疑患EMS/AHPNS对虾中检出黄头病毒的一种新株型

对2012—2013年从河北、福建和广东3个对虾养殖场采集的12份发生疑似早期死亡综合征/急性肝胰腺坏死综合征(EMS/AHPNS)的样品,采用组织病理学方法、套式RT-PCR检测方法以及快速灵敏检测试剂盒进行了检测。三地来源的养殖对虾样品症状均表现为肝胰腺颜色变淡,部分出现萎缩,空肠空胃,腹节肌肉略微白浊;组织病理切片结果表明,患病对虾肝胰腺血细胞浸润,肝胰腺盲管上皮细胞脱落,继发性细菌感染,淋巴器官和血淋巴细胞内存在核固缩、破裂和细胞质包涵体。按世界动物卫生组织(OIE)手册的套式RT-PCR方法检测,结果显示,黄头病毒(Yellow head virus,YHV)目的产物的阳性样品检出率为66.7%,该方法对这些样品的灵敏度可能很低。目的产物测序后经NCBI Blast,与已报道的YHV相似性为76.5%—89%;系统发育树显示这3个来源的样品位于同一个分支,与已知的YHV/鳃联病毒(gill-associated virus,GAV)株均不相同,其亲缘关系与YHV较近,而与GAV较远。用新研发的YHV快速高灵敏检测试剂盒检测,结果表明,所有样品均为YHV强阳性。以上表明患AHPNS的养殖对虾中存在一种YHV的新株型的感染,这也是我国首次检测到YHV的感染。     

套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒(WSSV)

解剖患白斑症斑节对虾的鳃组织 ,制备成不同稀释倍数的模板 ,对其进行白斑症病毒 (WSSV)的 PCR扩增 ,结果显示所建立的套式 PCR的灵敏度大约为一步 PCR的 10 4 倍 ;对感染病毒后不同时期的斑节对虾进行 PCR检测 ,发现感染早期经一步 PCR检测为 WSSV阴性的样品 ,套式 PCR的检测结果为阳性 ;对发病虾塘中的几种甲壳类动物进行 PCR检测 ,发现经一步 PCR检测为阴性的长臂虾、秉氏厚蟹和褶痕相手蟹等宿主 ,套式 PCR的检测结果为阳性。表明所建立的 WSSV套式 PCR检测法较普通的一步 PCR有更大的应用价值和意义     

流式细胞术检测对虾白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染

用WSSV粗提液人工感染克氏原螯虾,感染后分别在6,12,18,24 h采血分离血细胞,通过WSSV的混合单抗和FITC标记的羊抗鼠二抗的间接免疫荧光染色,应用流式细胞仪检测病毒对克氏原螯虾血细胞的感染并分析感染强度.结果表明:分离获得的血细胞形态完好,感染后血细胞内的病毒被标记上了绿色荧光;流式检测发现,随感染时间延长,被感染细胞的百分率及平均荧光强度均逐渐升高,反映血细胞的病毒感染程度逐渐加深;PCR检测同时证实人工感染后各采样点血细胞样品均为WSSV阳性.     

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)在双壳贝类中的感染情况研究

采用国际兽医局推荐的传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)检测方法,首次开展IHHNV在双壳贝类(中国蛤蜊、泥蚶、花蛤、缢蛏、文蛤和白蛤)和螺类软体动物(螺蛳、中华圆田螺)中的感染情况。此外,本研究以泥蚶为研究对象,建立了IHHNV在双壳贝类中的实验室感染模型,研究了人工感染泥蚶后IHHNV在其体内的增殖和致病情况。结果显示:在采集的不同种类贝类样品中均检测到IHHNV,其中在泥蚶中的阳性率最高(50%),在文蛤中的阳性率最低(15%),表明IHHNV在双壳贝类中的分布较为广泛,是IHHNV的重要携带物种。在采集的螺类软体动物中均未检测到IHHNV。系统发育分析表明,来自不同贝类中的IHHNV构成了进化树中不同的分支,其中中国蛤蜊、花蛤、白蛤源的IHHNV属于Ⅱ型感染株,而泥蚶、缢蛏、文蛤源的IHHNV单独成簇,形成了一个全新的分支。实验室感染结果显示,IHHNV对泥蚶没有明显的致病性,但可在其体内增殖,在感染后第5天其体内的病毒载量达到最大(1.8×104copies/g),随着感染时间的增加,其体内病毒含量呈现递减趋势,但在感染后第30天体内仍可检测到病毒的存在。本研究结果对对虾养殖尤其是虾贝混养模式中预防和控制IHHNV的传播具有重要意义。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的流行病学调查

