夏季养殖刺参(Apostichopus japonicus)大面积死亡的原因分析与应对措施

夏季刺参大面积死亡正逐渐呈现常态化趋势,不仅造成了巨大的经济损失,同时使刺参资源严重衰退,制约了刺参产业的良性发展,其原因亟待揭示。本文从高温、低氧、低盐、硫化物、氨氮及藻类腐烂等环境因素,以及种质因素、病原因素、人为因素共四方面阐述了夏季刺参大面积死亡的原因,提出"建设工程化"、"养殖机械化"、"监测自动化"及"管理智能化"的应对理念,进而通过培育抗逆良种、调查关键指标并建立风险预警体系、构建综合养殖系统、完善应急处置方案、提高现代养殖技术等应对措施,综合应对夏季极端天气的威胁,为保证刺参健康度夏提供科学参考。     

南移养殖刺参(Apostichopus japonicus)原肌球蛋白基因的原核表达研究

本研究克隆和表达了刺参原肌球蛋白(Tropomyosin,TRP)基因,进一步研究刺参再生过程中重要分子的功能.结果表明,TRP基因序列总长为1203bp,5 ′非翻译区为105bp,3 ′非翻译区为240bp,该序列包含一个855bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码284个氨基酸,分子量为33.27kDa,等电点为4.56.利用Escherichia coli对TRP进行了体外重组表达,在1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导,能产生分子质量约为38kDa的重组蛋白,Western blot证明重组TRP与鼠抗刺参原肌球蛋白的多克隆抗体能特异性结合.     

刺参(Apostichopus japonicus)不同组织基因组甲基化状态MSAP分析

利用MSAP技术分析成体刺参的呼吸树、肠、肌肉和体壁等组织的基因组DNA甲基化水平,获得了四个组织基因组甲基化率.甲基化水平由高到低依次是呼吸树、体壁、肌肉和肠,分别是35.77％、33.51％、32.72％和28.0％,其中全甲基化位点各占19.46％、18.39％、19.18％和15.97％.统计学分析结果显示肠组织的甲基化水平与其它组织的差异显著(P＜0.05),其余三个组织间差异不显著(P＞0.05),但呼吸树与肌肉的半甲基化水平差异显著(P＜0.05).由MSAP分析差异位点克隆得到四个甲基化特异性片段,经测序分析功能未知,推测为刺参基因足非编码区或新功能基因序列.     

仿刺参(Apostichopus japonicus) mtDNA三个基因片段的序列分析

采用PCR技术对中国烟台、威海和莱州三个地点仿刺参的16S rRNA、COI、IrRNA-COI三个mtDNA基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为570bp、640bp和900bp的三段序列,分析了三个采样点样品的遗传多样性。结果表明,每段基因序列扩增均获得两种单倍型,已在Genbank中注册(注册号码:AY852278—AY852283)。通过比较,三个地点样品的序列差异不显著,无缺失、插入、颠换的现象,只有个别位点出现转换,其中16S rRNA序列最为保守,16S rRNA、COI、IrRNA-COI三段序列A T的平均含量为56·2%、59·2%、61·8%,均大于G C含量。三个采样点样品同源性为99·84%—99·96%。将获得的仿刺参DNA序列和Genbank中的来自东太平洋8个外群进行基因序列比较,结果发现,不同目、科的海参的序列差异显著。采用DNAsp统计了各类位点数;MEGA2·1分析了碱基组成和遗传距离,构建了系统树。系统树体现的分类关系与这些物种的形态学分类关系完全一致。     

盐度对刺参(Apostichopus japonicus)呼吸和排泄的影响

采用封闭式呼吸器法研究了(15±0.5)℃水温条件下不同盐度(22、27、31.5、36)对四种规格刺参{S[(39.60±8.77)g]、M[(71.80±14.04)g]、L[(128.30±19.69)g]和XL[(196.65±19.81)g]}呼吸和排泄的影响。结果表明,各规格组刺参单位体重耗氧率[Rwr,μg/(g·h)]和排氨率[(Rwe,μg/(g·h)]在盐度22—31.5范围内均随着盐度的升高而降低,当盐度升高至36时,二者都明显升高;各盐度下实验刺参的单位体重耗氧率分别为17.52、16.32、15.49和17.60μg/(g·h),单位体重排氨率分别为1.05、0.88、0.87和0.95μg/(g·h);在同一盐度下,刺参体重越大,其单位个体耗氧率[Rir,μg/(ind·h)]和排氨率[Rie,μg/(ind·h)]越高,二者呈幂函数关系,可用关系式Rir(或Rie)=aWb表示;关系式Rir=aWb中,a值的变动范围为40.6656—81.1900,b值为0.6432—0.8145;而关系式Rie=aWb中,a值的变动范围为2.0947—4.8489,b值为0.6507—0.8072;盐度对刺参O∶N比的影响不显著,各盐度条件下,不同规格的刺参,其O∶N比均在15左右,表明本实验条件下该参代谢所需要的能量主要由脂肪和碳水化合物提供。从呼吸和排泄的角度来看,刺参在其最适温度(15℃)条件下,具有一定的渗透压调节能力,能够适应较广的盐度变化范围(22—36)。     

