长牡蛎(Crassostrea gigas)与熊本牡蛎(C.sikamea)杂交的受精细胞学观察及子一代的生长比较

以长牡蛎和熊本牡蛎为材料,进行了4个组合的杂交和自交实验。利用DAPI染色观察了长牡蛎和熊本牡蛎正反杂交的受精卵在受精,减数分裂和早期卵裂过程中的核相变化。结果表明,在长牡蛎♀×熊本牡蛎♂正交组,熊本牡蛎精子进入长牡蛎卵子后,激活卵子完成2次减数分裂,同时,精核出现了两次明显的体积膨大扩散过程。但是,大部分受精卵不再继续进行胚胎发育。在熊本牡蛎♀×长牡蛎♂反交组中,受精卵内核行为的变化与正交组相同。正反交组的胚胎发育过程都具有明显的不同步现象。对各实验组子一代的生长和存活的研究结果表明,幼虫阶段,杂交后代的壳高、壳长均明显小于自交组;长牡蛎♀×长牡蛎♂自交组(GG)和熊本牡蛎♀×长牡蛎♂杂交组(SG)的存活率高于长牡蛎♀×熊本牡蛎♂杂交组(GS)和熊本牡蛎♀×熊本牡蛎♂自交组(SS)。稚贝和成贝阶段,杂交组子一代在壳高、壳长和存活率3个生长指标上均小于自交组。     

不同盐度和温度对熊本牡蛎(Crassostrea sikamea)稚贝生长与存活的影响

熊本牡蛎(Crassostrea sikamea)自然分布于中国长江以南沿海、日本有明海以及韩国沿海地区,具壳质坚硬、肉味清甜等特点,是巨蛎属牡蛎中重要经济种之一。为阐明熊本牡蛎稚贝生长发育的适宜盐度和温度范围,本研究分析了6个不同盐度(15、20、25、30、35和40)和5个不同温度(16、20、24、28和32°C)对熊本牡蛎稚贝生长与存活的影响。盐度实验结果显示,盐度15、20和25组中熊本牡蛎稚贝壳高和壳长显著高于盐度35和40组(P0.05),且随盐度增加,稚贝壳高、壳长表现为先升高后降低的趋势;盐度20组存活率最高,与盐度30和40组差异显著(P0.05);熊本牡蛎稚贝的适宜生长盐度为20—25,适宜存活盐度为15—25。温度实验结果显示,稚贝壳高和壳长在温度28°C组最大,随温度的降低,壳高、壳长也逐渐减小;温度20、24和28°C组存活率显著高于温度16和32°C组(P0.05);熊本牡蛎稚贝的适宜生长温度为24—28°C,适宜存活温度为20—28°C。熊本牡蛎稚贝对低盐高温有较强的适应能力。     

不同地理群体长牡蛎杂交子代的早期生长发育

本研究以中国、日本、韩国3个地理群体长牡蛎连续选育2代的个体作为亲本,进行了3×3完全双列杂交,建立了3个自交组合和6个杂交组合,分析了各实验组的受精率、孵化率、幼虫阶段的生长和存活、各杂交组子代的杂种优势以及卵源和交配方式对幼虫生长和存活的影响。结果表明,各实验组均有较高的受精与孵化率,除韩国群体♀×韩国群体♂自交组的受精和孵化率明显较低外,其他组之间没有显著差异。在整个幼体阶段,卵源和交配方式对幼虫的生长和存活有显著影响。3个自交组幼虫的生长没有显著差异(P>0.05),6个杂交组幼虫的生长不同程度快于3个自交组,其中中国群体♀×日本群体♂杂交组在整个幼虫阶段生长最快,表现出较大的生长优势,壳高生长的杂种优势率为2.40%～12.53%,其他杂交组也表现不同程度的生长优势。在存活率方面,韩国群体自交组表现出较低的存活率,中国群体♀×日本群体♂和中国群体♀×韩国群体♂2个杂交组的存活率均高于3个自交组,26日龄时的存活率分别为66.63%和61.80%,存活率的杂种优势分别为13.11%～26.52%和40.77%～69.18%,其他杂交组在存活率上没有显示杂种优势。     

