浙江新昌光唇鱼(Acrossocheilus)CO Ⅱ和D-loop基因克隆及系统发育分析

采用扩增COⅡ、D-loop序列、进行序列比对和系统树分析并结合形态特征观察的方法,研究了浙江新昌光唇鱼(Acrossocheilus)的系统分类和种类鉴定。形态特征结果表明,新昌光唇鱼具有光唇鱼属鱼类的基本特征;扩增得到COⅡ序列全长691bp,D-loop序列全长931—944bp,A+T含量两基因序列都高于G+C(A+T的含量分别为57.30%—57.80%和65.30%—65.90%),G的含量在四种碱基中最低;COⅡ序列有6个碱基位点存在转换,而D-loop则存在多个碱基的转换、颠换、缺失或插入位点。浙江新昌光唇鱼群体内COⅡ、D-loop基因的平均遗传距离分别为0.003、0.005;基于COⅡ和D-loop序列构建的NJ法系统树均显示新昌光唇鱼与温州光唇鱼(A.wenchowensis)形成一个紧密的簇,序列相似性分别为99.94%和99.36%,遗传距离分别为0.000、0.011,未达到种间分化水平(遗传距离大于0.05),表明新昌光唇鱼与温州光唇鱼为同一种,且根据形态特征可以断定为二个不同的地理群体,而D-loop序列因进化速度较快更适于光唇鱼属种内及近缘物种的种间亲缘关系的研究。研究结果既有助于新昌光唇鱼资源的开发利用,又可为研究光唇鱼类的分类提供参考资料。     

光唇鱼( Acrossocheilus fasciatus) 胚胎及仔、稚鱼的发育

采用干法授精方法获得受精卵,在人工培育条件下观察了光唇鱼胚胎及仔、稚鱼发育过程。结果表明,光唇鱼受精卵呈圆球形,沉性、弱粘性。在水温23—25℃下,胚胎发育历时46h45min,经历了胚盘形成、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成和孵化等阶段。在水温24—27℃下,仔、稚鱼发育历时22d,初孵仔鱼具有较大的卵黄囊,胸鳍原基及肛门原基形成;4日龄仔鱼开口摄食,进入混合营养期;7日龄仔鱼卵黄囊消失,营外源性营养,体侧8条横斑形成,各鳍均已出现,进入晚期仔鱼阶段;14日龄仔鱼各鳍鳍条发育基本完成;16日龄仔鱼鳞片开始出现,进入稚鱼期;22日龄稚鱼全身被鳞,进入幼鱼期。     

养殖光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus) 卵巢发育的组织学观察

采用解剖及石蜡切片技术,观察研究了养殖光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)卵巢发育的形态及组织学结构特征。结果表明,第一次性周期内,4—5月龄鱼卵巢处Ⅰ期,内以第Ⅰ时相卵细胞为主;6—18月龄鱼卵巢处Ⅱ期,内以第Ⅱ时相卵母细胞为主,单层滤泡膜形成;19—20月龄鱼卵巢处Ⅲ期,内以第Ⅲ时相卵母细胞为主,双层滤泡膜及放射带形成,胞质内出现液泡及卵黄粒;21—22月龄鱼卵巢处Ⅳ期,内以第Ⅳ时相卵母细胞为主,胞质内充满卵黄粒;23—24月龄鱼卵巢处Ⅴ期,内以第Ⅴ时相卵母细胞为主,滤泡膜脱落;25月龄鱼卵巢处Ⅵ期,内以空滤泡和第Ⅱ、第Ⅲ时相卵母细胞为主。6—7月为主要产卵期,9月产后卵巢恢复至Ⅱ期,12月进入Ⅲ期,并以该期越冬,4月卵巢重新往前发育。光唇鱼属短期分批产卵类型鱼类。     

投喂策略对多纹钱蝶鱼幼鱼生长的影响

为研究投喂策略对多纹钱蝶鱼(Selenotoca multifasciata)幼鱼生长的影响,实验选取初始湿体质量为1.19±0.35 g的多纹钱蝶鱼幼鱼进行养殖,实验为期60 d.1)投喂频率实验:实验设计4组,分别为F1(8:00投喂1次),F2(8:00、20:00投喂2次),F3(8:00、14:00、20:0...     