温度和pH对刺参(Apostichopus japonicus)消化酶活力的影响

消化酶活力能够反映刺参对不同营养成分的消化能力。当某一反应条件发生改变时,消化酶的活力大小就会发生变化,因此研究不同因子对消化酶活力的影响对于了解消化酶的性质具有重要的意义。温度和pH是影响消化酶活力的最重要的反应条件。本文中作者应用酶学分析研究了温度和pH对剌参前肠和中肠各种消化酶活力的影响。蛋白酶活力测定采用福林-酚法,脂肪酶活力测定采用水解法,淀粉酶活力和纤维素酶活力测定采用水杨酸显色法。实验结果表明,反应温度和反应pH对刺参前肠和中肠中的消化酶活力具有显著影响(P<0.05)。前肠和中肠中蛋白酶活力均在反应温度为50℃时达到最大值,前肠和中肠中脂肪酶和纤维素酶均在反应温度为40℃时达到最大值,而前肠和中肠中淀粉酶最适反应温度分别为40℃和30℃。刺参前肠蛋白酶活力在酸性环境下较中肠高,且在反应pH为5.0—5.8之间酶活力相对稳定,而中肠蛋白酶活力在碱性环境下较前肠高,且在反应pH为7.0—8.6之间酶活力相对稳定;刺参前肠脂肪酶活力随着pH的升高出现两个相对稳定的峰值,分别为4.2—5.0和6.2—7.0区间,中肠脂肪酶活力在pH为3.8时达到最大值,而在pH超过9.0明显失活:剌参前肠和中肠淀粉酶活力在pH变化时表现出相似的变化趋势,在反应pH为6.6—7.4之间酶活力较高且相对稳定;剌参前肠和中肠中纤维素酶活力在pH变化时反应不一致,前肠淀粉酶在反应pH为6.2—7.4之间酶活力较高且相对稳定,中肠纤维素酶活力在反应pH为5.4—7.0之间酶活力较高且相对稳定。此外,通过比较四种消化酶比活力值的大小,可以看出剌参蛋白酶活力最高,其次为纤维素酶和淀粉酶活力,而脂肪酶活力最低。     

刺参(Apostichopus japonicus)幼参对高温和低盐协同胁迫的生理响应:生长和诱导型热休克蛋白基因表达

全球气候变化背景下的极端高温和强降雨频发天气导致的养殖池塘持续性的高温和低盐环境给刺参池塘养殖带来了严峻的挑战。为了研究刺参对高温和低盐环境的生理响应,本实验分析了高温和低盐协同胁迫对刺参幼参生长及诱导型hsp70和hsp90基因表达的影响。实验设置4个温度梯度（16℃、20℃、24℃和28℃）和3个盐度梯度（22、27和32）,共12个不同的胁迫组。经过40 d的长期胁迫,研究发现,随着温度的升高和盐度的降低,幼参的体重增加量减少,并在高温、低盐组出现体重负增长。长期胁迫提高了刺参幼参的诱导型hsp70和hsp90基因表达量,从而在一定程度上增强了对极端天气的抵抗能力。同时,高温下盐度22处理组刺参幼参诱导型hsp70和hsp90基因的表达量较盐度27条件下低。双因子方差分析结果显示,高温和低盐对幼参特定生长率和诱导型hsp70和hsp90基因表达量的交互作用均不显著,并且盐度对诱导型hsp70和hsp90基因表达量没有显著的影响。因此,相较低盐,高温对刺参幼参的影响更大,可作为刺参育种的选择压力。在高温期应该采取有效措施降低海水温度,并防止极端天气造成的养殖水体温度分层。该研究丰富了刺参生理生态学理论,可为刺参良种选育工作提供思路,并为指导极端天气下刺参生产实践活动提供一定的理论依据。     

