抗生素对浒苔形态及共附生细菌多样性的影响

本文研究了3种抗生素联合处理黄海绿潮浒苔(Ulva prolifera)形态及共附生细菌多样性的影响。将浒苔放散的配子加入到含有3种广谱抗生素(青霉素G、硫酸新霉素、多黏菌素B)的培养液中进行培养, 与对照组相比, 发现浒苔幼苗生长速度缓慢, 且细胞变小, 藻体无法形成正常形态。进一步采用16S rDNA高通量测序分析抗生素处理藻体前后的共附生细菌多样性, 发现抗生素处理后浒苔共附生细菌丰富度和多样性降低, 其中Maribacter丰度降低。将藻体与形态发生化合物thallusin(Maribacter spp. 提取物)共培养, 发现thallusin可促进藻体形态恢复和生长, 推测抗生素可通过抑制Maribacter等细菌从而影响浒苔形态和生长, 这将为浒苔共附生细菌功能的深入研究奠定一定基础。     

浒苔(Ulva prolifera)核糖体基因簇单元全长序列的克隆与分析

核糖体基因簇单元全长序列对于藻类分子鉴定与分类具有重要意义,而浒苔(Ulva prolifera)作为形成我国黄海绿潮的主要物种,其核糖体基因簇单元全长序列的克隆还未见研究报道。本研究通过分子克隆技术成功扩增了浒苔的核糖体基因簇单元全长序列。浒苔核糖体基因簇单元全长序列为8 948 bp,其中18S rDNA 1 760 bp,28S rDNA 3 259 bp,ITS1 205 bp,5.8S rDNA 160 bp,ITS2 176 bp和IGS 3 388 bp。对各部分序列的碱基组成进行分析后,我们发现ITS1,ITS2和IGS序列对胞嘧啶具有明显的偏好性,而18S rDNA和28S rDNA序列对鸟嘌呤具有明显的偏好性。浒苔核糖体基因簇单元全长序列的GC含量为54.12%,其中ITS1、ITS2和IGS序列的GC含量比保守序列的GC含量高,这表明内转录单元间隔区序列和基因间间隔区序列比保守序列变异率更高,进化速率更快。另外,IGS序列中发现大量简单的直接重复序列、串联重复序列、短对称序列和回文序列。浒苔核糖体基因簇单元全长序列可为其分类及分子鉴定提供有效的工具。     

缘管浒苔5.8SrDNA及其转录间隔区的序列测定及分析

利用PCR扩增、克隆和测序的方法对青岛市红岛虾池生长的缘管浒苔(Enteromorpha linza)的5.8S rD-NA及其转录间隔区ITS序列进行了分析,并依据ITS序列构建了浒苔属不同种之间的进化树。结果表明,获得了核糖体DNA完整的ITS和5.8S rDNA序列,ITS1为195 bp,5.8S rDNA为155 bp,ITS2为184 bp,总长度GC含量为63%。缘管浒苔与浒苔和曲浒苔的序列差异百分率较小,分别为2.4%和4.6%,与(U.olivascens)的序列差异百分率最大,为16.7%。Kimura-2参数遗传距离结果表明缘管浒苔和浒苔的遗传进化关系较近。     

烟台海域暴发浒苔ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

以烟台海域引发"绿潮"的浒苔为研究对象,采用PCR技术扩增出浒苔的ITS-1、5.8SrDNA及ITS-2片段,将扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体,筛选阳性克隆进行序列测定。结果表明,浒苔的ITS-1序列长度为195bp,5.8S序列为155bp,ITS-2序列为181bp,该序列与浒苔属的多种物种ITS序列具有很高的同源性,在ITS-1区、5.8SrDNA区和ITS-2区仅存在4个转换/颠换位点。结合GenBank注册序列和本研究的结果发现,单纯依靠ITS序列并不能对浒苔属种类进行有效的分类鉴定。     

