

从白斑综合症病毒（ｗｈｉｔｅ ｓｐｏｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ,简称ＷＳＳＶ）部发基因组库中得到核酸探针,采用原位杂交检测方法检测对虾甲壳下表皮、胃、后肠、鳃、触角腺的上皮细胞、淋巴器官的基质细胞、肌细胞、心肌细胞及结缔组织细胞,原位杂交结果均为阳性。对虾甲壳下表皮的上皮细胞、胃的上皮细胞对病毒较其它部位敏感,感染程度高;中肠上皮细胞、肝胰腺上皮细胞、淋巴器官内皮细胞未发现感染病毒,原位杂     

白斑综合症病毒膜蛋白VP124参与病毒的感染

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾的最主要病毒病原之一,给对虾养殖造成了巨大的经济损失。WSSV分别与三种该病毒膜蛋白VP39,VP124和VP187的特异性抗血清在体外作用后,再注射到螯虾体内,进行中和试验。结果显示,注射同或未同VP124抗血清作用的WSSV,8 d后螯虾的死亡率分别是100%和60%,WSSV的感染能够被抗VP124抗体中和。进一步利用定量PCR分析上述三种特异性抗血清对病毒感染的影响,结果显示,VP124抗血清可抑制WSSV在螯虾体内的增殖。所有结果表明,VP124在病毒的感染中起作用。     

对虾深池高坝养殖模式的研究

对原建在潮带的对虾养殖池进行改造。使堤坝高3．5m,养殖池水深2．5m,池一端设闸门1座用于养殖池首次进水和对虾收获;养殖前用农药全池泼洒浸泡,杀灭越冬穴类甲壳动物,使用不携带白斑综合症病毒(WSSV)虾苗进行养殖;养殖过程中添加水通过蓄水池进行,池水用80mg／L浓度的漂白粉消毒;养殖过程中定期使用微生态净水剂、沸石矿物剂、消毒剂等,优化养殖环境,增强对虾抗病能力;结果对虾养殖成活率达到40％～60％,能有效防止暴发性流行病的危害。