传染性皮下和造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是对虾养殖的重要病原之一,可感染多种虾种。罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是中国养殖的重要沼虾品种之一。根据国际兽疫局(Office International des Epizooties,OIE)推荐的IHHNV检测方法,在中国大陆地区首次开展IHHNV在罗氏沼虾中的感染和流行情况调查。结果显示,在研究区的罗氏沼虾养殖区,IHHNV广泛流行,阳性率高达90%;但所有成年罗氏沼虾均未表现出明显的病症,仅表现为病毒的携带。通过基因序列分析显示,检测到的华南地区毒株属于Ⅰ型感染株,与菲律宾株进化关系较为接近;华东地区毒株属于Ⅱ型感染株,与东南亚株进化关系较近。本研究为IHHNV在罗氏沼虾内的感染、流行和防控提供了详细参考。     

一例异育银鲫(Carassius auratus gibelio)暴发性出血病病原分析

2016年6月,江苏某异育银鲫(Carassius auratus gibelio)养殖场暴发一种传染性急性出血病,造成养殖银鲫大量死亡。为分析此次疾病病因及流行规律,本研究从发病养殖场采集患出血病的异育银鲫,从细菌、病毒及寄生虫三个方面对病原进行了分析。采用病原菌分离、组织病理学观察、超薄切片电镜观察、病毒核酸分析、回感实验等对病原进行鉴定。结果显示从发病鲫鱼体内分离到病毒一株,未发现寄生虫及细菌感染。经测序及序列分析,该病毒为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus2,CyHV-2)病毒,组织病理学观察结果显示患病鱼的鳃和肾脏有明显病变,电镜下可观察到病鱼脾脏组织有带囊膜的球形病毒,囊膜直径约为170—200nm,病毒衣壳直径约为110—120nm,核心直径约为60nm,用组织匀浆感染鲫鱼囊胚细胞系(CGB)可稳定地观察到典型的细胞病变,用患病鱼组织匀浆液人工感染异育银鲫的死亡率高达100%,荧光定量PCR检测到该病毒可感染多器官,其中以脾脏中病毒含量最高,其次是脑,肝脏中最少。本研究可为CyHV-2的诊断防控及疫苗研制提供资料。     

聚合酶链反应(PCR)检测花鲈鳗弧菌感染

从海洋鱼类重要病原菌———鳗弧菌基因库中选择金属蛋白酶基因为目标检测基因 ,以此设计一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)检测鳗弧菌的方法 ,并对此方法的灵敏性和特异性进行了研究 ,结果表明该方法对鳗弧菌的检测快速、灵敏。对人工感染鳗弧菌的花鲈组织样品进行检测 ,该方法能识别组织样品中极微量的鳗弧菌。     

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV（AF369029）和IHHNV（NC002190）基因序列，设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNVDNA模板进行多重PCR扩增，结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593bp（WSSV）和356bp（1HHNV）特异性多重PCR扩增条带，而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNVDNA各100pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测，结果230份检出WSSV，阳性率57．5％；96份检出IHHNV，阳性率24％；56份同时检出WSSV和IHHNV，阳性率14％。18份为阴性，阴性率为4．5％。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中，作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定

2018年7月,浙江省某大口黑鲈(Micropterus salmoides)养殖场暴发疑似病毒引起的疾病。现场采样发现,病鱼体长约15—20cm,鱼体于水面下暗游,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究通过采用鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein,MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大口黑鲈中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大口黑鲈虹彩病毒宁波分离株(LMBIV-NB001)。EPC经患病鱼组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的EPC细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,EPC细胞质中存在大量直径约120nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鱼组织样本进行PCR扩增,获得了1029bp的目的基因片段。将该扩增片段连入pMD19-T simple质粒后测序,经BLAST比对分析显示,其与GenBank中已报道的鳜鱼蛙病毒NH-1609、大口黑鲈溃疡综合征病毒BG/TH/CU3、EPC060608-08的MCP基因同源性最高,相似度均达到99.13%。构建系统进化树分析表明,本研究分离的LMBIV-NB001株与NC_038508、GU256635、MG941005等虹彩病毒科蛙病毒属毒株聚成一簇。本论文研究结果为不同地区蛙病毒属成员的起源和分化等相关研究等提供了基础材料。     

PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)中假阴性的探讨

采用PCR、核酸探针斑点杂交、组织切片等方法研究了PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)中的假阴性问题。设计了一对引物用于PCR检测WSSV,PCR扩增的产物长度为235bp,检出极限为0.1pg WSSV DNA。结果表明,PCR检测15例攻毒螯虾鳃样品时出现一例阴性,而经10—106倍稀释后的样品却呈现阳性,推断PCR出现了假阴性。核酸探针斑点杂交及组织切片结果表明注射WSSV的螯虾鳃组织确已被严重感染,进一步证实了PCR假阴性。根据PCR的检出极限及模板稀释梯度,推算出该PCR能成功扩增的引物与模板浓度的比例范围约为2.4×105—2.4×1010。     

