对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒编码蛋白的相互作用研究

采用Matchmaker酵母双杂交系统,将对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infection hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)编码蛋白NS1、NS2和CP序列分别构建到酵母猎物载体p GADT7和诱饵载体p GBKT7上,分别转化至酵母AH109以检测重组猎物载体和诱饵载体的自激活作用及对宿主的毒性作用,发现无自激活作用和毒性作用,随后将重组猎物载体和诱饵载体两两共转至酵母AH109中,涂布于SD/-Leu/-Trp固体培养基上,再点种至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal固体培养基以鉴定编码蛋白间的相互作用。表型鉴定结果显示,只有共转化有p GADT7-CP/p GBKT7-CP的酵母重组子能够在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上生长并显蓝,而其它重组子均不能在其上生长,表明病毒的CP能够自身互作,而其他编码蛋白间无相互作用。为了进一步研究病毒CP自身互作的作用位点,分别从CP的N端和C端截短若干个氨基酸序列,结果发现CP的自身互作是高度敏感的,任何较少氨基酸序列的缺失都将导致其自身互作的丧失。本研究为深入探讨病毒的组装机制和致病机理奠定了理论基础。     

Taqman-MGB探针荧光定量PCR方法检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的研究

本文根据GenBank中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)基因组上的保守序列,采用Taqman-MGB荧光定量PCR方法,设计了一组特异性引物和探针.利用阳性标准模板进行了定量PCR条件的优化研究.结果显示,在101～108拷贝范围内标准曲线的线性关系为R=0.999 4,检测灵敏度达到10拷贝,重复检测的变异系数均小于2％.利用上述建立的方法和条件,测定39份不同来源的对虾样品中IHHNV,检出率为49％.因此所建立的荧光定量PCR具有较高的灵敏度、特异性和重复性,可作为IHHNV快速的定量检测方法.     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(福建株)基因组的克隆

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一.目前,GenBank已收录了分离自夏威夷、加利福尼亚、泰国、中国台湾等地的IHHNV全长或部分基因组序列.虽然中国大陆在养殖对虾中也普遍检测到了IHHNV,但未见其基因组序列报道.本文首先利用DNA末端加尾和嵌套PCR克隆了IHHNV基因组两末端序列,并根据测定的末端序列设计引物,PCR扩增出中国福建株IHHNV基因组序列.     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的流行病学调查

传染性皮下和造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是对虾养殖的重要病原之一,可感染多种虾种。罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是中国养殖的重要沼虾品种之一。根据国际兽疫局(Office International des Epizooties,OIE)推荐的IHHNV检测方法,在中国大陆地区首次开展IHHNV在罗氏沼虾中的感染和流行情况调查。结果显示,在研究区的罗氏沼虾养殖区,IHHNV广泛流行,阳性率高达90%;但所有成年罗氏沼虾均未表现出明显的病症,仅表现为病毒的携带。通过基因序列分析显示,检测到的华南地区毒株属于Ⅰ型感染株,与菲律宾株进化关系较为接近;华东地区毒株属于Ⅱ型感染株,与东南亚株进化关系较近。本研究为IHHNV在罗氏沼虾内的感染、流行和防控提供了详细参考。     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白基因的克隆表达及抗体制备

本文根据GenBank登录的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的全基因组序列(NC-002190),设计出主要结构蛋白基因的相应引物,从厦门发病的对虾中,提取DNA,以此为模板,利用PCR扩增目的基因.再将目的基因分别与pGEX-6p1载体和pET-28a载体连接,构建重组表达载体pGEX-Ⅳ、pET-Ⅳ,重组子经酶切和测序鉴定后导入表达型大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,大小约为62KDa和41KDa,与预测大小一致.将pET-Ⅳ表达重组蛋白经纯化,免疫小鼠,Western免疫印迹反应结果表明其抗体均可与pGEX-Ⅳ和pET-Ⅳ表达的蛋白发生特异性反应.本研究的结果为对虾IHHNV的快速检测及其免疫提供了研究基础.     

