深圳红树林沉积物可培养细菌多样性及其生物活性筛选

【目的】研究广东深圳红树林沉积物可培养细菌多样性,筛选潜在生物活性菌株及水产病原菌拮抗菌。【方法】采用稀释涂布法分离纯化深圳红树林沉积物中可培养细菌,基于16S rRNA序列分析细菌物种多样性,通过PCR扩增聚酮合酶基因、非核糖体肽合成酶基因检测菌株产次级代谢产物潜力,并采用点种法筛选水产病原菌拮抗菌。【结果】获得177株细菌,隶属于4门20属27种,芽孢杆菌属（Bacillus）是优势菌属,6株细菌为潜在新物种,55株细菌的基因组DNA扩增出至少1种生物合成基因,其中有7株细菌对水产病原菌有拮抗活性。【结论】深圳红树林沉积物可培养细菌资源丰富,有应用于活性次级代谢产物发掘和水产病害绿色防控的巨大潜力。     

海洋土曲霉C23-3与不同类型海洋微生物共培养对其次生代谢产物的影响

【目的】研究海洋土曲霉C23-3与不同类型海洋微生物共培养对其次生代谢产物的影响,挖掘土曲霉菌株C23-3的次生代谢潜力。【方法】将副溶血弧菌、枯草芽孢杆菌和胶红酵母的活菌或灭活菌体分别以不同时间与土曲霉C23-3共培养;采用DPPH自由基清除法和Ellman法分别评价各提取物的抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性,采用滤纸片法比较各提取物的抗菌活性,采用HPLC指纹图谱分析各提取物化学成分的差异。【结果与结论】发现不同类型的微生物与土曲霉共培养均可激活一些原本沉默的活性次级代谢产物;菌株及共培养物的化学拮抗能力、HPLC指纹图谱中的特征代谢产物变化揭示在活菌培养体系中土曲霉占竞争优势;而且灭活菌体中可能存在某些信号物质,在12 d时对土曲霉群体自感应信号分子丁内酯-I的产生具有比活菌更强的刺激作用。研究结果为深入挖掘海洋真菌代谢潜力及抗老年痴呆等活性先导化合物的发现提供基础。     

一株分离自红树林沙雷氏菌的鉴定及杀虫活性测定

【目的】为开发用于害虫生物防治的细菌杀虫剂,对分离自红树林的一株沙雷氏菌进行鉴定并初步测试其杀虫活性。【方法】采用形态特征比较、细菌理化特性测定和基于16S rDNA序列构建系统发育树对从湛江红树林根际分离的菌株ZJ9进行综合鉴定,采用喂毒法和注射法进行杀虫活性测定。【结果】该菌为黏质沙雷氏菌Serratia marcescens,对草地贪夜蛾3龄幼虫7d校正死亡率为80.21%,且与苏云金芽孢杆菌和隐地杆菌无显著差异,菌体及菌液对大蜡螟老熟幼虫血腔注射24 h死亡率均达100%。【结论】菌株ZJ9为黏质沙雷氏菌,对草地贪夜蛾具有很好杀虫活性,可用作害虫的生物防治资源。     

海南红树林内生真菌Endomelanconiopsis endophytica次级代谢产物及其体外生物活性

【目的】研究源自海南红树林植物角果木(Ceriops tagal)内生真菌Endomelanconiopsis endophytica的次级代谢产物及其体外生物活性。【方法】利用正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱等色谱分离方法,对该菌发酵产物的乙酸乙酯浸膏的次级代谢产物进行分离纯化;综合利用核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)等波谱学技术以及与文献数据比对,鉴定化合物的结构;并对化合物进行体外细胞毒活性和免疫抑制活性评价。【结果】从内生真菌Endomelanconiopsis endophytica中分离得到9个化合物,其结构分别鉴定为(4E,8E)-2-N-(2-hydroxypalmitoyl)-1-O-(β-D-glucopyranosyl)-9-methyl-4,8-sphingadienine(Ⅰ)、2-(1-hydroxyethyl)quinazolin-4(3H)-one(Ⅱ)、uridine(Ⅲ)、citreoisocoumarinol(Ⅳ)、5-hydroxymellein(Ⅴ)、roccellatol(Ⅵ)、...     

