一种甲壳动物血细胞分化因子性质的初步分析

血细胞是甲壳动物的免疫细胞,负责抵御和清除入侵的病原。虽然血细胞在甲壳动物的整个生命周期中都需要不断更新,但人们对甲壳动物造血机制的了解却十分有限。前期研究发现利用红螯螯虾的肌肉提取液可以诱导体外培养的造血组织细胞定向分化为颗粒细胞,但其中起到诱导分化作用的因子尚未明确。本研究对该未知血细胞分化因子的基本性质进行了分析。首先,我们制备了红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）、中华绒螯蟹(Erinocheir sinensis)、东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)、红石斑鱼(Epinephelus goreensis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和疣荔枝螺(Reishia clavigera)的肌肉提取液,测试其诱导螯虾造血组织细胞分化的能力。结果表明,以上各种动物的肌肉提取液均可诱导原代培养的螯虾造血组织细胞向颗粒细胞分化,说明该血细胞分化因子普遍存在于这些动物的肌肉组织中。进一步我们以螯虾肌肉提取液为实验对象,分析了血细胞分化因子的热稳定性、溶解性、带电性、对蛋白酶的耐受性以及分子量大小。结果发现该血细胞分化因子易溶于甲醇,呈电中性,具有良好的热稳定性,且可耐受蛋白酶处理,分子量小于1 kDa。因此,螯虾肌肉提取液中可诱导造血组织细胞分化为颗粒细胞的血细胞分化因子是一种广泛存在的小分子类物质。本研究结果有助于后续对该因子的分离纯化和鉴定。     

大泷六线鱼脾脏细胞体外培养的研究

应用植块法,比较大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)脾脏细胞在2种基础培养基和3个胎牛血清浓度下的体外培养效果。根据细胞的迁出、贴壁、细胞种类以及生长状况,得出大泷六线鱼脾脏细胞适宜的体外培养体系为:MEM+15%胎牛血清、pH7.2~7.4、20℃;培养产物由6种细胞组成,其中C型细胞培养120 d以上依然状态良好,并进行了传代培养。培养启动12 d后,C型细胞层上出现造血灶,造血灶细胞最长可以维持50 d以上。本研究为大泷六线鱼脾脏细胞系的构建和脾脏功能的研究奠定了基础。     

白芍(Radix paeoniae alba)提取物对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)造血组织发育及造血因子Astakine的影响

血淋巴细胞在甲壳动物免疫反应中起着非常重要的作用,其主要由造血组织(Hematopoietic tissue, HPT)生成并随着开管式循环分布到身体各处。到目前为止,还没有相关研究表明甲壳动物造血组织是否受草本植物的影响。本研究以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为对象,利用荧光定量PCR、免疫荧光和组织化学等技术,初步探索了白芍(Radix paeoniae alba)提取物对中华绒螯蟹造血组织和造血因子Astakine的影响。结果显示,在原代培养的造血组织细胞中添加终浓度为0.85mg/mL的白芍提取物后,造血因子Astakine mRNA的表达量显著上调(P0.05)。进一步制备含1%白芍提取物的中华绒螯蟹饲料并进行饲喂实验,结果显示饲喂含白芍提取物饲料的中华绒螯蟹造血组织的Astakine mRNA的表达量较饲喂前上调了10.5倍,要高于对照组。免疫荧光结果同样表明,饲喂含白芍提取物饲料后中华绒螯蟹造血组织的Astakine蛋白荧光信号也要强于对照组。通过造血组织的形态学观察和造血组织体重百分比的检测,我们发现白芍组中华绒螯蟹造血组织含有较多卵形小叶,且造血组织体重百分比较饲喂前增加了6.64%,而对照组仅增加1.6%。免疫保护率实验显示,在脂多糖急性刺激下,白芍添加组的中华绒螯蟹的存活率(77.5%)要高于对照组(57.5%)。综上所述,白芍提取物可以促进中华绒螯蟹造血因子的表达和造血组织的发育,从而提高中华绒螯蟹的免疫调节功能。     