香港巨牡蛎对3种微藻的选择性摄食研究

从微藻粒径大小、饵料密度以及营养价值角度,选取牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）、亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）分别作为硅藻、绿藻和金藻的代表,开展了不同规格的香港巨牡蛎对3种微藻在同等密度、同等生物量混合条件下的摄食选择性研究。结果显示,香港巨牡蛎在两种不同混合藻条件下对3种不同微藻摄食选择性有显著性差异（P<0.01）。3种藻相同密度混合条件下,大、中、小3种规格香港巨牡蛎更倾向摄食粒径较大的亚心形扁藻,且贝类规格越大选择倾向性越低,摄食选择效率分别为0.32、0.35、0.48,对球等鞭金藻无明显选择性。3种藻等生物量混合条件下,香港巨牡蛎对亚心形扁藻和球等鞭金藻的摄食有选择性,且规格大小对选择效率影响显著（P<0.01）,个体越小选择性越强,小规格香港巨牡蛎倾向滤食亚心形扁藻（P<0.01）,大、中规格更倾向摄食粒径较小的球等鞭金藻。两种混合条件下,香港巨牡蛎都对牟氏角毛藻都有负的选择效率,而且牟氏角毛藻密度越高负值绝对值越大。微藻的细胞大小、形状、营养价值以及香港巨牡蛎的个体大小都对摄食选择性有着明显的影响,香港巨牡蛎的摄食选择性在现场海区中还明显受到生境及食物条件的限制。     

香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)与长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂种遗传力评估

以平衡巢式设计(1长牡蛎♂:3香港牡蛎♀)构建的45个香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)×长牡蛎(Crassostrea gigas)种间杂交家系为材料,对其生长、存活及产量性状狭义遗传力进行了评估,并对其两两对应性状表型相关及遗传相关进行了分析。结果表明:(1)生长性状的遗传力大小为0.6207—0.8785,以父系半同胞组内相关法估计的幼虫15日龄、稚贝180日龄、幼贝360日龄壳高遗传力分别为0.6355、0.4828、0.5787,其360日龄鲜重遗传力为0.7740;(2)存活性状的遗传力大小为0.2748—0.3957,以父系半同胞组内相关法估计的幼虫15日龄、稚贝180日龄、幼贝360日龄存活率遗传力分别为0.1900、0.2939、0.4064;(3)产量是生长与存活的共同作用结果,360日龄产量的遗传力及以父系半同胞组内相关法估计的遗传力分别为0.6706、0.5018。从其生长相关性上看,幼虫期与稚贝期出现了微弱负向相关;除了幼虫期与幼贝期的壳高及产量,及其稚贝期与幼贝产量间无相关性以外;其它的两两生长性状间均为显著正相关。从存活与产量的相关性上看,无论是表型性状,还是遗传性状均出现了积极的正相关,以遗传相关为主。本研究为建立远缘杂交育种方法和策略提供必要的理论依据。     

盐度对香港巨牡蛎♀×葡萄牙牡蛎♂杂交子代早期杂种优势的影响

本研究以香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)自繁组HH(H♀×H♂)、葡萄牙牡蛎(C.angulata)自繁组AA(A♀×A♂)和杂交组HA(H♀×A♂)为研究对象,采用盐度骤变法研究盐度为10、15、20、25、30、35下杂交子代的早期表型性状和杂种优势。研究表明,H♀与A♂只能单向受精;盐度10条件下,各组均无法受精;HA、AA、HH的适宜卵裂盐度分别为20~35、25~35、20~30,适宜孵化盐度分别为15~30、20~30、15~25。在卵裂阶段,杂交受精卵均产生不同程度的杂种劣势(H0),杂种劣势最小为-10.168%,最大为-39.836%;在孵化阶段,杂交受精卵均存在一定的杂种优势(H0),杂种优势最小为5.665%,最大可达137.413%。存活方面,在盐度10、15、35时HA、AA、HH的存活率迅速下降并于10日内全部死亡,HA在盐度20、25、30组存活至实验结束,HH、AA仅有2组存活,分别为盐度20、25组和25、30组,HA在盐度20和25时表现出一定的存活优势(H0),分别为107.186%和7.775%。生长方面,HA在盐度20、25、30组于第4日均表现为显著的杂种劣势(H0、hp-1),于第10日盐度20组表现出杂种优势,第16日盐度25和30组表现为杂种优势。总体上,随着实验的进行杂交子代逐渐表现出生长优势,这表明杂交子代具有一定的生长潜力。     

