大菱鲆卵黄原蛋白的分离纯化及Native-PAGE、SDS-PAGE性质鉴定

采用5 mg/kg 17β-雌二醇对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行肌肉注射,一周后尾静脉取血,离心分离获得血浆,经Sephacryl S-300(高分辨)分子筛纯化卵黄原蛋白,对卵黄原蛋白进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,考马斯亮蓝染色和糖、磷、脂的特征性基团染色.结果表明,17β-雌二醇能诱导大菱鲆产生卵黄原蛋白,以N-ative-PAGE方法计算得到大菱鲆卵黄原蛋白的分子质量为538 ku,以SDS-PAGE方法得出其两种亚基的分子质量分别为100 ku和82 ku.分子筛凝胶过滤能较好地纯化大菱鲆血浆中的卵黄原蛋白.     

大菱鲆血清免疫球蛋白IgM单克隆抗体的制备及其特性分析

本研究运用硫酸铵盐析法结合Protein A亲和层法从大菱鲆血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。SDS-PAGE分析结果显示,纯化的血清IgM主要有2条蛋白带,分子量分别为78和27kDa,分别为大菱鲆IgM的重链与轻链。以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,将融合后的细胞置于含HAT的培养基中培养。利用ELISA和Western blotting筛选杂交瘤,并利用有限稀释法对阳性杂交瘤进行单克隆,最终共获得3株抗大菱鲆血清IgM单克隆抗体,分别命名为1B2、1G4和2A1,抗体分型结果显示3株单抗均属IgG。Western blotting结果显示,单抗1B2和1G4可特异性识别大菱鲆IgM重链蛋白,而单抗2A1则特异性识别轻链蛋白。同时,以制备的腹水单抗1G4结合免疫荧光检测显示,单抗1G4可识别大菱鲆外周血、脾及前肾组织中表面IgM阳性(sIgM~+)细胞;流式细胞术分析显示,大菱鲆外周血、脾和前肾白细胞中sIgM~+细胞比例分别为48.07%,20.05%和18.45%。研究结果显示,制备的抗大菱鲆血清IgM单抗特异性高、反应性强,可为研究大菱鲆免疫系统及免疫应答动态提供有力的工具。     

牙鲆血清中免疫球蛋白M的分离及其测定

通过提取健康养殖牙鲆(Paraliehthys olivaceus)血清中的免疫球蛋白(Ig),并测定其相对分子质量,其中重链(H链)的相对分子质量为74．2ku,轻链(L链)的相对分子质量为23．8ku。用纯化的牙鲆血清中的Ig作抗原,制备多克隆抗体,确立牙鲆血清中免疫球蛋白的最佳测定方法。     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

四种海水养殖鱼类血清免疫球蛋白的分离纯化及分子量测定

利用Protein A-sepharose亲和性层析一步法，首次分离纯化了4种海水养殖鱼类（3种暖水性鱼类：紫笛鲷Lutjanus argentimaculatus,青石斑鱼Epinephelus awoara，尖吻鲈Lates calcarifer和1种冷水性鱼类牙Ping Paralichthys olivaceus）血清中的免疫球蛋白（Ig)。3种暖水性鱼类Ig的分离效果较好，牙Ping较差。层析曲线的洗脱峰值说明牙Ping血清的Ig同紫红笛鲷，青石斑鱼，尖吻钙3种暖水性鱼类血清的Ig在结构和功能上有明显的差异。通过SDS－PAGE电泳测得其重链分子量分别为紫红笛鲷79.5kDa和75.0kDa，青石斑鱼77.2kDa，尖吻鲈81.8kDa和75.7kDa，牙Ping 73.5kDa，轻链分子量分别为30.1kDa，31.1kDa,29.7kDa和15.0kDa。     

大菱鲆与牙鲆育苗异同的研究

本文结合多年生产实践,比较了大菱鲆与牙鲆人工育苗的异同,在人工繁殖、发育特征、苗种培育、营养与饲料、疾病预防等方面进行了研究,从而为大力发展大菱鲆与牙鲆的人工育苗、提高苗种数量和质量提供技术参考。     