不同培养模式对雨生红球藻细胞绿色生长以及虾青素积累的影响

研究了分批培养、pH反馈补料培养、定量补料培养与培养基完全更换培养4种培养模式对雨生红球藻绿色生长以及虾青素积累的影响。结果表明:当在绿色细胞阶段采用培养基完全更换的培养模式,能够有效的促进雨生红球藻细胞的分裂,同时藻细胞保持了较高活性。其中培养9d后藻细胞数目达到8.60E+05个/mL,游动细胞所占比例达到98.26%,细胞干重为1.12g/L,而且胁迫条件下培养10d后虾青素的产量达到53.21mg/L,明显高于其他培养模式。因此培养基完全更换培养是一种适合雨生红球藻生长与积累虾青素的培养模式。     

适用于甲壳动物细胞的缓冲液配方优化

目前,在对螯虾、对虾等甲壳动物细胞的研究中,广泛采用了适用于哺乳动物细胞或昆虫细胞的各类缓冲液和培养液。但是,甲壳动物体液的渗透压与哺乳动物等有很大差异,直接沿用哺乳动物等细胞的缓冲系统不合适。本研究首先测定了红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii),与饲养在盐度30海水中的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的血清渗透压,其值分别为(409±12)、(465±8)、(704±15) mOsmol/kg。随后,通过调节NaCl的浓度来改变抗凝剂和磷酸盐缓冲液(PBS)的渗透压,使其与相应动物的血清渗透压相等。优化后适用于红螯螯虾的抗凝剂和PBS中,NaCl的浓度分别为70、200 mmol/L;适用于克氏原螯虾的抗凝剂和PBS中,NaCl的浓度分别为100、230 mmol/L;适用于凡纳滨对虾的抗凝剂和PBS中,NaCl的浓度分别为220、360 mmol/L。进一步比较了3种动物的血细胞在不同渗透压缓冲液中的存活情况。结果表明,红螯螯虾、克氏原螯虾以及凡纳滨对虾这3种甲壳动物的血细胞在未优化的PBS中处理15 min,死亡率就分别达到4.5%、2.0%以及10.0%左右;然而当使用优化后的PBS进行处理时,死亡率则分别降至1.0%、1.0%以及2.0%左右。而血细胞在抗凝剂中的死亡率则较低(<2.0%),优化前后没有显著差异。综上,在甲壳动物活细胞实验中采用优化后的缓冲液,能改善细胞的状态,提高实验的准确性。     

2种不同体色的克氏原螯虾卵巢发育及生长特性研究

本文研究了2种不同体色的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)即青壳原螯虾和红壳原螯虾的生理指标和卵巢发育差异,对同规格不同体色的克氏原螯虾性腺发育、生长速度进行比较分析,以及比较不同温度下同规格的青壳原螯虾生长发育变化。研究结果表明,青壳雌虾卵巢处在I～III期,多数为Ⅰ、Ⅱ期,而同规格的红壳雌虾卵巢各期均出现,Ⅱ、Ⅲ期较多。体质量8g左右的虾苗在30d的饲养过程中,红壳原螯虾的增重率仅为青壳原螯虾的67%,青壳原螯虾的脱壳率比红壳原螯虾高出40%,平均脱壳周期比红壳原螯虾短9d。体质量10g左右的青壳原螯虾在水温(28±2)℃,无遮蔽物的条件下饲养30d后体色由青色转为红色,而相同规格的青壳原螯虾在(18±2)℃的水温,无遮蔽物条件下生长30d后体色仍保持为青色。     

文昌鱼鳃组织原代培养

采用组织块培养法培养文昌鱼(Branchiostoma belcheri japonicum)鳃细胞,使用L15,M199,Eargle'sMEM为基础培养基,加入一定量的NaCl及5%,10%,20%等不同体积分数的牛血清.经条件优化后得到最适合的培养条件为2L15+20%FBS+0.45%NaCl,在26～28℃条件下培养,组织块贴壁后12 h内就有至少4类上皮样细胞从中迁移出来,这些细胞在前3天迅速增殖,到第6天基本上达到平稳期,往后细胞开始凋亡,最长可以存活近两个星期.鳃细胞的原代培养为文昌鱼细胞体外培养的深入研究提供了实验依据.     