香港巨牡蛎对3种浮游植物摄食率和滤清率的研究

本文在室内条件下研究了大、中、小3种规格的香港巨牡蛎（Crassostrea hongkongensis）对牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）、亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）、球等鞭藻（Isochrysis galbana）3种浮游植物在同等密度、同等生物量条件下的摄食率和滤清率,探讨了香港巨牡蛎对3种浮游植物的摄食差异及其影响因素。结果表明,在28℃水温条件下,香港巨牡蛎的单位个体滤清率和单位体质量滤清率分别为1.40~8.94 L/（ind·h）和0.86~3.17 L/（g·h）,等密度和等生物量浮游植物条件下香港巨牡蛎均表现出单位个体滤清率由高到低依次为:大规格、中规格、小规格;不同规格香港巨牡蛎的单位体质量滤清率相近。相同藻类密度条件下,香港巨牡蛎的单位体质量滤清率由高到低依次为:亚心形扁藻、球等鞭金藻、牟氏角毛藻;相同生物量条件下,香港巨牡蛎对3种浮游植物单位体质量滤清率由高到低依次为:球等鞭金藻、亚心形扁藻、牟氏角毛藻。香港巨牡蛎对不同浮游植物种类和密度的滤清率、摄食率差异主要是受饵料的大小、营养质量和密度等因素影响。     

盐度胁迫对香港牡蛎部分生化指标的影响

为探究盐度胁迫下香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)生化指标的变化规律,了解盐度适应过程中牡蛎的代谢机制,本研究以盐度0、8、16、32、40为胁迫盐度,以正常海水(盐度24)为对照,开展香港牡蛎对盐度胁迫的响应研究。结果显示,各实验盐度组糖原含量在盐度胁迫0～8 h内下降,且盐度胁迫幅度越大糖原含量降幅越大,胁迫8 h后则无明显的变化规律。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)、组蛋白/蛋白去乙酰化酶(SIRT1)和Na~+/K~+-ATP酶活力的变化规律相似:在0～8 h内,各实验组酶活力均急剧下降(SIRT1上升);8～48 h内,酶活力上升;48～120 h内,酶活力逐渐趋于平稳状态,总体表现为盐度越高,酶活力越强,并与胁迫前有明显差异,且盐度胁迫幅度越高,差异越明显。总抗氧化能力(T-AOC)总体表现出高盐胁迫下随时间的增加而升高,低盐胁迫下随时间的增加而降低,且盐度胁迫幅度越大,T-AOC活力的变化幅度越大。实验结果初步表明,香港牡蛎糖原含量与渗透压调节存在一定的关系,AMPK、SIRT1、Na~+/K~+-ATP酶活力及T-AOC均与渗透压调节密切相关,且在高盐胁迫下随时间的增加而升高,低盐胁迫下随时间的增加而降低。     

盐度对牡蛎“华南1号”早期发育与生长的影响

为探究牡蛎"华南1号"早期发育的盐度适应性,本研究以目前北部湾海域的香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)养殖群体为对照组,在水温28～29℃、pH为8.1～8.2条件下,分析了不同盐度(3、8、13、15、18、23、28、33)对牡蛎"华南1号"的胚胎、幼虫发育和稚贝生长的影响。研究显示,不同盐度下牡蛎"华南1号"的受精率和孵化率均高于对照组,差异显著(P0.05),且牡蛎"华南1号"的适宜受精盐度为13～23,对照组的适宜受精盐度为13～18。相同盐度条件下,牡蛎"华南1号"与对照组浮游幼虫期的壳高生长指标差异显著(P0.05),牡蛎"华南1号"不同盐度组间差异显著(P0.05)。不同盐度条件下,牡蛎"华南1号"在幼虫发育阶段和早期稚贝的生长速率和存活率均随着盐度的增加"先升后降",且不同盐度组间差异显著(P0.05),高盐33和低盐3条件下幼虫生长缓慢且存活率较低,牡蛎"华南1号"幼虫的附着率和存活率在盐度13～23时较高。研究结果表明,牡蛎"华南1号"在浮游幼虫和早期稚贝阶段生长速度快于对照组群体(P0.05),且浮游幼虫和稚贝生长的适宜盐度为8～28,最适盐度为13～23;对照组幼虫和稚贝生长的适宜盐度为8～23,最适盐度为13～18。与对照组群体相比,牡蛎"华南1号"适宜盐度较对照组由18提高到23,盐度适应范围广,且具有明显的生长优势。     

