克氏原螯虾源维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究

本试验通过对从患病的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)肝胰腺中分离得到的一株优势菌X4进行鉴定,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后克氏原螯虾维氏气单胞菌的防治提供参考。从患病克氏原螯虾肝胰腺分离致病菌,通过对其生理生化特征与16S rRNA基因序列分析进行鉴定,并通过纸片扩散法进行药敏试验。用菌株X4进行人工回归感染试验后,克氏原螯虾发病症状与自然发病症状相似。根据该菌株的形态特征、生化特性、16S rRNA与gyrB基因序列分析结果鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。该菌株对庆大霉素、多西环素、新霉素及氟苯尼考等15种抗生素敏感,对阿莫西林、克林霉素及苯唑西林3种抗生素耐药。分离得到的菌株X4对克氏原螯虾有致病性,生产中可选用氟苯尼考、新霉素、多西环素等药物进行防治。     

对虾WSSV人工感染螯虾及其检测

用对虾白斑综合症病毒（WSSV）人工感染淡水克氏原螯虾（Procambarus clarkii),感染组螯虾3-6d内全部死亡,核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴,阳性检出率分别为92%（92%）,89%（86%）,81%（75%）,对照为11%（3%）,3%（5%）,0（0）;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大,嗜酸性着染,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃、阳性检出率均为100%,对照阳性检出率均为0。结果表明：对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾,病毒核酸原位杂交是一种敏感特异的病毒检测方法。     

克氏原螯虾LDH同工酶的组织特异性研究

以克氏原螯虾为材料,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,分析了肌肉、眼球、肝胰腺和心脏4种组织和器官中乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的表达情况。结果发现,眼球中出现Ldh-5和Ldh-62条酶带,肌肉中出现Ldh-1、Ldh-2、Ldh-3、Ldh-4、Ldh-5共5条酶带．肝胰腺中只出现Ldh-61条酶带,心脏中出现Ldh-3和Ldh-5共2条带。在这些检测到的酶带中,肌肉中Ldh-5活性最强,染色最深。实验结果表明,不同组织中LDH的同工酶的表达存在差异。表现出明显的组织特异性。     

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

克氏原鳌虾LDH同工酶的组织特异性研究

以克氏原螯虾为材料,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,分析了肌肉、眼球、肝胰腺和心脏4种组织和器官中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的表达情况.结果发现,眼球中出现Ldh-5和Ldh-6 2条酶带,肌肉中出现Ldh-1、Ldh-2、Ldh-3、Ldh-4、Ldh-5共5条酶带,肝胰腺中只出现Ldh-6 1条酶带,心脏中出现Ldh-3和Ldh-5共2条带.在这些检测到的酶带中,肌肉中Ldh-5活性最强,染色最深.实验结果表明,不同组织中LDH的同工酶的表达存在差异,表现出明显的组织特异性.     

克氏原螯虾热休克蛋白70基因表达的定量研究

根据实验室克隆的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)HSP70(scHSP70)的核酸序列,制备内部缺失42bp的核酸片段作为竞争性模板.采用竞争性RT-PCR的方法,定量测定克氏原螯虾组织的scHSP70 mRNA的表达量.结果显示,scHSP70有广泛的组织分布,但是在正常情况下表达量均较低.经2 h热休克处理,7种组织的scHSP70 mRNA的表达量均显著上升,表明该scHSP70可能是一种热诱导型HSP70.心脏组织scHSP70在热激前后的表达量均较高,分别为1.12×105和4.80×105分子/μg总RNA.而血细胞中scHSP70的表达在热激前后均处于最低水平,分别为0.191×104和1.61×104分子/μg总RNA.在0～8 h长时间的热休克实验中,心脏组织scHSP70的表达随着热休克时间的延长,呈现增强的趋势,提示心脏组织在虾类的应激反应中发挥了重要的作用.     

流式细胞术检测对虾白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染

用WSSV粗提液人工感染克氏原螯虾,感染后分别在6,12,18,24 h采血分离血细胞,通过WSSV的混合单抗和FITC标记的羊抗鼠二抗的间接免疫荧光染色,应用流式细胞仪检测病毒对克氏原螯虾血细胞的感染并分析感染强度.结果表明:分离获得的血细胞形态完好,感染后血细胞内的病毒被标记上了绿色荧光;流式检测发现,随感染时间延长,被感染细胞的百分率及平均荧光强度均逐渐升高,反映血细胞的病毒感染程度逐渐加深;PCR检测同时证实人工感染后各采样点血细胞样品均为WSSV阳性.     