母源免疫对大菱鲆(Scophthalmus maximus)子代抗体IgM水平的影响

采用鳗弧菌灭活疫苗对大菱鲆(Scophthalmus maximus)雌性亲鱼免疫方法, 进行了母源免疫对子代抗体水平、变化规律的影响及卵子中抗体蛋白空间分布特征的研究。结果表明, 免疫亲鱼产出的卵子中IgM抗体水平显著高于对照组。胚胎发育过程中, 抗体水平整体呈下降趋势, 且48h前下降迅速, 免疫组抗体水平显著高于对照组(P<0.05); 48h以后, 免疫组和对照组间无显著差异。卵子中抗体蛋白免疫组化定位结果表明, 未受精卵中IgM抗体集中分布在卵膜内侧边缘, 卵黄部分分布不明显。研究还发现, 卵巢液中抗体水平显著高于卵子匀浆液, 且免疫亲鱼组卵巢液中抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。本实验验证了大菱鲆特异性抗体的母源传递性, 并揭示了在本免疫条件下的传递时效, 为进一步开展通过母源免疫对育苗早期疾病防控途径的探索奠定了基础。     

金属蛋白酶对大菱鲆血清抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

为了研究金属蛋白酶对大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗氧化系统的影响,作者分别对大菱鲆肌肉注射不同浓度的金属蛋白酶,并于3、6、12、24、48、72 h测定血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化活力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)含量变化。结果显示,低质量浓度组(0.037mg/mL)金属蛋白酶处理后,CAT和T-SOD活力除3h显著高于对照组外(P0.05),其余时间点均与对照组无显著差异(P0.05),而低浓度组GSH-Px和T-AOC在整个试验过程中均与对照组无显著性差异(P0.05)。中质量浓度组(0.073mg/mL)金属蛋白酶胁迫后血清中CAT、GSH-Px、T-SOD和T-AOC在3 h～72 h均呈现波浪形的变化趋势。高质量浓度组(0.147 mg/mL)金属蛋白酶对上述4种抗氧化酶产生不同程度的抑制,且在6 h～72 h均显著低于对照组(P0.05)。金属蛋白酶低质量浓度和中质量浓度组MDA含量呈现较为平稳的变化趋势,且与对照组无显著性差异(P0.05),而高质量浓度组MDA含量在3 h～72 h均显著高于对照组(P0.05)。     

大菱鲆四倍体的人工诱导研究

大菱鲆(Scophthalmus maximus)为我国北方沿海主要的海水经济品种,其四倍体的获得对种质改良和三倍体的规模化生产具有重要的价值。到目前为止,有关大菱鲆四倍体的人工诱导尚未见报道。本文采用静水压抑制受精卵卵裂的方法,进行了四倍体诱导条件的摸索。结果显示,在14.8—15.5?C培育时,在卵裂前15min用67.5MPa处理6min可获得较好的诱导效果,其孵化率最高可达72%,染色体制片计数法计算其原肠胚期诱导率可达70%,初孵仔鱼流仪检测诱导率最高为73%。诱导组胚胎发育与对照组在形态学上基本一致,仅发育孵化时间比对照组略有滞后。     

大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR技术建立及应用

用8个微卫星标记组合建立了2个微卫星多重PCR体系,对大菱鲆7个人工选育家系进行了系谱认证、亲子鉴定和遗传多样性研究.2个多重PCR体系中8个微卫星位点共检测到等位基因49个,每个位点等佗基因数为3～8个.根据已知亲本及子代基因型,成功推断出了3个缺失亲本的基因型.在双亲未知的情况下2个多重PCR的8个微卫星位点累积排除概率是96.58%,已知1个亲本时累积排除率为99.71%,亲子鉴定准确率为96.42%.采用70个个体进行双盲验证,利用UPGMA法对7个家系的70个体进行了聚类分析,同一家系95.71%的个体聚类分析结果与系谱来源一致.Cervus 2.0软件亲子鉴定结果表明亲子鉴定准确率为92.86%.2个多重PCR体系的建立为大菱鲆不同家系混养后的亲子鉴定、系谱分析和分子辅助家系管理提供了技术手段.     