长牡蛎中国群体与日本群体杂交子一代的生长和存活比较

以中国长牡蛎(C)和日本长牡蛎(J)为材料,进行了4个组合的杂交和自交实验,分析了各实验组受精率、孵化率,幼虫和稚贝的生长、存活以及杂交子代的杂种优势。结果表明,自交组的受精率介于杂交组之间,但是经单因素方差分析表明没有显著性差异; JJ组的孵化率最高,其次是JC和CC组, CJ组的孵化率最低,相同卵子来源的组合在孵化率上无显著差异。JJ组在幼虫期和稚贝期、养成期的壳高、壳长平均值均大于其他三组; JC组在幼虫期和稚贝期、养成期的壳高、壳长仅次于JJ组,其壳高、壳长和存活率杂种优势率均较为明显; CJ组的杂种优势率在幼虫期和稚贝养成期的各个生长性状上都表现为负值。杂交子一代中存在正交和反交结果不同的现象可能与母性效应、遗传因素和环境等因素有关。     

单体牡蛎诱导变态的研究

为了得到壳型规则、大小均一的单体牡蛎,作者以葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulata)和长牡蛎(Crassostrea gigas)眼点幼虫为材料,从肾上腺素(EPI)浓度梯度、处理时间梯度和眼点幼虫密度梯度3个因素诱导产生不固着变态的单体牡蛎。结果表明,葡萄牙牡蛎用EPI处理24 h的最适浓度为5×10–4 mol/L,不固着变态率为72.8%,在该最适浓度下,最佳处理时间为12 h,不固着变态率为82.7%。长牡蛎用EPI处理6 h的最适浓度为5×10–5 mol/L,不固着变态率为53.2%,在该最适浓度下,最佳处理时间为8h,不固着变态率为56.8%,眼点幼虫密度在80个/m L以下EPI处理效果没有显著性差异。对长牡蛎幼虫进行后续生长测定,结果显示EPI处理组幼虫的壳长、壳高和存活率要高于对照组,表明EPI可能促进牡蛎幼虫变态长出次生壳并提高其生存能力。     

香港牡蛎二倍体及三倍体幼虫生物学特征比较

为了评估香港牡蛎二倍体及三倍体幼虫生物学特征,于2013～2015年,在湛江和北海两地比较了二倍体及三倍体幼虫生长、存活及变态差异,计算了三倍体优势率,评估了倍性与环境效应互作对其表型性状的影响。结果表明:三倍体D形幼虫显著大于二倍体幼虫,之后,伴随着个体增长,生长优势逐渐增大,15日龄时的三倍体优势率为8.9%～9.1%。三倍体幼虫存活力与二倍体相当,未出现大量致死现象。三倍体变态规格显著大于二倍体,其优势率为5.1%～5.3%;三倍体变态时间显著低于二倍体,但其变态率与二倍体相当,不存在显著差异(p>0.05)。经过双因子分析模型的方差分析检测,发现倍性和环境效应都会对香港牡蛎幼虫生长产生显著影响(p<0.001),环境是影响幼虫存活率及变态的主要因子(p<0.05)。     

香港巨牡蛎ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以香港巨牡蛎（Crassostreahongkongensis）基因组DNA为模板,采用正交设计及单因素比较试验,分别对Mg^2＋、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和DNA模板浓度的PCR原料进行优化,并通过温度梯度PCR,筛选适宜的退火温度。确立了香港巨牡蛎的最适ISSR—PCR反应体系：25μL反应体系中含PC...     