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV（AF369029）和IHHNV（NC002190）基因序列，设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNVDNA模板进行多重PCR扩增，结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593bp（WSSV）和356bp（1HHNV）特异性多重PCR扩增条带，而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNVDNA各100pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测，结果230份检出WSSV，阳性率57．5％；96份检出IHHNV，阳性率24％；56份同时检出WSSV和IHHNV，阳性率14％。18份为阴性，阴性率为4．5％。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中，作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

对虾病毒IHHNV衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心ELISA的高效检测

通过利用分子生物学手段克隆IHHNV衣壳蛋白基因并构建原核表达载体,筛选抗原特性好的多肽免疫兔以制备高效的特异性IHHNV多克隆抗体,最终建立高效的检测对虾IHHNV的新型双抗夹心ELISA方法.实验结果表明该方法成功表达了对虾病毒IHHNV衣壳蛋白基因的抗原多肽,并制备出了高灵敏性的多克隆抗体.将抗原多肽及多克隆抗体用于ELISA的检测,抗体的效价在1∶12 800以上,最低可检测到1 pg的抗原蛋白,表明已成功建立高效的双抗夹心ELISA方法,对于对虾的海水养殖及IHHNV病毒性疾病的防控具有重要的参考价值.     

双壳贝类CK1基因家族的鉴定及表达分析

酪蛋白激酶1 (CK1)是一种重要的蛋白激酶家族,其在DNA损伤应答和修复、细胞增殖和凋亡、胚胎发育和稳态等重要的生物学过程中都具有复杂多样的调控作用。为了理解CK1基因家族在双壳贝类中的特征、进化及生物学功能,实验采用比较基因组学及生物信息学的方法对双壳贝类CK1基因家族进行了鉴定分析,通过虾夷扇贝高温应激实验,研究了CK1基因家族在高温应激时的表达规律。结果显示,在虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎与侏儒蛤中均存在CK1α,CK1αlike,CK1δ,CK1γ3,并发现CK1ε,CK1γ1,CK1γ2在双壳贝类中发生了丢失。时空表达分析发现,双壳贝类CK1基因均在胚胎发育早期集中表达,并以多细胞/囊胚期为界呈现出母源/合子特异性表达模式。CK1为关键基因的基因共表达模块显著富集在错配修复、核苷酸剪切修复等相关通路上,暗示了CK1基因在双壳贝类胚胎发育过程中参与调控DNA损伤修复过程,从而维持早期胚胎发育时的基因组稳定性。双壳贝类CK1基因在成体中呈现组织特异的表达模式,主要在鳃和雄性性腺中具有相对较高的表达量。虾夷扇贝受到高温应激后,其鳃中PyCK1α, PyCK1αlike和PyCK1δ...     

一种低密度脂蛋白受体相关蛋白在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗弧菌感染中的功能研究

低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)是一类细胞表面蛋白,属于一种内吞性受体,其在调节脊椎动物血脂平衡中的作用已被广泛报道。前期在凡纳滨对虾弧菌抗性家系和敏感家系的比较转录组分析中发现一种低密度脂蛋白受体相关蛋白基因的转录表达存在明显差异,为明确该基因在对虾抗弧菌感染中的作用,我们对该基因进行了全长cDNA克隆、表达特征分析和功能的初步研究。该基因在凡纳滨对虾中存在两个转录本,分别命名为LvLRP1-1和LvLRP1-2。LvLRP1-1的cDNA序列全长为916bp,编码226个氨基酸;LvLRP1-2的cDNA全长为787bp,编码183个氨基酸。两个转录本的cDNA序列高度一致,唯一的差别在于LvLRP1-1的cDNA比LvLRP1-2多129 bp,多编码43个氨基酸。组织表达分析显示LvLRP1-1在对虾的眼柄、表皮、脑和心脏中高表达,而LvLRP1-2仅在眼柄和表皮中呈现高表达。在副溶血弧菌感染对虾后, LvLRP1-1和LvLRP1-2的转录表达变化趋势一致,均在感染后3h其转录水平明显升高,6h之后又恢复到正常水平。利用双链RNA技术对LvLRP1-1和LvLRP1-2同时...     