基于浒苔暴发海水池塘的微生物生态特征研究

为研究浒苔对海水养殖环境微生物生态的影响,采用Illumia高通量测序技术测定冬季垦区进水区、浒苔暴发的池塘和排水区水体以及底泥中菌群结构,分析进水区、池塘养殖区和排水区的环境微生物结构演变过程。结果表明:（1）γ-变形细菌、α-变形细菌、放线菌、拟杆菌和δ-变形细菌为海水养殖区的优势细菌门类;（2）进水区水体和底泥微生物种类和多样性指数均高于浒苔池塘和排水区;浒苔暴发的池塘和排水区微生物群落结构较为相似;（3）浒苔池塘的水体微生物以异养细菌为主,底泥以脱硫杆菌等厌氧细菌为主,增加了底泥潜在产生硫化氢的危害;（4）进水区水体含有丰度较高的弧菌和鱼立克次氏体等条件致病性病原菌,而浒苔池塘中含量较低,说明浒苔对弧菌等有一定的抑制作用;但浒苔暴发的池塘和排水区中另一种潜在致病菌黄杆菌类的丰度较高,养殖品种务必防患此类病菌感染疾病的发生。本文从微生态学角度全面揭示浒苔对近岸海区、海水池塘和排水区微生态演变过程的影响,发现了浒苔具有抑制和增加不同致病菌的双重作用,这对水产养殖有一定指导,也为浒苔发生原因、预报、预防等研究提供一定理论参考。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测扁浒苔(Ulva compressa)的研究

本研究将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的可视化检测方法结合,建立了扁浒苔(Ulva compressa)的LAMPLFD快速检测技术。该方法以扁浒苔的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)序列为检测靶标,设计了3对特异性引物(其中,上游内引物由生物素标记)和1条异硫氰酸荧光素标记的探针。结果表明,LAMP最适反应温度为63°C,扩增时间为60 min,从核酸扩增到LFD结果判读需70 min。利用LAMP-LFD可特异性检出扁浒苔,对浒苔、曲浒苔、缘管浒苔和孔石莼等石莼属绿藻以及塔玛亚历山大藻、无纹环沟藻、东海原甲藻、锥状斯克里普藻和赤潮异弯藻等常见微藻的检测结果为阴性。该方法最低可检测到0.1 pg的扁浒苔基因组DNA,是以Uco ITS-F3和Uco ITS-B3为特异性引物的PCR方法的100倍。对实际样品的检测结果表明,LAMP-LFD方法检测扁浒苔与传统的形态学观察的结果一致。因此,该方法可快速、特异地检测出扁浒苔,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有潜力成为扁浒苔现场检测的常规技术手段。     

一株抑制浒苔生长海洋细菌的分离与鉴定

从青岛近海海泥中分离了57 株细菌, 通过毒性实验, 得到了一株对浒苔具有较强毒性的细菌EP23。对该菌株进行了菌落、菌体形态学观察、生理生化特征分析及16S rDNA 序列分析, 鉴定该菌为弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）。该菌培养液高速离心的上清液对浒苔具有较强毒性, 表明弯曲芽孢杆菌EP23 是通过...     

大型海洋绿藻5.8S rRNA基因序列及系统发育分析

采用PCR方法,将扩增的产物直接测序,测定了孔石莼Ulva pertusa和浒苔Enteromorpha prolifeFa的5．8S rRNA基因序列,与肠浒苔、扁浒苔、缘管浒苔、礁膜、北极礁膜、袋礁膜和格氏礁膜等7种已知的大型海洋绿藻的同一基因序列合并进行比较,分析了核苷酸序列差异和碱基替换特点,并构建系统发生树。结果表明,浒苔和孔石莼的颠换率为0．690％,小于浒苔与肠浒苔、扁浒苔、缘管浒苔的颠换率;且浒苔与孔石莼之间的Kimura双参数距离也小于浒苔与肠浒苔、扁浒苔以及缘管浒苔之间的平均Kimura双参数距离。相对于浒苔属的其他物种,浒苔与孔石莼的亲缘关系更近。在构建的系统发生树中,缘管浒苔与孔石莼聚为一类,表现出与石莼属物种更近的亲缘关系。     