2种不同体色的克氏原螯虾卵巢发育及生长特性研究

本文研究了2种不同体色的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)即青壳原螯虾和红壳原螯虾的生理指标和卵巢发育差异,对同规格不同体色的克氏原螯虾性腺发育、生长速度进行比较分析,以及比较不同温度下同规格的青壳原螯虾生长发育变化。研究结果表明,青壳雌虾卵巢处在I～III期,多数为Ⅰ、Ⅱ期,而同规格的红壳雌虾卵巢各期均出现,Ⅱ、Ⅲ期较多。体质量8g左右的虾苗在30d的饲养过程中,红壳原螯虾的增重率仅为青壳原螯虾的67%,青壳原螯虾的脱壳率比红壳原螯虾高出40%,平均脱壳周期比红壳原螯虾短9d。体质量10g左右的青壳原螯虾在水温(28±2)℃,无遮蔽物的条件下饲养30d后体色由青色转为红色,而相同规格的青壳原螯虾在(18±2)℃的水温,无遮蔽物条件下生长30d后体色仍保持为青色。     

红螯螯虾虹彩病毒在两种螃蟹内的研究

最近报道从患病的红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)中分离出一种新的虹彩病毒,被暂时命名为红螯螯虾虹彩病毒.它还能感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),为了探究红螯螯虾虹彩病毒是否能够感染同属于甲壳纲、十足目的螃蟹.选取中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)作为实验对象,应用实时荧光定量PCR技术和透射电子显微镜技术,结论证明了红螯螯虾虹彩病毒能够感染中华绒鳌蟹和粗腿厚纹蟹.推测其他蟹类也可能是其潜在的宿主,这暗示着红螯螯虾虹彩病毒对螃蟹的养殖是一种潜在的威胁.     

白斑综合症病毒膜蛋白VP124参与病毒的感染

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾的最主要病毒病原之一,给对虾养殖造成了巨大的经济损失。WSSV分别与三种该病毒膜蛋白VP39,VP124和VP187的特异性抗血清在体外作用后,再注射到螯虾体内,进行中和试验。结果显示,注射同或未同VP124抗血清作用的WSSV,8 d后螯虾的死亡率分别是100%和60%,WSSV的感染能够被抗VP124抗体中和。进一步利用定量PCR分析上述三种特异性抗血清对病毒感染的影响,结果显示,VP124抗血清可抑制WSSV在螯虾体内的增殖。所有结果表明,VP124在病毒的感染中起作用。     

白斑综合征病毒对脊尾白虾的致病性研究

2010年、2011年江苏沿海多数地方海水养殖中发生了脊尾白虾大规模死亡的现象,本课题通过对患暴发性流行病的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)进行病毒分子生物学检测,发现病虾体内白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,简称WSSV)检测普遍呈阳性;应用发病虾组织制备的病毒粗提液,进行了人工感染实验,实验表明该病毒对脊尾白虾具有较强的致病性,可引起68.5%的死亡率。电镜结果表明,发病虾与感染病虾鳃及肝胰脏等组织器官都发生了相同的细胞病理变化,主要表现为细胞核内染色质边聚、线粒体肿胀、内嵴消失等一系列细胞病理变化,在其细胞核与细胞质中发现了具有单层囊膜结构的对虾白斑综合征病毒粒子,病毒粒子大小约为(130~170)nm×(305~405)nm,核衣壳呈子弹形,一端较细另一端较粗,完整病毒粒子由核心、衣壳和囊膜构成,分子生物学实验表明该病毒为WSSV。实验结果符合柯赫氏法则,可以初步推断WSSV感染脊尾白虾并与引发的大规模死亡有着直接关系。     