用逆转录聚合酶链式反应检测草鱼出血病病毒的研究

于1994年5月-1995年7月，根据已克隆的草鱼出血病病毒GCHV-861株cDNA的部分序列，设计合成了两对PCR引物，采用RT-PCR技术对GCHV-861及GCHV-873两病毒株的dsRNA进行扩增。结果表明，两对引物仅能特异地检测出GCHV-861病毒株核酸的存在，而不能对GCHV-873病毒株的核酸进行特异扩增，该方法最小可检测出0.1Pg纯化的GCHV-861病毒dsRNA;采用该方法对GCHV-861人工感染的草鱼和稀有鲫组织进行RT-PCR检测，不仅能检测到发病期显症病鱼中GCHV-861病毒的存在，还能检测发病前期及愈后无出血病症状的病毒携带者中病毒的存在;利用该方法还从本所关桥实验场出血病流行季节收集的发病草鱼体内检测出GCHV的存在，说明所设计的引物具有一定的实际意义;利用该法还能检测出感染病毒的组织培养细胞系GCK和CIK上清液中GCHV的存在。还建立了简易的模板制备方法，采用该方法整个检测过程只需3-4h，可大大缩短检测时间。由此可见，RT-PCR技术是检测GCHV的快速、灵敏而特异的方法，发展和完善该技术对草鱼出血病的早期诊断和防治、抗病育种具有重要意义。     

厦门海水养殖鱼类两种单殖吸虫感染新记录及流行情况

近几年，在福建厦门西海域网箱养殖的高体Shi鱼锶部大量发现自然感染的日本轭联虫（Zeuxapta japonica),鱼群自然感染率达40．32％（25／62），病鱼死亡率10％－20％，此病还有进一步扩散的趋势。同一渔区的其它养殖鱼种未见自然感染本虫。在同安渔区的养殖石斑鱼发现自然感染另一种单殖吸虫，经鉴定为石斑拟合片虫（Pseudorhabdosynochus epinepheli)，鱼群自然感染率达100％（10／10），在该养殖渔区已引起患病石斑鱼大量死亡。     

洞庭青鲫(Carassius auratus var.Dongtingking)与三个鲫品系群体遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,对洞庭青鲫(Carassius auratus var.Dongtingking)、野生二倍体和三倍体鲫(C.auratus)、彭泽鲫(C.auratus var.Pengze)4个鲫品系群体共120个个体的遗传多样性进行分析。9个ISSR引物在四个鲫品系群体中共获得1637个扩增位点,其中多态位点1572个,多态位点比例为96.03%。4个鲫品系群体内的多态位点比例分别为46.14%、65.40%、73.76%和51.94%,遗传距离分别为0.0905、0.1186、0.1351和0.1056。在4个鲫品系群体之间,洞庭青鲫与彭泽鲫的遗传距离最小(0.1191),二倍体鲫和三倍体鲫的遗传距离次之(0.1336),而洞庭青鲫、彭泽鲫与二倍体鲫的遗传距离(分别为0.1377、0.1367)略小于它们与三倍体鲫的遗传距离(均为0.1378)。UPGMA聚类结果为洞庭青鲫与彭泽鲫聚成一个分支,二倍体鲫与三倍体鲫聚成另一个分支。结果表明,洞庭青鲫、彭泽鲫等养殖群体内的遗传多样性明显低于野生鲫群体;四个鲫品系中,洞庭青鲫与彭泽鲫的亲缘关系较近,二倍体鲫与三倍体鲫的亲缘关系较近,推测洞庭青鲫、彭泽鲫、三倍体鲫均起源于二倍体鲫。二倍体洞庭青鲫和二倍体野生鲫资源的保护必须引起重视。     

草鱼出血病病毒株的筛选

为筛选适用草鱼出血病细胞疫苗工厂化生产的病毒株，于１９８７－１９８９年，在浙江湖州地区采集了１２个具典型草鱼出血病症状的病鱼材料，通过比较它们的毒力，对细胞的适应性，免疫原性，研究病毒在细胞内的增殖动态，细胞病变特征，毒株保存。结果表明，筛选出的ＺＶ－８８０２和ＺＶ－８９０９两毒株，其毒力高，免疫原性强，并能在细胞中大量增殖。应用这两株毒株制备的细胞疫苗，其免疫保护率在８５％以上。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病二价细胞灭活疫苗体液免疫效果及免疫保护率评价研究