基于SPE与SPATT的水体中麻痹性贝类毒素检测方法构建与应用

为实现麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)的实时监控与提前预警,本研究构建了基于固相萃取技术(solid phase extraction,SPE)与固相吸附毒素跟踪技术(solid phase adsorption toxin tracking,SPATT)的水体中PSP检测方法,重点优化了吸附材料及前处理方法,评价了回收率、检出限等指标,并将方法应用于2019年春季秦皇岛山海关海域PSP消长过程的监测中,比较评估了两种方法的监控预警效果。结果表明:SPE方法选用ENVI-Carb 500mg/6mL固相萃取柱,过样体积为50mL,13种PSP组分的平均回收率为82.2%±10.0%、检出限为4.0-20.0ng/L;SPATT方法选用SP207大孔吸附树脂,洗脱时间为静置Id最佳,整体回收率约为9.2%;在实际应用中,结合产毒藻密度及贻贝富集毒素含量的变化,发现SPE方法的检测结果可实时表征海域PSP风险状况,对于贻贝中PSP的预警效果也显著优于SAPTT方法,后者不仅因监控方式相对滞后一个监测周期,且灵敏度及准确性均较差。对于秦皇岛...     

液相色谱-四极杆/线性离子阱复合质谱测定双壳贝类中麻痹性贝类毒素

采用液相色谱-四极杆/线性离子阱复合质谱,建立了双壳贝类中13种麻痹性贝类毒素的定性确证和定量分析方法。样品经乙酸水溶液提取,石墨化碳黑固相萃取净化,亲水性液相色谱柱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)分离;质谱采集使用独有的多反应监测-信息依赖性采集-增强子离子扫描模式。13种目标物线性范围相关系数不低于0.99,检出限为62.0μg STX eq/kg,其中石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、新石房蛤毒素(Neosaxitoxin,NEO)、脱氨甲酰基石房蛤毒素(Decarbamoylsaxitoxin,dc STX)、脱氨甲酰基新石房蛤毒素(Decarbaoylneosaxitoxin,dc NEO)以及N-磺酰氨甲酰基类毒素5(Gonyautoxin-5,GTX5)为10.0μg/kg,膝沟藻毒素12(Gonyautxins-1-2,GTX12)为12.0μg/kg,膝沟藻毒素34(Gonyautxins-3-4,GTX34)、N-磺酰氨甲酰基类毒素2(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin-2,C2)和脱氨甲酰基膝沟藻毒素3(Decarbamoylgonyautoxins-3,dc GTX3)为4μg/kg,N-磺酰氨甲酰基类毒素1(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin~(-1),C1)和脱氨甲酰基膝沟藻毒2(Decarbamoylgonyautoxins-2,dc GTX2)为13μg/kg。基质加标平均回收率为(79.6±10.4)%—(98.8±6.54)%。该方法能够有效降低贝类基质抑制效应,简化前处理过程并通过减少样品稀释倍数来显著提高方法灵敏度,使同分异构体达到基线分离,适用于双壳贝类中麻痹性贝类毒素的监控分析。     

长松藻ITS序列特征及其系统进化分析

采用PCR扩增的方法获得了第一个松藻目物种长松藻(Codium cylindricum)的ITS序列,长松藻ITS全长515bp,其中ITS1的长度为74bp,5.8S序列长163bp,ITS2的长度为278bp.与已知的绿藻门其它5个目8个属物种的ITS序列的系统发育分析结果表明,绿藻门物种分为三大支,其中团藻目藻类为一支,松藻目和刚毛藻目藻类为一支,石莼目、顶管藻目和丝藻目藻类构成一大支;长松藻与刚毛藻目的刚毛藻属和硬毛藻属物种同为多核藻体,在系统发生上表现出更近的亲缘关系;不同绿藻目海藻的聚类关系表明,其能够准确地反映出其在单核与多核、单细胞与多细胞等生物结构特性方面的差异与水平.     