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。     

鳗弧菌感染对斑节对虾免疫相关指标的影响

为了研究鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对斑节对虾(Penaeus monodon)免疫相关指标的影响,分别对斑节对虾注射生理盐水和鳗弧菌,测定了不同时间点肝胰腺和鳃中总抗氧化能力(T-AOC)、溶菌酶(LSZ)和诱导型一氧化氮合酶(i NOS)活性以及一氧化氮(NO)含量的变化。结果显示,与对照组相比,感染鳗弧菌后,肝胰腺和鳃中T-AOC活性分别于6和12 h达到最大值(P0.05),随后逐渐降低;肝胰腺和鳃中LSZ活性分别于6和12 h升高至最大值,随后均于24 h显著低于对照组(P0.05);肝胰腺和鳃中NO含量分别于6和3 h达到最大值,随后肝胰腺中NO含量于24 h降低至最小值,而鳃中NO含量于6和24 h虽有降低,但仍显著高于对照组;肝胰腺中i NOS对感染反应较为敏感,活性于3 h达到最大值,而鳃中i NOS活性于6 h开始显著上升,并于12 h达到最大值(P0.05)。研究表明,长时间的鳗弧菌感染对斑节对虾免疫相关指标有显著影响;T-AOC、LSZ、NO和i NOS对鳗弧菌感染均反应敏感,可以作为弧菌病诱发的监测指标。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)补体C3和C4基因的分子特征及表达分析

本文测定了大黄鱼C3(L.c-C3)和C4(L.c-C4)基因的c DNA全序列。结果表明,L.c-C3和L.cC4序列全长分别为4962bp和5088bp,分别编码1653和1695个氨基酸,N端信号肽序列分别为23和19个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼C3和C4与已报道的补体C3、C4同样都具有在功能上比较重要的残基以及保守的硫酯区。分子进化分析表明,L.c-C3和L.c-C4分别与鮸鱼C3、C4的氨基酸同源性最高。实时荧光定量PCR结果显示,L.c-C3和L.c-C4在健康大黄鱼的肝脏、脾脏、肠、鳃、心脏、脑、肌肉和胃这8种组织中都有表达,其中肝脏的表达量最高。在大黄鱼胚胎不同发育时期(从2细胞期到初生仔鱼)中,L.c-C3在各个阶段没有明显的变化,而L.c-C4的表达量有明显升高。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染的大黄鱼肝脏和脾脏中,L.c-C3和L.c-C4的m RNA表达量均明显上调。该结果表明,大黄鱼肝组织C3和C4基因表达变化与溶藻弧菌的侵染密切相关,揭示了C3和C4在大黄鱼抗细菌免疫反应中具有重要的作用。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因(PtCht6)的克隆及其在免疫中的功能分析

几丁质酶(chitinase)在甲壳动物的蜕皮、消化和免疫等很多生物学过程中发挥重要功能,为深入探讨几丁质酶的免疫防御机制,本实验利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCht6基因。该基因cDNA全长2736bp,开放阅读框(ORF)2103bp,编码700个氨基酸,具有几丁质酶GH18家族典型特征。利用实时荧光定量技术分析PtCht6在三疣梭子蟹不同组织、不同蜕皮阶段、不同病原感染以及低盐胁迫(11)下的表达特征,结果显示:PtCht6在各组织中均有表达且在肝胰腺中的表达量最高;在不同蜕皮时期的肝胰腺中,其表达量由蜕皮后期(A/B)、蜕皮间期(C)、蜕皮前期(D)依次递减(P0.05);人工感染WSSV和副溶血弧菌后.PtCht6的表达量在肝胰腺中分别于12h、72h达到最大值,在血细胞中均于12h达到最大值,且相较于对照组,整体显著上调表达(P0.05);低盐胁迫能够显著抑制该基因的表达,最高抑制73倍(P0.05)。同时发现,低盐环境下感染WSSV后,该基因达到峰值的时间明显延迟(至少延迟12h.P0.05)。该研究结果预示PtCht6作为免疫因子参与三疣梭子蟹的病原防御,且低盐胁迫在一定程度上抑制了该基因的免疫功能。     