化学诱导对2株海洋真菌次级代谢产物及其生物活性的影响

【目的】以2株海洋真菌为研究对象,探究不同种类及浓度的化学表观遗传修饰剂对其次级代谢产物化学多样性和生物活性的影响。【方法】基于化学表观遗传修饰策略,采用两种不同的化学表观遗传修饰剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azaC)和丁酸钠,分别对Penicillium sp.019和Aspergillus terreus ZN4-5-4两株海洋来源真菌进行表观遗传修饰。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化,并根据薄层层析(TLC)指纹图谱、高效液相色谱(HPLC)图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段,从中筛选出代谢产物丰富、AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富且毒性小的发酵培养条件。【结果】添加1 mmol/mL的丁酸钠诱导剂可使菌株019和ZN4-5-4的次生代谢产物的种类增加,且同时能提高该菌株次级代谢产物的AChE的抑制活性和DPPH自由基清除活性。因此,确定菌株019和ZN4-5-4的最优发酵条件均是添加浓度为1 mmol/mL丁酸钠的PDB培养基。【结论】化学表观遗传修饰策略指导下,添加诱导剂5-azaC或者丁酸钠对2株海洋真菌次生代谢产物的产生有影响。     

镇江长江豚类省级自然保护区鱼类多样性及年际变化

【目的】调查了解镇江豚类保护区鱼类资源状况,丰富鱼类资源本底数据。【方法】于2013、2016和2019年,分别开展3次渔业资源调查,对该区域鱼类种类组成、优势种、体型大小及群落多样性进行统计分析。【结果】共记录鱼类68种属于7目13科47属;鲤形目(Cypriniformes)鱼类种类占比较为稳定,鲇形目(Siluriformes)鱼类资源量有下降趋势,鲈形目(Siluriformes)鱼类种类占比上升明显;不同年份优势种替代较为明显;2016年的物种丰富度指数和多样性指数最高,分别为6.528、3.026。【结论】保护区鱼类资源较为丰富,但不同年份鱼类群落变化较为明显,渔业资源面临小型化趋势。     

海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的分离及多样性分析

【目的】分析海洋动物肠道中抗氧化活性乳酸菌的多样性,并对活性菌株胞外与胞内代谢物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力进行测定。【方法】采用溶钙圈分离培养技术和DPPH自由基清除法,从湛江海域6种海洋动物肠道中分离活性乳酸;通过构建16S rDNA基因序列系统发育树,分析其多样性;利用DPPH自由基清除法,测定其抗氧化活性。【结果】共分离得到16株抗氧化活性乳酸菌,分属于细菌域厚壁菌门(Firmicutes)的4个科(Leuconostocaceae,Streptococcaceae,Lactobacillaceae,Enterococcaceae)、6个属(Weissella,Pediococcus,Leuconostoc,Lactococcus,Lactobacillus,Enterococcus),其中除菌株zy-3、LY-87、ZH-54的16S r DNA基因序列与数据库EzBioCloud中的模式菌相似性100%外,其余13株活性菌株与模式菌存在一定的遗传差异(97.42%～99.93%),菌株zy-I与模式菌株Weissella cibaria(KACC11862T)的相似性仅为97.42%,推测为Weissella cibaria属中的潜在新种;16株活性菌株胞外代谢物对DPPH的抗氧化活性均大于胞内代谢物,且5株乳酸菌株(zy-4、zy-s6、YM-49、ZH-53、ZH-54)的胞外的DPPH清除能力均在45%以上,高于其它11株菌株。【结论】湛江海域动物肠道中存在较为丰富的抗氧化活性乳酸菌,并蕴藏潜在乳酸菌新种。     

健康和发病凡纳滨对虾糠虾期育苗池水体的菌群结构比较

【目的】揭示凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)糠虾期健康和发病育苗池水体菌群结构差异。【方法】从健康和发病育苗池各采集3份水样,提取水样基因组DNA,利用Illumina Mi Seq测序技术对其进行16S高通量测序,分析菌群结构组成与多样性,并筛选指示健康状态的水体菌群。【结果】健康苗池水体菌群多样性和均匀度均显著高于发病苗池(P0.05)。健康苗池中放线菌门(Actinobacteria)及其微杆菌科(Microbacteriaceae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)及其圆杆菌科(Cyclobacteriaceae)和黄杆菌科(Flavobacteriacea)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)及其丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、庞微菌门(Verrucomicrobia)及其分类未定科(OTU9),均优势存在,且序列丰度显著高于发病池(P0.01);相反,发病池中α-变形菌纲(α-Proteobacteria)及其红杆菌科(Rhodobacteraceae)和Stappia_f科、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)及其交替单胞菌科(Alteromonadaceae)丰度均显著高于健康池(P0.01)。属水平上,发病池红杆菌科4个分类未定属(OTU1、OTU6、OTU64、OTU123)、亚硫酸杆菌属(Sulfitobacter),以及交替单胞菌科交替单胞菌属(Alteromonas)丰度均显著高于健康池(P0.01),而微杆菌科Limnoluna与Rhodoluna属和红杆菌科一个分类未定属(OTU4)丰度均显著低于健康池(P0.01)。【结论】健康和发病糠虾期育苗池水体菌群结构和多样性存在显著差异,属水平上丰度差异显著的优势菌群可作为苗池健康状态指示菌群。     