弧菌16S rRNA基因特异引物设计及海洋弧菌菌群结构分析

弧菌是海水中最常见的细菌类群之一。弧菌属的一些种是致病菌,能引起海洋生物弧菌病,给养殖业造成损失。根据已有弧菌16S核糖体RNA基因(16S rDNA)序列,设计了3条弧菌属特异引物VF169、VR744和VR1150,与细菌16S rDNA通用引物VF27一起,组成VF169/VR744、VF169/VR1150和VF27/VR744 3引物对。从海水中直接提取浮游生物总DNA,用VF169/VR744,VF169/VR1150和VF169/VR744(巢式)以及VF27/VR744引物分别扩增弧菌16SrDNA片段并克隆,分别构建了弧菌16S rDNA片段变异类型文库。从各文库中分别随机选取一定数量的克隆测序,共获得72条序列。系统学分析表明所有72个序列都与已知的弧菌属细菌的序列聚类,具有很高的相似性,证明所设计的引物能用于海水样品弧菌菌群分析。另外,VF27/VR744既具有对海洋弧菌的高度特异性,也具有恰当的海洋弧菌覆盖面,是1对选择扩增海水中弧菌16S rDNA的较理想引物。从获得序列的分布情况看,胶州湾存在较高的弧菌多样性,其中,类灿烂弧菌菌群(Vibrio splendidus-related group)是优势类群。     

扁浒苔PCR 快速检测方法研究

扁浒苔(Ulva compressa)能够导致绿潮灾害,对其开展快速检测技术研究是预防和控制其危害的重要技术手段。根据石莼属不同种类核糖体基因转录间隔区域(ITS)的序列设计了一对检测扁浒苔的特异性引物,并对其反应条件和体系进行了优化。PCR特异性检测结果表明,供试扁浒苔均扩增出与预期大小相一致的330 bp产物,而对缘管浒苔(Ulva linza)、浒苔(U.prolifera)、曲浒苔(U.flexuosae)、孔石莼(U.pertusa)的检测结果全为阴性。PCR灵敏度试验表明,该PCR体系最低可以检测到10 pg的扁浒苔DNA模板。本快速检测方法为扁浒苔的早期识别与有效治理提供了科学依据,对相关扁浒苔产业和生态学等研究也具有一定参考意义。     

紫菜养殖筏架上定生浒苔对黄海绿潮的贡献

Green tides caused by the unusual accumulation of high floating Ulva prolifera have occurred regularly in the Yellow Sea since 2007. The primary source of the Yellow Sea green tides is the attached algae on the Pyropia aquaculture rafts in the Subei Shoal. Ulva prolifera and Blidingia(Italic) sp. are the main species observed on Pyropia aquaculture rafts in the Subei Shoal. We found that U. prolifera has strong buoyancy and a rapid growth rate, which may explain why it is the dominant species of green tides that occur in the China's sea area of the Yellow Sea. The growth rate of floating U. prolifera was about 20%–31% d–1, which was much higher than Blidingia(Italic) sp. There were about 1.7 × 10~4 t of attached algae on the Pyropia aquaculture rafts in May 2012. We found that 39% of attached algae could float when the tide rose in the Subei Shoal, and U. prolifera accounted for 63% of the floating algae. Our analysis estimated that about 4 000 t of attached U. prolifera floated into the surrounding waters of the Subei Shoal during the recycling period of aquaculture rafts. These results suggest that the initial floating biomass of large-scale green tides in the Yellow Sea is determined by the U. prolifera biomass attached to Pyropia aquaculture rafts, further impacting the scale of the green tide.     