饲料中添加芽孢杆菌组分对凡纳滨对虾幼虾生长、能量代谢和抗WSSV能力的影响

以凡纳滨对虾(Litopnnaus vannamei)幼虾为实验动物,在其基础饲料中分别添加芽孢杆菌(Bacillus sp.)胞外蛋白粗提物(1.0%,胞外蛋白组)、胞内多糖粗提物(1.0%,胞内多糖组),以基础饲料为对照组饲料,进行为期28d的养殖实验,探讨芽孢杆菌胞外蛋白和胞内多糖粗提物对幼虾生长、能量代谢及抗病能力的影响。研究表明,芽孢杆菌2种粗提物对凡纳滨对虾的生长和成活率影响不显著(P>0.05)。饲喂2种粗提物影响了凡纳滨对虾肝胰腺和肌肉中能量代谢相关酶活力。胞外蛋白组肝胰腺中磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)活力在养殖实验前期显著高于对照组(P<0.05),而肌肉中PFK、LDH活力显著低于对照组(P<0.05);胞内多糖组肝胰腺中己糖激酶(HK)活力及肌肉中PFK、LDH活力显著低于对照组(P<0.05)。饲喂2种粗提物均显著提高了凡纳滨对虾肌肉中琥珀酸脱氢酶(SDH)活力和肝胰腺中电子传递系统(ETS)活力(P<0.05),胞外蛋白粗提物对肝胰腺中的SDH活力也有显著的提高作用(P<0.05)。饲喂2种粗提物显著降低了凡纳滨对虾肝胰腺及肌肉组织中脂肪酸合酶(FAS)含量(P<0.05)。此外,饲喂2种粗提物均会显著提高凡纳滨对虾肠道蛋白酶活力(P<0.05),而胞外蛋白粗提物使凡纳滨对虾肠道脂肪酶活力显著降低(P<0.05)。白斑综合征病毒(WSSV)感染后,与对照组相比,胞外蛋白组和胞内多糖组凡纳滨对虾半致死时间分别延长了26.19%和7.14%。根据以上结果推测,芽苞杆菌2种粗提物能够影响凡纳滨对虾能量代谢水平并提高其抗WSSV能力,且二者之间密切相关。     

斑节对虾TSG101基因的克隆及表达分析

为探究肿瘤易感基因101(简称TSG101)对斑节对虾(Penaeusmonodon)的免疫应答作用,了解在细菌刺激下斑节对虾的机体发生的变化机制,本研究以哈维弧菌(Vibrioharveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为实验组,以磷酸缓冲液(PBS)为对照组,通过荧光定量分析展开对斑节对虾对菌刺激的免疫应答作用。结果显示,斑节对虾的TSG101在各组织中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高。在金黄色葡萄球菌刺激下,斑节对虾的TSG101在肝胰腺中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第12小时的TSG101 mRNA的表达量达到最大(为对照组的21.60倍);在鳃中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第6小时斑节对虾TSG101的表达量达到最大值(为对照组的3.64倍)。在注射哈维弧菌第9小时,肝胰腺中的PmTSG101 mRNA表达量极显著上调(P0.01)且达到最大(为对照组的2.50倍)。实验结果初步表明,斑节TSG101参与斑节对虾的先天免疫反应,在金黄色葡萄球菌和哈维弧菌的刺激的情况下,该基因RNA水平的表达情况发生明显变化。     

泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究

通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。     

日本囊对虾Marsupenaeus japonicus)组织蛋白酶D基因克隆及表达分析

组织蛋白酶D是溶酶体天冬氨酸蛋白酶家族的主要成员,广泛参与动物机体细胞内蛋白质的降解过程,对维持细胞稳态和正常代谢具有重要的作用。为研究组织蛋白酶D在甲壳动物非特异性免疫和幼体发育过程中的作用,本研究采用RACE技术首次克隆得到日本囊对虾组织蛋白酶D基因cDNA序列,命名为MjCatD,其中开放阅读框长为1161 bp,编码386个氨基酸残基。序列分析和同源建模显示该基因编码的蛋白含有保守的N-糖基化位点、天冬氨酸蛋白酶签名序列、酶活化位点和非消化性组织蛋白酶D的特征序列,并且呈保守的双叶形结构。同源性比较和系统进化分析发现,MjCatD与斑节对虾、美洲螯龙虾和脊尾白虾相似性较高,并且与它们紧密聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,MjCatD基因在日本囊对虾多个组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高。在白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)感染后3～24 h日本囊对虾肝胰腺中MjCatD的表达量逐渐下降,而在48 h急剧上调至最高表达量并且与对照组差异极显著(P<0.01)。此外,MjCatD基因在幼体发育不同阶段中也表现出明显的变化趋势。以上研究表明,MjCatD基因可能参与日本囊对虾先天免疫反应和幼体发育过程。     

脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞c DNA文库中的C-型凝集素基因EST序列,采用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因c DNA全长,命名为Ec CTL。该基因全长1285 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸组成的蛋白质,分子量为38.56 k Da,为甘露糖型凝集素。同源性分析表明,脊尾白虾Ec CTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高,达到91%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec CTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达,其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)后6~12 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec CTL的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用,为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。