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

Cu2+和Zn2+对罗氏沼虾体外培养肌细胞的影响

研究了L-15和M199两种培养基对体外培养罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肌细胞生长的差异。结果表明，L-15较M199更有利于罗氏沼虾肌细胞的生长。分别测定了不同浓度的Zn^2 (0～160ug／L)和Cu^2 (0～10ug／L)对罗氏沼虾离体培养肌细胞的影响，通过MTT法测定肌细胞的增殖．NBT法测定肌细胞活性氧的产生，结果表明，Zn^2 浓度为80～120ug／L时细胞的增殖效果较好，细胞内活性氧的产生最少；Cu^2 浓度为8ug／L时细胞的增殖达到最大，活性氧产生最少。     

菲律宾蛤仔外套膜组织原代培养的初步研究

用E-MEM培养基对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum Adams et Reeve)的外套膜组织进行了原代培养。实验结果表明,在E-MEM培养基中添加L-谷氨酰胺、小牛血清、水解乳蛋白等成分,温度为26～27℃,pH为7．4的条件下,适合外套膜细胞的生长,培养3d时外套膜组织块周围出现迁出的细胞,培养至第8天时形成单层增殖细胞。     

雨生红球藻细胞形态转换和藻落形成差异研究

基于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)培养过程中游动细胞和不动细胞的形态差异与转换,对比研究了两种细胞类型在离心收集与藻落形成效率上的差异。结果表明,雨生红球藻SCCAP K-0084在BYA培养基中培养4~6 d和9~12 d分别以绿色游动细胞与绿色不动细胞为主;早期游动细胞离心收集需要更高的离心力,但500~1 000 g离心5 min可以在不影响细胞存活率的情况下有效收获所有类型细胞;相比于传统直接涂布法,双层琼脂平板法可有效提高平板藻落形成效率,且游动细胞藻落形成效率比不动细胞藻落形成效率更高。TAP培养基由于藻落形成效率较低并不适合于雨生红球藻平板培养与筛选,自养型培养基虽然具有较好的藻落形成效率但是藻落形成速度较慢,相比而言,BYA培养基藻落形成效率较高且生长速度快,更适合用于雨生红球藻细胞的后期平板培养与筛选过程。     

假微型海链藻的培养条件研究

假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)被广泛应用于基础研究、水产养殖以及生物质能开发。本文对浙江沿岸海区分离的一株富含中性脂的假微型海链藻人工培养条件进行了研究,分别就光温盐、氮磷以及摇瓶强度对细胞增殖的影响进行了分析,以期为该藻的大量培养提供参考。结果显示:(1)该藻盐度适应范围广,培养在盐度为10~45海水中,细胞增殖率没有显著差异,易于培养。温度是改变该藻细胞增殖速率的主要因子,22~25℃之间的温差即显著改变增殖速率,光照与温度的协同作用也发生改变:25℃下,增殖速率随光照增加而增加,22℃下,光强差异的作用则消失。两个温度下,较低光照(2000 lx)利于该微藻的稳定增殖。(2)一次培养过程中,该藻对氮的吸收比对磷的吸收迅速,指数生长期对氮吸收显著增加;缺氮强烈抑制细胞分裂和光合潜能(Fv/Fm)。当氮源充足磷限制胁迫时,该藻仍有细胞分裂,并在增殖期能维持与对照组一样的光合潜能。(3)适度摇瓶强度比完全静置能促进对该藻的培养效率,但过度摇瓶不利于该藻细胞分裂。     