双壳类软体动物精子发生及其在系统演化研究中的应用前景

综述了双壳类软体动物精子发生及精子形态结构方面的研究进展，指出双壳类软体动物精子发生过程中精细胞分化具有种、属特异性，精细胞分化的细节是区别个体外部形态很近的物种的依据；精子的形态结构具有种的特征，精子结构的比较研究将成为双壳类软体动物系统演化研究的重要方法之一。     

13C示踪技术在利玛原甲藻中腹泻性贝毒合成研究的应用

选取具有显著产毒差异的利玛原甲藻(Prorocentrum lima) SHG株与2XS株为研究对象,以2-¹³C-甘氨酸为示踪原料结合高分辨质谱方法,为腹泻性贝类毒素及其酯化态毒素合成与代谢途径的研究提供新方法和思路。结果表明,两株藻共发现16种腹泻性贝毒及其酯化态毒素成分。对照培养条件下SHG株(大田软海绵酸毒素含量为7.88 pg/cell,鳍藻毒素1含量为4.35 pg/cell)的产毒能力高于2XS株(大田软海绵酸毒素5.70pg/cell),而甘氨酸作为氮源培养条件可显著提高两株藻的产毒总量(P<0.05)。¹³C-甘氨酸标记组与甘氨酸培养组单细胞产毒量无显著变化(P>0.05)。腹泻性贝毒被标记后其同位素异构体丰度发生变化,其中酯化态受¹³C标记的影响程度更高,二级质谱图清晰表示出其碎片离子及脱水峰的标记情况。该方法直观阐明了甘氨酸可作为P. lima标记原料的产毒供体,并使用稳定同位素标记方法首次实现了酯化态的同步标记,有助于腹泻性贝毒生成机制的进一步研究。     

离子色谱分析在黄土和粉尘研究中的应用

黄土中存在着大量的碱金属及碱土金属，以往的测试方法多为原子吸收和ICP—MS，离子色谱法在测试黄土样品的碱金属和碱土金属元素含量中应用不多。将黄土地质标准样品进行消解后用离子色谱进行测试，测试效果良好，重复测试的相对标准偏差小于5％，与推荐值的相对误差小于5％，准确度和精密度符舍相关的质量控制要求。本实验方法测试的离子含量都在仪器响应呈线性的最佳测试范围之内，标准曲线经回归后相关系数均达到0．9999。黄土样品的分析结果与粉尘气溶胶样品的离子分析结果对比表明，此方法对于探讨粉尘起源以及沙尘暴天气的研究具有重要意义。     

蒙特卡罗法在天然气水合物资源量计算中的应用

天然气水合物甲烷资源量的估算是天然气水合物研究中的热点问题。运用体积法计算含水合物沉积物中的甲烷资源量时,存在参数赋值不确定的问题,从而影响了计算结果的可信度。采用蒙特卡罗法,通过计算样本的频率可以较好地评价和描述计算结果的信度,弥补体积法的不足。对采用蒙特卡罗法估算甲烷资源量的原理进行了分析和探讨,并以麦肯齐三角洲和南海海域水合物为例,计算了水合物赋存区的甲烷资源量。     

正交设计和方差分析应用于悬浮物和沉积物的EDAX分析条件试验

本文用正交试验和方差分析对悬浮物和沉积物粉末样品的EDAX分析进行了条件试验和数据处理,找出影响试验结果的主要因素和最佳分析条件,提高了分析结果的准确性。