不同产地浒苔对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响

为探究不同产地浒苔型饵料对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响,本实验将青岛浒苔与宁波浒苔的干粉与海泥分别按一定质量比例混合,开展刺参饲喂实验,并与刺参天然饵料马尾藻进行对比。结果表明,青岛浒苔饵料和马尾藻饵料喂养的刺参的粗蛋白含量分别为14.31%±0.10%和15.43%±1.41%,显著高于宁波浒苔饵料(11.17%±0.63%),粗脂肪和灰分含量无显著差异;青岛浒苔组、宁波浒苔组和马尾藻组的增重率分别为22.65%±5.68%、3.03%±1.17%和20.47%±2.01%,特定生长率分别为(1.44±0.33)、(0.21±0.08)、(1.33±0.12)%/d,青岛浒苔组和马尾藻组刺参的增重率和特定生长率显著高于宁波浒苔组;青岛浒苔组、宁波浒苔组和马尾藻组刺参肠道淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和纤维素酶活力无显著差异;马尾藻组刺参体腔液碱性磷酸酶活力为(17.57±4.56)金氏单位/100mL,显著高于青岛浒苔组[(5.56±1.32)金氏单位/100mL]和宁波浒苔组[(2.83±0.75)金氏单位/100mL],超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶活力无显著差异。由此可见,绿潮暴发时,通过打捞浒苔用以配制刺参饵料,既有助于缓解绿潮的生态灾害,又能够补充刺参饵料来源,具有广阔的生态效益和市场前景,但是其营养成分影响因素较为复杂,配制饵料时应充分考虑不同品种、采集时间和生长地点的差异,并通过一些前处理手段充分发挥浒苔的饵料价值。     

EST-SSR标记的开发及其在南黄海浒苔研究中的应用

Ulva species can grow rapidly in nutrient-rich habitats causing green tides and marine fouling. A more complete understanding of the reasons behind these outbreaks is urgently required. Accordingly, this study attempts to use microsatellite markers based expressed sequence tag（EST） to analyze the genetic variation of several Ulva prolifera populations in the South Yellow Sea of China. Two hundred and thirty-eight SSRs were identified from 8 179 unique ESTs（6 203 newly sequenced and 1 976 downloaded from NCBI database） and 37 primer pairs were successfully designed according to the ESTs; 11 pairs were selected to detect the genetic diversity and relationship of 69 attached U. prolifera samples and 13 free-floating samples collected from coastal and off-coast areas of the South Yellow Sea. The results of cross-species transferability showed that six of the 11 EST-SSR primers could give good amplification in other five Ulva species and the average allele number was 4.67. Genetic variation analysis indicated that all 82 U. prolifera samples were clearly divided and most samples collected from the same site clustered together as a group in the dendrogram tree produced by unweighted pair-group mean analysis（UPGMA） method and the cluster results showed some consistency with the geographical origins. In addition, 13 free-floating samples（except HT-001-2） were grouped as a single clade separated from the attached samples.     

绿潮生物学机制研究

绿潮发生机制极其复杂,但其核心机理是绿潮暴发时漂浮"藻席"中的浒苔快速形成巨大生物量,涉及浒苔生物学过程对环境的响应及其生理生化基础。为此,本文在已有研究报道的基础上,对浒苔生活史研究进行了充分的理论补遗;分析了漂浮"藻席"中浒苔生长与繁殖过程,认为该过程是绿潮生物量形成的关键;阐述了浒苔孢子囊形成是对富营养化背景下海水溶解无机氮(DIN)中硝态氮高占比的响应,认为一氧化氮分子可促进浒苔营养细胞向孢子囊的转化;解析了浒苔细胞对逆境因子的响应途径与机制。基于已有的研究成果,本文对浒苔引发绿潮的生物学过程进行了理论推定。人为或自然因素使固着浒苔处于漂浮状态,形成小规模"藻席";富营养化背景下海水DIN中硝态氮占比的升高赋予了浒苔巨大的繁殖潜能,漂浮过程溶解无机碳(DIC)"充裕"和"不足"两个阶段的交替以及食藻动物啃食产生的藻片段使孢子囊形成比例大幅提升;孢子原位萌发等使释放的孢子在"藻席"中获得了附着基,个体数目随之指数增长;结合漂浮浒苔的高生长速率,"藻席"规模不断扩大,短时间内形成巨大生物量。同时,本文还对今后的绿潮研究提出一些建议,认为啃食动物在浒苔生物量消长过程中发挥重要作用,在漂浮"藻席"系统中扮演着"生态引擎"的功能,同时系统阐明浒苔孢子的原位萌发等现象的生物学机理应该是未来绿潮的重要研究内容。     