微卫星标记在刺参(Apostichopus japonicus)人工繁育中亲本识别的应用

选取8个高多态性的微卫星位点, 对240只刺参(Apostichopus japonicus)幼体和14只疑似亲本进行了亲缘关系的鉴定。通过检测, 8个微卫星位点共得到53个等位基因, 平均等位基因数为6.63; 观察杂合度在0.730—0.902; 各位点的多态信息含量为0.696—0.836。通过亲缘关系分析软件CERVUS 3.0分析, 微卫星位点累积排除概率分别为0.9934、0.9997、0.99999。基于排除法个体基因型判定, 有37个子代有1个候选亲本, 194个子代有2个及以上候选亲本; 基于似然法判定, 置信度为80%时, 有198个子代个体找到最似亲本。综合排除法和似然法的亲权鉴定, 成功为229个子代个体找到它们的亲本, 鉴定成功率达95%以上。本研究结果可为刺参育种工作中亲本识别及家系分析提供技术支持和理论依据。     

刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合症发生相关蛋白的分离与鉴定

采用比较蛋白质组学的方法,对2011年10月20日取自辽宁省普兰店室内养殖厂腐皮综合症刺参和健康个体肠组织中差异表达蛋白进行了研究。结果表明,在优化的电泳条件(80μg脱盐蛋白、pH4—7[NL,13cm]的IPG预制胶条)下,共检测到约700个蛋白质点;表达量差异两倍以上的蛋白点51个,最大表达差异比率为4.32;对其中重复性一致的30个差异点进行质谱鉴定,成功鉴定了23个差异蛋白,包括铁蛋白,过氧化氢酶,泛素相关修饰子3,细胞色素氧化酶和肌动蛋白等;进一步扫描实验室完成的刺参转录组数据,筛选了过氧化氢酶和泛素相关修饰子3的EST序列。本研究是蛋白层面上刺参腐皮综合症发生机制的有效尝试,研究结果为进一步认识该疾病的发生机制提供了参考。     

高温刺激对刺参浮游期幼体存活率及Hsp70表达量的影响

设计不同温度(21.5,26,28和30℃),对刺参(Apostichopus japonicus)囊胚期、原肠期和耳状幼体期幼体进行热激处理,热激45 min后,将幼体在21.5℃条件下继续培养至耳状幼体后期,计算刺参幼体的存活率,并用蛋白杂交方法测定幼体Hsp70的表达量。结果表明,高温刺激对幼体的存活有显著性影响,各时期幼体的存活率均随热激温度的升高而降低,原肠期的存活率要高于囊胚期和耳状幼体时期。原肠期幼体Hsp70表达量要比囊胚期和耳状幼体时期高,这表明在发育过程中Hsp70表达量与幼体存活率具有相关性。     

南移养殖的刺参(Apostichopus japonicus)cDNA文库的构建及原肌球蛋白基因的研究

以南移养殖的刺参为实验材料,采用非均一化的Oliga-dT引物定向克隆技术构建了南移刺参混合组织的cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,cDNA文库的库容量为2.2×107cfu,重组率达95.8%,平均插入片段长度750bp左右。挑取cDNA克隆进行5’端测序,成功测序185个反应,分析得到136个单基因簇(Unigene),其中包括40个重叠群(Contigs)、96个单拷贝EST(Singletons)。结果表明,克隆南移养殖的刺参原肌球蛋白(tropomyosin,Trp)cDNA全长序列为1112bp,ORF编码284个氨基酸,其预测蛋白的分子量为33.27kDa,等电点为4.56。该氨基酸序列与紫石海胆、南极大磷虾、锯缘青蟹、文昌鱼、河蟹、家蚕同源性分别为62%、51%、46%、49%、47%、46%。     

刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)研究刺参高温胁迫下差异表达的基因.分别以高温实验组为检测组(tester)、常温对照组为驱动组(driver),进行正向抑制性消减杂交;以常温组为tester、高温组为driver,进行反向消减杂交,成功构建了刺参正反双向差异消减文库.从两个文库随机挑选384个白斑克隆进行斑点杂交进一步...     