不同饥饿时间和再投喂对长蛸(Octopus minor)生长及肌肉脂肪酸含量的影响

在17.2—20.8oC条件下,对长蛸[初始鲜重(127.27±12.19)g,初始胴背长(67.23±6.12)mm]进行不同时间(0,3,6,9,12,15d)饥饿处理后再恢复投喂(15d)的实验,研究不同饥饿时间和再投喂对长蛸生长及肌肉脂肪酸含量的影响。结果表明,随饥饿时间的延长,长蛸的成活率、肝体比呈下降趋势,其中饥饿12d后成活率显著降低,饥饿0—3d期间肝体比下降最为显著。恢复投喂后,饥饿时间较长组(9,12,15d)长蛸的肝体比仍显著低于对照组。长蛸的体质量降低率呈现上升趋势,饥饿15d时达到最高值18.15%±4.46%。特定生长率值中,饥饿3d组显著高于对照组,饥饿6d、9d组与对照组差异不显著,饥饿12d、15d组均显著低于对照组。再投喂结束后3d、6d、9d组的鲜重与对照组差异不显著,12d、15d组显著低于对照组。长蛸肌肉脂肪酸中单不饱和脂肪酸(MUFA)的含量,自饥饿6d起随饥饿时间延长表现出显著上升趋势;再投喂后,饥饿12d、15d组饱和脂肪酸(SFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)的值显著高于对照组。综上说明,饥饿3d、6d、9d组长蛸具有完全补偿生长的能力,饥饿12d、15d组个体仅具有部分补偿生长的能力,主要通过增加摄食量来完成其补偿生长。因此,为保证长蛸人工养殖效果,应避免个体饥饿超过9d。     

饥饿和再投喂对千年笛鲷幼鱼消化酶活性的影响

研究了饥饿和再投喂对千年笛鲷(Lutjanus sebae)幼鱼消化酶活性的影响.实验设计分成6组,分别饥饿处理0(对照),2,4,6,9和11 d,然后在饱食的条件下恢复投喂10 d.分别测定饥饿和恢复投喂过程中千年笛鲷幼鱼蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶3种消化酶的活性.结果表明,在饥饿过程中,蛋白酶和脂肪酶活性下降明显,淀粉酶起伏较大;恢复投喂后,蛋白酶和脂肪酶活力与饥饿前相比都有所上升,但蛋白酶活力总体上仍低于同步取样对照组,脂肪酶活力总体上高于对照组水平,淀粉酶活力恢复到对照组水平,并且基本上没有变化.     

周期性饥饿再投喂对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)幼体生长、体组成及氨基酸和脂肪酸的影响

采用持续投喂(对照组C)和周期性饥饿1d再投喂5d(S1F5)、周期性饥饿2d再投喂4d(S2F4)、周期性饥饿3d再投喂3d(S3F3)4种投喂策略,研究了周期性饥饿再投喂对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)幼体(10.16±0.25g)的生长、体组成、氨基酸和脂肪酸的影响。结果表明:S3F3处理组中体重增重率、胴体长增长率及成活率三个指标均分别显著低于对照组C(P0.05),而S1F5和S2F4处理组三个指标均与对照组C差异不显著(P0.05)。另外,随着周期性饥饿时间的延长,体组成水分含量呈显著上升趋势(P0.05),而粗蛋白和粗脂肪含量均呈显著下降趋势(P0.05),灰分含量变化不显著(P0.05)。三个处理组中氨基酸总量(T)、必需氨基酸总量(E)均与对照组C差异不显著(P0.05);EPA、DPA和DHA含量均与对照组C差异不显著(P0.05)。综合上述结果表明,S1F5和S2F4组的曼氏无针乌贼幼体均出现了完全补偿生长,并且对其营养组成没有影响,建议曼氏无针乌贼幼体的最佳投喂模式为周期性饥饿2d再投喂4d。     

不同投喂率对细鳞鲑(Brachymystax lenok)幼鱼生长及体成分的影响

选取同一种进口鳟鱼标准饲料,设1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%共5个投喂率水平,在溶解氧为8.0—8.5mg/L、水温为(16±0.5)℃的流水条件下,对初始体重为5.32—6.43g的细鳞鲑幼鱼进行为期35d的生长实验。结果表明,随着投喂率的增加,相对增重率(WGR)和特定生长率(SGR)先升高后降低,4.0%处理组的这两项指标显著高于其它各处理组(P<0.05),分别为289.82和3.89;饲料转化率(FCE)则呈现逐渐降低趋势,2.0%组的FCE最低,5.0%组最高。随着投饲率的增加,细鳞鲑幼鱼鱼体水分含量呈下降趋势;灰分含量无规律性变化;粗蛋白含量保持在相近水平(除1.0%处理组);粗脂肪含量无规律性变化,但3.0%组显著高于其它各处理组,4.0%组鱼体粗脂肪含量最低。综合衡量WGR、SGR和FCE等指标,认为细鳞鲑幼鱼(5—25g体重)在密度为300尾/m3、水温为(16±0.5)℃流水条件下,最适宜的投饲率为3.0%—4.0%。     

周期性饥饿再投喂对建鲤（Cyprinus carpio var．Jian）生长、体组成、消化酶的影响

采用周期性饥饿再投喂的方法,研究周期性饥饿再投喂对建鲤（1．5±0．2g）的生长、体组成、消化酶的影响。试验分为10个组,共进行60d。结果表明,在相同的饥饿天数下,延长再投喂天数可以使建鲤的增重率逐渐增加,而且S1F4、S2F8、S4F16组的增重率与对照组无显著性差异（P〉0．05）,9个周期性饥饿再投喂组在摄食期...     