大菱鲆Hepcidin基因的克隆和真核表达载体的构建

Hepcidin是鱼类的一种重要的抗菌肽.通过比较GenBank中不同Hepcidin基因的同源相似性,设计出特异性的引物,以我国海水养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus L)肝脏为模板利用RT-PCR 技术克隆获得了一条基因.使用生物信息学手段对该基因序列进行了比对和分析,证实这条基因为Hepcidin1 precursor基因,属于Hepcidin基因家族.通过设计引物在Hepcidin基因的5′和3′端分别引入EcoR I和NotⅠ酶切位点.经过双酶切后获得具有EcoR I和Not I酶切位点的Hepcidin成熟肽片段,并与同样使用该酶线性化的表达载体pPIC3.5K连接.构建了表达载体pPIC3.5K/Hepc1,并将其导入到酵母基因组中,完成了真核表达载体的构建,为Hepcidin的真核表达作了基础性的准备工作.     

大菱鲆病原鳗利斯顿氏菌的药物敏感性测定与分析

对从大菱鲆(Turbot, Scophthalmus maximus L.)细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到并经鉴定的病原鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)进行了对常用抗菌类药物及弧菌抑制剂 O / 129 的敏感性测定.结果表明,供试的 20 株鳗利斯顿氏菌均对所测定的 37 种抗菌类药物中的头孢噻肟等 18 种药物高度敏感、对青霉素 G 等 6 种药物耐药、对头孢唑啉等 10 种药物耐药性菌株间有差异;2 株(S010610-3 和 S010610-4)对弧菌抑制剂 O / 129 具抗性,余 18 株均表现敏感.     

大菱鲆的营养研究进展

介绍了国外近年来大菱Ping的仔稚鱼期生物饵料、植物蛋白、脂类以及维生素对其生长及成活率影响的研究现状，以期为我国大菱Ping鱼的科学养殖提供参考。     

牛蒡寡糖对大菱鲆生长和免疫机能的影响

将自主研发的牛蒡寡糖作为添加剂添加到大菱鲆的基础饲料中,探讨其对大菱鲆(Scophthalmus maxi-mus)的生长和免疫机能的影响。经过60 d不同剂量(1.0%,2.0%,4.0%,6.0%)的饲喂试验,分别从每组随机抽取鱼体,测定其生长指标和血清中ACP,AKP,LSZ,SOD和PO等多种免疫相关酶的活力以及血液中白细胞的吞噬活性。结果表明,牛蒡寡糖作为一种非特异性免疫调节剂对大菱鲆表现出优良的促生长作用,还能显著提高大菱鲆的免疫相关酶活力和白细胞的吞噬活性,从而提高大菱鲆的非特异性免疫力,其适宜添加量为4.0%。牛蒡寡糖可以开发成为水产动物的促生长剂和免疫增强剂。     

大菱鲆鳍细胞系的建立

建立大菱鲆(Scophthalus maximus)鳍细胞系,文中采用胰蛋白酶、透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶消化法启动大菱鲆鳍组织的原代培养,并通过培养液配方和培养条件的优化成功进行大菱鲆鳍细胞的继代培养。研究结果显示,在pH=7.0~7.4、温度20~24℃的培养条件下,培养于含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐的Leibovitz-15培养液(20%胎牛血清)中的大菱鲆鳍细胞,其生长分裂状况最好,细胞形态为成纤维细胞样。经继代培养后,细胞生长分裂依然十分旺盛,第60代大菱鲆鳍细胞系的群体倍增时间为62.4 h,虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体仍为44条。该细胞系细胞经液氮冻存后仍保持有原有形态和较高存活率。现已成功建立了连续性大菱鲆鳍细胞系,目前已传至第65代。该细胞系的建立对于查清病毒对大菱鲆细胞的感染途径与感染机理等具有重要的理论意义,对于病毒疫苗研制具有重要应用价值。     