中华鲟(Acipenser sinensis)脑垂体的形态和ACTH细胞定位

为研究中华鲟(Acipenser sinensis)神经内分泌系统的基本结构和功能,本文对中华鲟脑垂体的组织形态进行了观察,结果表明中华鲟的神经垂体较小,腺垂体可分为前、中和后腺垂体三部分,神经垂体形成分支插入后腺垂体。中华鲟垂体还有一个特点是有分支的垂体裂。前腺垂体位于垂体前侧,细胞间隙大,细胞分散呈窦状。中腺垂体细胞间隙小,细胞密集呈条索状,嗜酸性细胞和嗜碱性细胞区分明显。后腺垂体包围在神经垂体周围。腺垂体中有长且分支的垂体裂,腺垂体形成许多突起深入其中,垂体裂周围的细胞密集,染色深,排列成类似上皮组织的形态。免疫组化结果表明,中华鲟脑垂体ACTH细胞主要分布于后腺垂体。ACTH的前体基因是POMC,RT-PCR证明其主要分布在脑垂体中,在体内其他组织中基本检测不到。编码ATCH的片段位于POMC中最保守的区域。预测发现POMC基因有一个26氨基酸的信号肽,将不带信号肽的POMC基因插入表达载体。再转染HELA细胞POMC主要在细胞质中表达,而带有信号肽的POMC蛋白在细胞内很少,推测可能分泌到胞外,信号肽对POMC表达和功能发挥起重要作用,本研究结果可为该基因在中华鲟神经内分泌研究中提供参考。     

坛紫菜叶状体营养细胞与生殖细胞叶绿素荧光特性比较

利用叶绿素荧光技术对坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶状体营养细胞和生殖细胞的光能利用特性进行了比较。结果表明:坛紫菜叶状体营养细胞和雌性生殖细胞的实际量子效率(ΔF/Fm′)差异不明显,但显著高于雄性生殖细胞;快速光曲线测定表明雌、雄藻体营养细胞的最大相对电子传递速率(rETRmax)相近,但显著高于雄性生殖细胞;不同生殖细胞半饱和光强(Ik)无显著差异;在生长光强下,营养细胞和雌性生殖细胞rETR、光化学猝灭(qP)和非光化学猝灭(NPQ)差异不明显,而雄性生殖细胞rETR、qP等荧光参数均显著低于营养细胞和雌性生殖细胞。本文表明坛紫菜叶状体营养细胞和雌性生殖细胞具有较高的光能利用能力,能够将吸收的光能多数用于电子传递,而雄性生殖细胞对光能的利用能力较低。     

颗石藻Pleurochrysis carterae形成休眠体的环境诱因分析

利用实验生理生态学方法对Pleurochrysis carterae种群增殖过程中出现丝状体的环境诱因进行了研究,从营养胁迫、钙化抑制胁迫、低温胁迫以及外源α-酮戊二酸的影响等几个方面,探讨了环境因子对P.carterae细胞休眠的诱导作用。结果表明,氮营养盐水平在P.carterae形成丝状体过程中有重要的作用,氮缺乏和氮限制会明显诱导丝状体的早期大量形成,即细胞快速进入休眠期。磷缺乏和磷限制对颗石藻丝状体形成的短期诱导作用不显著。正常钙化的颗石藻在缺钙环境中钙壳逐渐脱落、细胞裸露、没有种群增殖、不形成丝状体。低温胁迫下,颗石藻细胞不分裂,但细胞维持游泳的钙化单细胞状态,不形成丝状体。外源α-酮戊二酸对颗石藻形成丝状体具有浓度相关的效应,小于1.2mmol/L的浓度抑制丝状体的早期发生;1.2mmol/L及以上浓度的α-酮戊二酸能诱导丝状体早期发生。     

黄丝藻细胞代谢物提取方法的比较研究

利用代谢物组学技术有助于更为深入地了解不分枝丝状微藻黄丝藻细胞的生物学特性。本研究比较了3种黄丝藻细胞破碎方法(冻融法、超声破碎法、液氮研磨法)以及基于气相色谱-质谱联用技术的3种黄丝藻代谢物提取系统(冷甲醇、热乙醇、甲醇/氯仿法),以期为黄丝藻细胞的代谢组学分析奠定基础。结果显示:液氮研磨法处理下的黄丝藻细胞破碎效果最佳;根据提取到的代谢物的种类角度出发,冷甲醇法的提取效果要明显优于其他2种提取方法。在黄丝藻细胞中共检测到40种代谢物,包括9种氨基酸、17种有机酸、12种糖类和2种醇类物质。     

利用实时荧光定量PCR法测算红螯螯虾实体组织的细胞数量

螯虾是重要的水产养殖动物,也是研究甲壳动物疾病与免疫的一个良好模型.在研究不同组织的功能及受病原感染的影响时,需要了解组织内的细胞数量.但是,目前常用的细胞计数方法仅适用于单细胞悬液,无法用于实体组织.本研究以红螯螯虾( Cherax quadricarinatus)为对象,建立了基于基因拷贝数定量分析的实体组织细胞数...     

斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)血细胞发生及外周血细胞化学染色观察

通过Wright-Giemsa染色对斜带髭鲷[Hapalogenys nitens (Richardson)]的头肾、体肾、脾脏、肝脏四组织涂片、印片的观察,发现其头肾、体肾、脾脏是其主要的造血器官。头肾能发育生成各类型血细胞,体肾能生成红细胞和粒细胞,脾脏能生成淋巴细胞和红细胞。肝脏中未发现幼稚型血细胞。血细胞发生大致经过原始、幼稚和成熟三个阶段。细胞化学染色显示:外周血细胞中,除淋巴细胞外,均有糖原;嗜中性粒细胞含有ACP、ALP、NACE、αNAE和POX;嗜酸性粒细胞含有ACP、NACE和POX;单核细胞含有ACP、αNAE和POX;小淋巴细胞有ACP。研究发现斜带髭鲷是一种抗病能力较强的鱼类。血细胞组织化学染色可作为斜带髭鲷疾病诊断的辅助手段。     

红球藻藻株对光强适应及在工程培养中的应用

于2007～2008年在云南楚雄,利用叶绿素连续荧光分析等技术方法,对比研究了3株雨生红球藻藻株(Haematococcus pluvialis)(H_0、H_2、H_3)不同类型细胞对光强适应能力和光化学机制、生长速率和虾青素累积情况,对比研究了红球藻细胞转化过程的光化学特性与能量分配机制。结果表明,3株雨生红球藻游动细胞、绿色不动细胞和红色不动细胞光合作用对光强需求存在明显差异性,其中绿色游动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、1000、750 μmol/(m~2·s),绿色不动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、750、500 μmol/(m~2·s),而红色不动细胞H0、H_2和H_3的光饱和点分别为500、750、500 μmol/(m~2·s)。上述数据意味着红球藻光合作用对光强需求以游动阶段细胞最高,其次为绿色不动细胞,而红色不动细胞对光需求最弱;3株红球藻光合作用对光强需求的顺序为H_2H_0H_3。从实际培养效果来看,H_0藻株游动细胞在9月、11月到次年5月生长最好,其中4月、11月比生长速度为藻株H_3的2.19倍和2.17倍,而在6～8月和10月份中,藻株H_2生长比较迅速,但是藻株之间差异性相对较小。针对3株红球藻虾青素累积而言,1～2月、4月、6月、9月、11～12月藻株H0的虾青素含量最高,3月、5月更适宜H_3积累虾青素,其余7～8月和10月H_2藻株积累虾青素更多。综合雨生红球藻细胞生长和虾青素累积二个决定产量的主要因素,作者认为,在秋末、冬、春和夏初等温度和光照相对较低季节,选择藻株H_0规模化培养可获得更好的生产效果,而在光照较强、温度较高和多雨的夏季和秋初季节,应选择藻株H_2培养产量更高。     

Effects of virus infection on expression of cell cycle regulatory proteins in the unicellular marine algae Emiliania huxleyi

The authors have investigated the biochemical events by which marine algal virus infection induces cell cycle arrest. The key G₂/M-phase regulatory proteins are analyzed by immunobloting in unicellular Emiliania huxleyi, suggesting that virus induced cell cycle arrest is related with virus''s effect on cyclins and cyclin dependent kinases. E. huxleyi virus (EhV) represses Cdc2/cyclinB complex activity by inhibiting the activity of Cdc2 kinase in a phosphorylation-related manner, blocking host cells G₂/M checkpoint. Dephosphorylated/inactive Cdc25C combined with up-regulation of Wee1 expression at early infect period appears to be important mechanisms by which EhV represses Cdc2/cyclinB complex activity that is required for entry into M phase. This study has allowed us to confirm that algal virus infection leads to selective activation or inhibition of certain cell-cycle factors, which may play a significant role in establishing a more efficient environment for viral gene expression and DNA replication.