近江牡蛎鳃细胞的原代培养

采用改良的DMEM(HG)培养基,建立了近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)鳃细胞体外培养技术,包括鳃组织块培养法和胰酶消化培养法。结果表明,组织块培养法接种6 h后,细胞开始从组织块中迁出,细胞形态较小,呈圆形、椭圆形或多边形,直径3～6μm。培养至3 d时,细胞在组织块周围形成生长晕。培养至6 d时可进行细胞传代,本次实验细胞已传至第6代。胰酶消化法接种约2 h后,细胞逐渐贴壁,从形态上主要分为两类,一类为小型细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径3～6μm,数量多,增殖速度较快;另一类为大型细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径10～20μm,部分细胞内部含有颗粒,数量较少,增殖速度较慢。培养至2 d时可进行细胞传代,传代培养物中的优势细胞皆为小型细胞。本次实验细胞已传至第6代。     

响应面法优化香港巨牡蛎蛋白酶解工艺的研究

以水解度为指标,比较了6种蛋白酶对香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)的水解效果。在单因素考察实验的基础上,采用Box-Behnken模型响应面设计,建立香港巨牡蛎蛋白酶解的二次回归模型,确定最佳的水解条件。实验结果表明,海产品专用蛋白酶对香港巨牡蛎蛋白的水解效果优于其他蛋白酶,该酶的最佳水解条件为:酶与底物比为5.93%,酶解时间为4.07 h,酶解温度为54.6℃。在此条件下,海产品专用蛋白酶酶解香港巨牡蛎蛋白的水解度达到25.73%±2.39%。本研究为香港巨牡蛎的开发和利用提供了理论依据。     

长牡蛎F3 代快速生长选育群体生长特性的研究

采用模型拟合方法研究了长牡蛎(Crassostrea gigas)F3代快速生长选育群体不同时期各生长性状的发育规律。结果表明,长牡蛎幼虫期壳高(SH)、壳长(SL)对日龄(t)的回归遵循Logistic模型,生长方程分别为SH=455.612/(1+9.500e-0.142t),R2=0.999;SL=462.476/(1+8.026e-0.108t),R2=0.996。幼虫期壳高与壳长成直线相关,回归方程为SL=0.76SH+18.82,R2=0.994。长牡蛎养成期各生长性状呈现明显的季节变化,壳高(SH)、壳长(SL)、壳宽(SW)和总质量(TW)对月龄(X)的多项式回归方程分别为SH=-0.0297X4+1.0365X3-12.0220X2+57.6500X-68.9260,R2=0.985;SL=-0.0173X4+0.5893X3-6.5702X2+30.2420X-34.4150,R2=0.986;SW=-0.0068X4+0.2620X3-3.2806X2+16.9170X-22.1410,R2=0.956;TW=-0.0219X4+0.8234X3-10.1680X2+50.7040X-85.4110,R2=0.972。壳高、壳长、壳宽与总质量均呈幂函数相关,回归方程分别为SH=23.645TW0.3213,R2=0.998;SL=12.337TW0.3776,R2=0.995;SW=6.611TW0.3589,R2=0.981。     

长牡蛎dpp同源基因的克隆及其在贝壳发生中的功能研究

dpp是转化生长因子β家族的重要成员,在胚胎发育中作为形态发生子参与体轴形成及附肢发育等过程。为了研究牡蛎dpp同源基因在贝壳发生中的作用,揭示贝壳发生的分子机理,作者克隆了一种长牡蛎(Crassostrea gigas)的dpp基因,命名为cgdpp。序列和进化分析显示,cgdpp分子中不同位点的氨基酸残基变异程度不同。作者用整装原位杂交的手段研究了dpp同源基因在长牡蛎早期发育中的表达情况。结果表明,dpp同源基因参与了从贝壳形成区开始分化到早期贝壳形成的全过程。在担轮幼虫(Trochophore)中,dpp同源基因似乎调控了贝壳的形状与扩张速度;在早期D形幼虫中,dpp同源基因表达量突然下降至痕量水平,并与贝壳发育区无明显的关联,提示dpp同源基因可能仅仅参与了贝壳的发生,不参与其进一步的发育过程。