饥饿和再投喂对许氏平鲉幼鱼体组分和糖原含量的影响

在水温17.6±0.2℃的条件下,分析了饥饿和恢复投喂对许氏平鲉幼鱼体组分、肌糖原和肝糖原的影响。实验分4组且每组有3个平行,其中饥饿0d组为对照组,即在实验过程中正常投喂;饥饿5d组恢复投喂50d;饥饿10d组,恢复投喂45d;饥饿15d组,恢复投喂40d,实验共进行55d。实验结果表明:在饥饿过程中肌糖原和肝糖原的含量下降,并且与对照组有显著性差异;体组分中粗脂肪的含量也下降而水分和灰分的含量相对增加,粗蛋白含量在饥饿处理时有下降趋势但不明显。实验结束时恢复投喂后各项生化指标均恢复到对照组水平。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢发育中的表达分析

VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。     

三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蜕皮中的表达分析

为了研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE),克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)HMGR基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:KF280756)。该序列全长2575bp,包括一个53bp的5′端非编码区,一个686bp的3′端非编码区和一个长度为1836bp的开放阅读框,编码611个氨基酸。该氨基酸序列与已公布的美洲海鳌虾HMGR氨基酸序列相比一致性达65%,具有Ⅰ型HMGR保守催化区域、两个HMG-Co A结合基序和两个NADP(H)结合基序。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析三疣梭子蟹HMGR基因的组织差异表达及在蜕皮周期中的表达水平变化,结果表明HMGR基因在三疣梭子蟹大颚器(MO)中的表达量最高,在其它组织中表达量均极低;在三疣梭子蟹蜕皮周期中,大颚器中HMGR基因的表达量自A期至D0亚期升至最高,然后下降,至D4亚期最低。验证了大颚器是三疣梭子蟹合成甲基法尼酯的唯一器官,表明HMGR在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要作用。     

红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因克隆及表达分析

本文利用RACE技术克隆获得红鳍笛鲷(Lutjnaus erythropterus)酪氨酸酶相关蛋白1基因全长,并利用生物信息学方法对该基因的m RNA序列特征、氨基酸序列特征、分类及系统发生进行了分析。结果表明,在红鳍笛鲷中,酪氨酸酶相关蛋白1基因含有TYRP1a和TYRP1b两个拷贝,其中TYRP1a序列全长3178bp,开放阅读框(ORF)长1566bp,5?端235bp,3?端1377bp;TYRP1b基因c DNA全长1871bp,ORF区长1656bp,5?端89bp,3?端126bp。序列分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因与其它物种的同源基因保守性较高,尤其是酪氨酸酶基因家族典型的酶活性位点序列在脊椎动物中具有高度保守性。进化分析发现,TYRP1a和TYRP1b基因的种间同源性高于两个基因间的同源性。荧光定量PCR数据分析表明,TYRP1a和TYRP1b基因都在眼睛部位具有最高表达,TYRP1b在黑色皮肤也有较高表达。结果可为进一步阐述TYRP1基因在红鳍笛鲷身体和眼睛部位的色素合成机制提供一定的理论基础。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因的cDNA克隆及表达分析

通过RT-PCR及Smart?TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因cDNA全长序列。该基因cDNA全长1662bp,编码一个由492个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点为6.348,分子量大小为56.68kD。氨基酸序列中含有CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。经氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,与岸蟹(Carcinus maenas)的同源性最高,达到75%。实时荧光定量PCR结果表明,CYP2基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。肌肉注射磺胺嘧啶后,三疣梭子蟹高、中、低三剂量组CYP2基因表达较对照组都有上调,并具有时间差异性,低剂量组表达量逐渐降低,趋于对照组,中剂量组和高剂量组表达量先升高后降低,6h后同一时间点,均是高剂量组表达最高,低剂量组最低。表明磺胺嘧啶可诱导三疣梭子蟹CYP2基因,CYP2基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。     