噁喹酸在大菱鲆体内的药代动力学研究

采用高效液相色谱法,研究了(24.5±0.2)℃水温条件下单次静注和口服给药后噁喹酸在健康大菱鲆体内的代谢动力学规律.结果显示,大菱鲆单次口服嗯喹酸(20mg/kg)后,药物在血浆中经时过程符合一级吸收二室开放模型,表达方程为C口服 =2.059e-0.062t +0.645e-0.023t-2.704e-0.202t,单次静注嗯喹酸(10mg/kg)后,药物在血浆经时过程符合无级吸收二室开放模型,表达方程为C静注=12.284e-0.144 +0.284e-0.027t.血浆中的主要药动学参数,静注的t1/2α (4.813 h)、t1/2β(25.441h)、tmax(0.083 h)均小于口服给药(11.26、30.212、6h).结果表明,静注嗯喹酸在大菱鲆体内的吸收、消除速度,达峰时间均快于口服给药.根据本实验的结果,嗯喹酸的合理给药方案为:建议口服给药按鱼体重21.41mg/kg,每日1次给药,连用5～7 d.     

壳寡糖对大菱鲆生长和免疫功能的影响

以基础饲料中添加500mg/kg壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)喂养初始体质量为(12.2±0.01)g的大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)8周,研究COS对大菱鲆生长、血清免疫相关酶活性和抵抗迟缓爱德华氏菌感染能力的影响。结果表明:饲料中添加壳寡糖后,大菱鲆成活率得到提高,特定生长率和增重率分别提高了15.79%和25.26%。相比对照组,饲料中添加壳寡糖饲养的大菱鲆血液中性粒细胞的吞噬指数提高了4.51%,酸性磷酸酶活性提高了32.89%,同时,大菱鲆抵抗迟缓爱德华氏菌感染的免疫保护力显著增强(P<0.05)。研究表明,在饲料中添加壳寡糖能够提高大菱鲆的生长、非特异性免疫功能和免疫保护力。     

大菱鲆与耐高温性状相关的微卫星标记筛选

采用微卫星分子标记(SSR)技术分析大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)耐高温相关特性,为耐高温大菱鲆的分子辅助育种提供合适的分子标记.将大菱鲆经过高温实验处理,区分为耐高温组与高温敏感组,用于实验分析.采用Salah.M法抽提大菱鲆肌肉组织的DNA,根据已知的30个大菱鲆微卫星位点的侧翼保守序列设计引物,进行微卫星引物PCR(SSR-PCR)扩增.对PCR扩增出的差异条带进行个体统计,最后进行微卫星位点与耐高温性状的相关性分析.结果表明,有1个微卫星位点与大菱鲆耐高温性状存在一定的负相关性;有3个微卫星位点与大菱鲆耐高温性状存在正相关性,其中位点Sma-USC27 286 bp的等位基因片段与耐高温性状的正相关性极显著,相关系数达到0.383(P＜0.01),其余2个位点为一般显著性相关.微卫星位点Sma-USC27所扩增出的差异等位基因片段可作为分子标记指导耐高温大菱鲆的辅助育种.     

不同倍性大菱鲆胚胎发育的比较研究

对真鲷(Pagrosomus major)冷冻精液诱导的大菱鲆(Scophthalmus maximus)单倍体、雌核发育二倍体和杂交二倍体,以及同源精子诱导的大菱鲆三倍体和普通二倍体的胚胎发育时序和形态进行了比较研究。结果表明,在水温(14.5±0.5)℃、pH=7.8～8.2和盐度29.7的孵化条件下,整个胚胎发育阶段,三倍体和雌核发育二倍体胚胎发育速度一直较普通二倍体为慢,三倍体稍快于雌核发育二倍体;单倍体囊胚期前胚胎发育速度最快,囊胚期后发育速度逐渐变慢,至原肠期滞留时间最长;尾芽期前杂交二倍体的胚胎发育速度一直比普通二倍体快,至心跳期胚胎发育开始停止,胚胎死亡,不能正常孵出;除杂交二倍体外的各实验组至孵化出膜所需时间和孵化率分别为:普通二倍体109 h 15min和(83.4±3.02)%,三倍体109 h30 min和(44.6±2.40)%,雌核发育二倍体112 h 15 min和(42.4±3.54)%,单倍体124 h 40 min和(4.5±1.91)%。各组胚胎发育形态上的差别主要表现为杂交二倍体胚胎畸形,胚体细长,多数器官分化不全;单倍体表现出典型的单倍体综合症;雌核发育二倍体、三倍体胚胎与普通二倍体相比,形态上没有明显差别,但初孵仔鱼畸形率显著增高。