基于PCR和TOF-MS海洋源产脂肽芽孢杆菌筛选

【目的】准确高效分离红树林等海洋环境中产脂肽芽孢杆菌。【方法】将前期从红树林环境筛出具有抗菌活性的12株芽孢菌株作为研究菌株,采用溶血活性及排油作用对其中的可能产脂肽菌株进行初步筛选,并基于脂肽合成酶基因PCR扩增法对脂肽合成酶基因携带菌复筛,采用飞行时间质谱(TOF-MS)对所产脂肽进行鉴定。【结果】初步发现6株芽孢杆菌具有溶血活性,其中HY-5、HY-4和HN-9这3株具有排油能力,油层透明圈的直径分别为45、32和3 mm。PCR扩增检测到HY-5含有iturin、surfactin和bacillomycin D合成酶基因,HY-4含有iturin、surfactin合成酶基因,HN-9含有iturin合成酶基因。TOF-MS检测到HY-5和HY-4的发酵液含surfactin、iturin和bacillomycin 3种脂肽,HN-9的发酵液只含iturin。【结论】基于PCR与TOF-MS为核心的级联技术,建立一种海洋源脂肽产生菌快速筛选以及脂肽谱快速鉴定的方法,解决海洋源芽孢杆菌在常规培养基难合成脂肽造成的漏筛情况。     

盐酸普鲁卡因诱导下海洋真菌Hypocrea lixii次级代谢化学成分

【目的】通过化学诱导方法从一株海洋真菌Hypocrea lixii中获得多样化的活性小分子化合物。【方法】对菌株在盐酸普鲁卡因的化学诱导作用下进行固体发酵,代谢产物采用硅胶减压柱层析、Sephadex LH-20以及pHPLC等手段分离纯化,对化合物运用NMR、MS等波谱学技术并比对文献进行结构鉴定,采用Ellman比色法及DPPH自由基清除法对化合物进行初步抗乙酰胆碱酯酶(AChE)和抗氧化活性测试。【结果】从海洋真菌Hypocrea lixii在盐酸普鲁卡因诱导下的发酵提取物中分离得到4个异黄酮类化合物,包括6'-O-crotonylgenistin(1)、Genistein(2)、Daidzein(3)和Genistin(4),以及对氨基苯甲酸甲酯(5)、对羟基苯丙酸(6)和胞嘧啶(7),其中化合物1和6为该种中首次报道,化合物5为生物转化来源首次报道,化合物2~4可能源自培养基。在100μmol/L剂量浓度下,化合物1~4对AChE的抑制以及DPPH自由基的清除活性均较弱,化合物5和6显示了相对强的AChE抑制活性,抑制率分别为40%和38%。【结论】盐酸普鲁卡因对该菌次级代谢产生了显著的影响,为深入研究该菌株化学诱导次级代谢产物提供基础。     

海洋聚球藻多样性及时空分布特征研究进展

【目的】建立对海洋聚球藻多样性及生物地理分布的系统认识,为海洋聚球藻的生态演替及功能研究提供理论参考。【方法】综述了海洋聚球藻的生态多样性、遗传多样性、空间分布特征及季节演替特征。【结果】海洋聚球藻各亚型呈现出一定的时空变化规律,其主要影响因素有营养盐、海流及光强等。【结论】在环境要素对聚球藻的影响及机理、各类群间相互作用及海洋动力过程对聚球藻的影响及机理等方面还需进一步加强研究。     