草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(GCRV)引起的草鱼养殖业一种严重的病毒性出血病,给草鱼养殖产业造成重大损失。该病毒是一种双链分节段RNA病毒,根据GCRV多个病毒分离株基因序列分析及临床发病特点,共有三种基因型GCRV,其中基因Ⅰ型和Ⅱ型较为流行。通过细胞分离培养基因Ⅰ型(GCRV-ZV8909)和Ⅱ型(GCRV-HZ13) GCRV,研制出草鱼出血病二价细胞灭活疫苗,通过绝对定量的方法,测定基因Ⅰ型和Ⅱ型的病毒含量分别为2.0×10⁹及1.5×10⁶ copies/mL。用生理盐水将其分别进行50倍稀释和100倍稀释,包括原液及生理盐水对照共4组,分别腹腔注射免疫(20±5)g健康草鱼,剂量均为0.2mL/尾,每组40尾,各组于免疫后3、5、7、14、21、28、42、56、70、84 d分别取3尾采集血液制备血清。分别利用经原核表达并纯化制备两种基因型GCRV的VP7蛋白以及实验室保存的草鱼IgM单抗,建立了三抗体夹心酶联免疫方法(TAS-ELISA)分析评价疫苗体液免疫效果。结果表明,草鱼经腹腔注射不同剂量的细胞灭活疫苗后,与对照组相比,各免疫组血清抗体均有不同程度的提高,且原液组与50倍稀释组基本持平,但都高于100倍稀释组,各免疫组在免疫后5d即可检测到两种基因型GCRV抗体,且抗体水平持续到84d,但两种基因型抗体水平达到高峰的时间不一致,抗基因Ⅰ型GCRV抗体达到高峰是在28d,抗基因Ⅱ型GCRV抗体是在14d达到高峰。两种基因型抗体水平达到高峰时的血清效价分别为1︰800、1︰600。免疫保护率实验结果表明,原液组保护率最高,为67%,50倍稀释组为60%,100倍稀释组只有33%。     

千岛湖水华发生与主要环境因子的相关性分析

藻类水华的发生通常被认为是水体富营养化的结果或表征。然而这种对水华发生机制的经典理解却不能很好地解释千岛湖在营养盐较高时没有发生水华而在较低时却发生了水华的现实。通过对千岛湖发生水华前后与其相关的主要生态因子所做的调查和分析结果表明,千岛湖发生大面积水华时的水体营养盐(TN和TP)含量、水位和银鱼生物量等指标均没有与水体历年(1993～1997年)未发生水华时的相应指标存在显著差异(P>0.05);同时也有证据表明,水体浮游动物密度在水华发生前后出现显著差异的可能性很小,且水体也仍处于中营养程度。只有鲢鳙生物量在发生水华时显著小于没有发生水华时的历年生物量平均值。此外,温度也常被认为是诱发水华暴发的一个重要环境因素,但分析认为,水温是周期性变动因子,千岛湖历年的水温并没有显示1998和1999年有任何异常。综合上述分析后认为,千岛湖1998、1999年大面积水华的发生,可能与水体中鲢鳙生物量的显著减少有密切关系。但银鱼的大量存在,遏制了浮游动物的数量,使低鲢鳙生物量和低浮游生物量同时出现成为可能,从而也可能成为导致水华发生的原因之一。     

逆转录聚合酶链式反应中dsRNA模板的快速制备

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草鱼出血病病毒。建立了一种快速、简易而可靠的ｄｓＲＮＡ模板的制备方法。应用该方法制备模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，可以有效地检测出病鱼组织及病毒感染的培养细胞裂解液中的草鱼出血病病毒，且全过程只需３～４ｈ，大大缩短了检测时间     

山东省大、中型水库鲢、鳙的生长与环境条件的关系

根据1989年的调查资料,研究了山东省20座大、中型水库鲢、鳙的生长与环境条件的关系。将进水量、集雨区土壤肥力、总氮、总磷、硬度、电导率、化学耗氧量、浮游植物生物量、浮游动物生物量等9项标志水域鱼产力的环境条件,分成基础条件(指前二项)、化学条件和生物条件三个层次分别考查其与鲢、鳙的生长关系。提出的这三个层次都对生长有显著影响,达到或接近于强相关。通过逐步回归得出的复回归模式则更表明生长与这些条件的相关高度显著。指出在像当前山东省大多数水库这样,鱼的密度显著小的情况下,鱼的生长情况可以作为概略评价水域鱼产力的一个相对指标。