密斑刺鲀(Diodon hystrix)gnrh基因的克隆及表达分析

密斑刺鲀(Diodonhystrix)不仅具有食用价值,同时也是传统的中药及保健食品,但目前关于密斑刺鲀的生殖内分泌调控研究较少,限制了密斑刺鲀的人工繁育基础理论的发展。总所周知,促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是生殖内分泌调控的关键因子之一。利用转录组分析及分子克隆技术,获得密斑刺鲀促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH) gnrh2和gnrh3基因的cDNA开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)序列,并利用生物信息学的方法,获得密斑刺鲀gnrh2 cDNA开放阅读框共279 bp,可编码92个氨基酸残基;密斑刺鲀gnrh3cDNA开放阅读框共270 bp,可编码89个氨基酸残基。通过系统进化分析表明,密斑刺鲀GnRH与鲀科类的鱼具有较近的亲缘关系。通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)半定量的方法检测gnrh2和gnrh3基因在密斑刺鲀各组织中的分布,结果发现gnrh2和gnrh3基因在脾、鳃和垂体中的表达量较高,而在心脏中的表达量最低。此外,利用实时荧光定量的方法检测了密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在性腺发育不同时期的表达模式,结果显示密斑刺鲀gnrh2基因在不同的性腺发育时期中没有显著性的变化,而gnrh3基因随着性腺发育成熟而不断升高。研究主要获得两个创新性的重要结果:首先是证实了密斑刺鲀存在两种gnrh基因(gnrh2和gnrh3),其次是提示了gnrh3基因可能是密斑刺鲀生殖调控的主要gnrh类型。研究结果可为深入研究密斑刺鲀生殖内分泌调控机理提供研究方向和基础。     

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白基因克隆及Cd~(2+)胁迫下的表达分析

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒和金属元素代谢等生理过程。本研究采用RACE技术,克隆获得了菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白(RpMT)的全长cDNA序列。RpMT的cDNA全长为570bp,编码75个氨基酸,包含15个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构。采用实时荧光定量PCR技术,分析了两种壳色菲律宾蛤仔(白蛤和斑马蛤)RpMT基因在Cd2+暴露后的表达变化。结果发现:Cd2+急性和亚慢性暴露均可导致两种壳色蛤仔消化腺和鳃组织RpMT基因表达量的显著上调;暴露后两种壳色蛤仔鳃组织RpMT基因表达量的增加幅度均高于消化腺组织,且以白蛤鳃组织基因表达水平的上调幅度较高。上述结果表明,RpMT可能在菲律宾蛤仔抵御Cd2+胁迫过程中发挥了重要作用。     

圆斑星鲽(Verasper variegatus)wtl基因的克隆与表达分析

圆斑星鲽（Verasper variegatus）雌鱼生长快,成熟雌鱼个体大小是雄鱼的2倍以上,开展性别相关基因的功能研究,对于探究圆斑星鲽性别决定机制,建立单性培育技术具有重要意义。本研究获得了wt1a及wt1b两个同源基因,wt1a基因全长为3263bp,预测开放阅读框（ORF）长为1245bp,编码415个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长372bp和1640bp;wt1b基因全长为2312bp,预测开放阅读框（ORF）长为1281bp,编码427个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长369bp和659bp。wt1a基因编码氨基酸分子量为46.2kDa,理论等电点为9.24,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,编码KTS三肽;wt1b基因编码氨基酸分子量为46.95kDa,理论等电点为8.99,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,并且编码KTS三肽。基因表达结果表明：wt1a和wt1b基因主要在圆斑星鲽性腺中表达,精巢的表达高于卵巢,肾脏的表达量显著高于其他组织,推测wt1a基因和wt1b基因在性腺和肾脏发育过程及功能方面均发挥重要作用;在早期发育阶段,wt1a基因在原肠期之前微弱表达,从原肠早期开始逐渐上升至神经胚期表达量达到最高,之后逐渐下降,直至孵化阶段,推测wt1a基因在圆斑星鲽原始生殖细胞分化过程及性腺发育中发挥重要作用。     

栉孔扇贝BI-1基因的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR和RACE技术首次获得了栉孔扇贝(Chlamys farreri)BI-1基因(Cf BI-1)c DNA全长序列,长度957bp,5′和3′非编码区长度分别为48bp和195bp,开放阅读框为714bp,预测编码一个含有237个氨基酸的蛋白质,分子量为27k Da;结构预测显示,Cf BI-1蛋白包含6个跨膜结构域。同源和分子进化聚类分析显示,Cf BI-1蛋白序列与其他一些物种中的BI-1蛋白序列相似性很高,表明BI-1具有很高的保守性。通过荧光定量PCR的方法检测了Cf BI-1 m RNA在栉孔扇贝正常组织中和在干露、脂多糖以及扇贝急性病毒性坏死症病毒刺激之后的表达水平的变化。结果表明,Cf BI-1在栉孔扇贝各组织中广泛分布,其中闭壳肌中的表达量最高,血淋巴中的表达量最低。在干露和病毒刺激以后,Cf BI-1基因表达水平较对照组都有显著上调(P0.05),表明Cf BI-1基因可能参与了干露刺激和急性病毒性坏死症病毒感染后的细胞应激响应及其诱导的细胞凋亡过程。综合上述分析,我们认为Cf BI-1基因在栉孔扇贝细胞凋亡调控过程中可能起到重要作用,可为栉孔扇贝凋亡相关基础研究提供参考。