基于OSMAC策略的3株海洋真菌发酵条件筛选与优化

【目的】筛选可促进海洋真菌产生代谢产物更丰富的发酵条件,进一步挖掘菌株在抗阿尔茨海默症方面的潜力。【方法】基于OSMAC策略,分别选用马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基、察氏培养基、大米培养基和葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(GPY)培养基,并设置3种盐度(3、30和100),对Talaromyces sp. 001、Penicillium sp. 019和Aspergillus terreus ZN4-5-4等3株海洋真菌进行小规模发酵培养。通过观察真菌在培养基中的生长状态变化,并根据TLC指纹图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和卤虫致死活性筛选模型等技术手段筛选出代谢产物丰富、毒性小且AChE抑制活性与抗氧化活性产物丰富的发酵培养条件。【结果】菌株001的最优发酵条件是盐度3的GPY培养基,菌株019的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基,菌株ZN4-5-4的最优发酵条件是盐度3的PDB培养基。【结论】OSMAC策略指导下,改变培养基条件对菌株产生次生代谢产物有显著影响。     

雷州半岛红树林海区的鱼类种类调查

对雷州半岛8个红树林分布区设站位进行了生物多样性调查,其中获得鱼类127种,分别隶属于15目58科100属。以鲈形目最多,共27科49属65种,占51.2％。种类出现最多的科为(鱼叚)虎鱼科。采获种类最多的站位为北潭。各站位之间鱼类种类具有一定的差异性。调查获得的鱼类体型偏小,大部分种类具有食用价值,其中16种已为人工增养殖的对象。     

海州湾海洋牧场拖网渔获物营养级分析

【目的】分析与对比2014/2018年海州湾同种生物的营养级特征。【方法】根据2018年9月海州湾海洋牧场区渔业资源调查,应用稳定同位素方法计算主要生物的δ~(13)C、δ~(15)N值及营养级,运用系统聚类分析划分主要营养类群(Trophic Group, TG)。【结果】鱼类、虾蟹类、头足类和贝类,营养级范围分别为2.6～4.1、2.7～3.6、2.9～3.3和2.0～3.0。该海域的拖网渔获物可分为3大类群:TG1包括大多数生物类群,由鱼、虾、蟹类和头足类组成;TG2主要为高营养级消费者,包括斑尾刺鰕虎鱼Acanthogobius ommaturus和四指马鲅Eleutheronema tetradactylu;TG3为初级消费者。【结论】2018年海州湾海洋牧场区域同种生物的营养级较2014年明显变高,但也有个别种类的营养级出现不同程度的降低。     

马氏珠母贝肠道及其养殖水体可培养细菌群落结构

【目的】了解马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)肠道及其养殖水体可培养细菌的群落组成。【方法】采用2216E平板涂布法研究海区养殖马氏珠母贝肠道与养殖水体的可培养菌群种类及丰度。【结果与结论】马氏珠母贝肠道及其养殖水体的可培养细菌归属于2门(变形菌门和厚壁菌门)3纲7目10科23属56种。属水平上,肠道中以弧菌属(74.7%)和假交替单胞菌属(18.7%)为主;养殖水体中α-变形菌纲的FJ943236_g属(40.7%)丰度最大,弧菌属(16.7%)相对肠道丰度较低。样品共有菌属为弧菌属、假交替单胞菌属、发光杆菌属和芽孢杆菌属;肠道特有菌属为希瓦氏菌属和盐单胞菌属;养殖水体特有菌属主要为FJ943236_g、鲁杰氏菌属和Nautella。在种水平上,7个种为二者共有;马氏珠母贝肠道和养殖水体特异性菌种分别为18个和31个。虽然门水平上马氏珠母贝肠道中可培养细菌群落与其养殖水体中的细菌群落大致相似,但在属、种水平上二者差异明显。     

红树林内生真菌的抗氧化作用

内生真菌(Endophytic fungi) 是存在于健康植物的茎叶中, 形成不明显浸染的一类真菌.植物与内生真菌呈互利共生的关系: 一方面, 植物为内生真菌提供光合产物和矿物质; 另一方面, 内生真菌产生的代谢物, 或能刺激植物的生长发育, 或能提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力.从内生真菌的代谢产物中,寻找抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性的分子代谢产物,已成为人们关注的热点,内生真菌已经成为寻找新药源的宝贵资源[1,2].     