基于FT-IR、GC及核磁共振的仿刺参(Apostichopus japonicus)消化道多糖结构解析研究

仿刺参(Apostichopusjaponicus)因其高营养价值并富含多种生物活性成分,具有重要的经济价值。为了充分利用仿刺参加工下脚料,提高养殖经济效益,本文采用复合蛋白酶解法提取仿刺参消化道多糖,研究了酶解温度、时间、pH及加酶量对仿刺参消化道多糖得率的影响,并通过正交实验对仿刺参消化道多糖提取工艺进行优化,利用DEAE-sepharoseFastFlow层析柱对多糖进行纯化,通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、气相色谱(GC)及核磁共振(13C, 1H谱)对多糖的结构及组成进行分析。结果表明,复合蛋白酶在pH 7,加酶量1.2?104 U/g,温度60℃酶解6h;利用Sevage法脱蛋白提取得到的仿刺参消化道多糖纯度均一,效果最佳。通过FT-IR结果判断其为糖类化合物,含有β型葡萄毗喃糖苷键;利用气相色谱确定该多糖主要由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖六种单糖组成,其摩尔比为1︰32.86︰14.56︰1.66︰0.78︰10.43,其中岩藻糖的含量最高;核磁共振综合分析结果进一步证实仿刺参消化道多糖含有β型毗喃已糖,且主要是以l, 4-糖苷键相连接。     

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis) 热休克蛋白70基因克隆与表达特征研究

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了浙江枝吻纽虫热休克蛋白70(DzHSP70)基因全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR方法,分析了该基因在重金属胁迫下的表达特征。结果表明,DzHSP70cDNA全长2827bp,包括294bp的5’UTR、628bp的3’UTR和编码634个氨基酸残基的1905bp的开放阅读框。HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等特征元件在DzHSP70中高度保守。重金属离子Fe3+、Pb2+和Cd2+均可上调该基因的表达,其中Pb2+的毒理效应最强。研究结果表明DzHSP70可能参与了机体对于重金属的解毒过程。     

刺参(Apostichopus japonicus)EST序列中微卫星分布分析及其标记的筛选

利用微卫星查找软件对现已公布的6632条刺参ESTs的数据库中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行筛选,进而对其微卫星的丰度和分布进行比较研究。共发现微卫星序列416个,占整个ESTs数据库的6.48%;其中含双碱基重复序列146个,数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的65.86%;三、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的26.68%、1.68%、0.24%、5.53%。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列利用Primer软件结合人工方法设计合成引物21对,其中13对有扩增产物且均为多态位点。扩增产物变性聚丙烯酰胺胶电泳,统计每个微卫星标记等位基因数目,计算等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度等统计学指标的评价。结果表明,在13个微卫星位点上,等位基因的数目从3到8不等,等位基因长度从175—382bp,观测杂合度和期望杂合度分别为0.158—0.650和0.198—0.841,所筛选微卫星标记可于遗传分析。     

太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)热休克蛋白70(HSP70)基因克隆及在金属胁迫下的表达分析

热休克蛋白70(HSP70)是生物体内一种重要的机体与细胞保护性蛋白。本文利用RT-PCR以及RACE技术首次克隆获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)HSP70简称Ep.HSP70 c DNA的全长序列,序列全长为2252bp(KY807149),开放阅读框(ORF)长1947bp,编码649个氨基酸,5′端99bp,3’端206bp;预测蛋白分子量为70.81k Da,等电点为5.16,为一种亲水性蛋白,不存在信号肽及跨膜区,含有丰富的α螺旋结构(37.60%),β折叠(18.80%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他甲壳动物的同源基因保守性较高,尤其是HSP70家族典型的结构位点序列在甲壳类动物中具有高度保守性。系统进化分析表明,太平洋真宽水蚤和安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)进化关系最近;桡足类种内同源性要高于虾蟹类,与虾类同源性高于蟹类。荧光定量数据分析表明,不同浓度铜、镉、锌胁迫下太平洋真宽水蚤HSP70基因表达水平具有显著的时间效应与浓度效应的特征,三种金属对Ep.HSP70抑制效应呈现CuCdZn的趋势。Ep.HSP70基因的成功克隆及金属胁迫下的表达分析为深入研究HSP70蛋白生物学功能具有重要意义。     

刺参（Apostichopus japonicus）野生及两代选育群体间遗传变异的微卫星标记研究

应用微卫星DNA技术对野生刺参和两代选育刺参群体遗传多样性进行了研究。9对微卫星引物在三个刺参群体中共扩增获得43个等位基因,每个微卫星座位检测到的等位基因数为2—7个。三个群体的观测杂合度的平均值分别为0．6556、0．6704和0．6148,多态信息含量平均值分别为0．6654、0．5929和0．5275。结果表明...