不同氮磷比值下浒苔与石莼的竞争作用研究

近年来,海水富营养化导致近海海域大型海藻过量繁殖,成为世界性的环境问题。自2007年以来,浒苔绿潮在黄海海域连续暴发,造成巨大经济损失。为探究浒苔大规模暴发与氮磷比值(N/P)的关系,及其与其他大型绿藻在不同N/P下的竞争机制,研究了浒苔(Ulva prolifera)与石莼(Ulva lactuca)在不同N/P下单独培养和共培养时的生长情况,探究了浒苔及石莼生长的变化;结合苏北浅滩海域现场N/P的调查结果,分析了浒苔绿潮暴发的可能机制。研究结果表明:(1)浒苔单独培养时,在一定范围内高N/P能促进浒苔的生长,氮对于浒苔的影响大于磷。(2)石莼单独培养时,低N/P下石莼长势最好,但改变N/P对石莼的影响并不显著。(3)浒苔和石莼共培养时,浒苔生长受到了一定限制,低N/P下浒苔生长受限更显著。(4)苏北浅滩海域高N/P更适合浒苔的生长,可能是浒苔绿潮能够大规模暴发的原因之一。     

绿潮藻浒苔微生物高效降解及生物乙醇制备

从绿潮藻暴发海域的底泥和腐烂浒苔(Ulva prolifera)中,筛选出一株可高效降解浒苔纤维素的微生物菌株(F菌株),通过刚果红染色实验以及真菌的ITS分析,鉴定为曲霉属真菌。以浒苔为诱导培养基制备F菌株的粗酶液,测得其滤纸纤维素酶活为34.79 U/m L。在发酵实验中,当酶解条件为6%的粗酶液添加量、反应温度为38℃、反应时间为60 h、pH为6.8时,浒苔纤维素降解效果最好,酶解液发酵乙醇产量最高达到28.98 g/L。     

江苏海区浒苔的营养与食品安全性分析与评价

通过对不同海区浒苔及其与紫菜之间的比较,分析评价了江苏海区定生浒苔和漂浮浒苔的营养特性。通过主成分分析可以将江苏浒苔与其他浒苔和紫菜明显区分开,说明江苏浒苔的营养具有区域一致性。江苏浒苔具有高蛋白、低膳食纤维的特点,浒苔中钙、镁含量高于紫菜,磷含量低于紫菜。江苏浒苔的必需氨基酸含量组成适合人体需要,是良好的蛋白质来源。第一限制氨基酸为甲硫氨酸,呈味氨基酸含量达到氨基酸总量的33.6%—42.9%,具有较好的呈味特性。江苏浒苔的铅、铬离子含量较高,食用风险不容忽视。     

苏北浅滩筏架附生绿藻群落结构变化及与环境因子的相关性探究

苏北浅滩是研究浒苔绿潮早期形成机制的重要区域,该区域紫菜养殖筏架上附生绿藻的群落结构变化对浒苔绿潮的发生具有重要影响,环境因素在其中发挥了重要作用.为了探明导致苏北浅滩绿藻群落结构变化的主要环境因素,本文通过分子生物学和种群生态学方法对筏架附生绿藻群落结构进行了研究,结果表明:(1)苏北浅滩筏架附生绿藻群落主要由浒苔(...