溶藻弧菌gr基因缺失株构建及其生物学特性

【目的】研究敲除谷胱甘肽还原酶(GR)基因gr对溶藻弧菌HY9901生物学特性的影响。【方法】通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌HY9901的gr基因缺失株,通过反转录验证并检测其遗传稳定性,绘制该菌的野生株和缺失株的生长曲线,测定该菌野生株和缺失株的生物膜形成能力、抗生素敏感性、胞外蛋白酶活性和泳动能力等生物学特性。【结果】gr基因的缺失几乎不影响溶藻弧菌的生长趋势,但敲除gr基因后溶藻弧菌对呋喃唑酮、头孢唑林、四环素等敏感性增强,该菌的生物膜形成能力增强显著提高。缺失株△gr的胞外蛋白酶活性和泳动能力均低于野生株。【结论】谷胱甘肽还原酶在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、药物敏感性、泳动等方面有重要作用。     

红树林内生真菌的抗氧化作用

内生真菌（Endophytic fungi）是存在于健康植物的茎叶中，形成不明显浸染的一类真菌。植物与内生真菌呈互利共生的关系：一方面，植物为内生真菌提供光合产物和矿物质；另一方面，内生真菌产生的代谢物：或能刺激植物的生长发育，或能提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力。从内生真菌的代谢产物中，寻找抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性的分子代谢产物，已成为人们关注的热点，内生真菌已经成为寻找新药源的宝贵资源 。     

噬菌弧菌N1对淡水和海水养殖水体细菌群落影响PCR-DGGE分析

【目的】研究噬菌弧菌Bacteriovorax sp. N1在一个投放周期内对淡水和海水养殖环境中细菌、弧菌总数及细菌群落结构的影响。【方法】自市售微生态制剂分离蛭弧菌N1并进行分子鉴定,测定其裂解效果,制备高浓度N1菌液分别投放至淡水红鲤鱼(red carp)和海水仿刺参(Apostichopus japonicus)养殖水体,采用细菌平板计数法及PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析48 h内水体环境中细菌、弧菌总数及细菌群落结构变化。【结果】经鉴定蛭弧菌N1为噬菌弧菌,其对大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、黄海希瓦氏菌(Shewanella smarisflavi)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均有裂解效果。将噬菌弧菌N1投放进淡水和海水养殖环境的12～24 h,其能显著降低两种环境中弧菌含量(P 0.05)。DGGE分析显示添加噬菌弧菌N1后淡水组优势菌群弧菌属(Vibrio,a1)和不可培养杆菌属(Uncultured bacterium, a5)在12 h以后含量有明显的减少,假单胞菌属(Pseudomonas, a3)和红杆菌科Shimia属(Shimia, a6)菌含量增加。海水组优势菌群不可培养杆菌属(c2)菌在12 h时变成非优势菌群,而白杆菌属(Albirhodobacter,c1)增加成为优势菌群。噬菌弧菌N1在水中含量在24 h时降至最低。【结论】噬菌弧菌N1对海水和淡水环境中的弧菌属和不可培养杆菌属菌群有明显的裂解作用导致其含量下降,但也使假单胞菌属(Pseudomonas),红杆菌科Shimia属和白杆菌属(Albirhodobacter)菌群含量增加,但生物效应不明。为维持噬菌弧菌N1对弧菌的控制,需要24 h左右重新补充投放。     

侧孢短芽孢杆菌对铜绿微囊藻藻际微生物群落的影响

【目的】探究铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)藻际微生物群落组成以及与溶藻细菌侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)Bl-zj共培养对藻际微生物群落的影响。【方法】将侧孢短芽孢杆菌Bl-zj与铜绿微囊藻共培养4 d后(BL组),收集样品,以单独培养的铜绿微囊藻(BG组)为对照,提取样品总基因组DNA后进行16S rDNA扩增、构建文库、测序及生物信息学分析,比较BL组与BG组间藻际微生物群落的差异。【结果】测序平均获得高质量序列85390条,946个OUT(Operational Taxonomic Unit),BL组特有OTU 339个。物种组成分析显示,BG组微生物群落主要以微囊藻属(Microcystis)为主,其余相对丰度由高到低分别为假单胞菌属(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)和红杆菌属(Rhodobacter)。BL组微生物群落主要以短芽孢杆菌属(Brevibacillus)为主。BL组的微生物多样性相较于BG组显著下降(P<0.05)。经预测,BG组微生物功能集中在能量代谢与外源生物降解与代谢,BL组微生物功能集中在碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能。【结论】侧孢短芽孢杆菌Bl-zj与铜绿微囊藻共培养,打破了铜绿微囊藻藻际微生物群落的平衡,与Bl-zj的溶藻进程有关。