单环刺螠染色体核型分析

染色体是细胞遗传学的研究基础,为了补充螠虫动物的核型资料,为单环刺螠(Urechis unicintus)的遗传育种和进化分类研究提供基础,以单环刺螠胚胎、幼体及成体体腔细胞、呼吸肠等为材料,经植物血球凝集素(PHA)和秋水仙素处理后,采用低渗和滴片常规方法制备染色体标本,对单环刺螠染色体数目和核型进行了研究.结果表明...     

单环刺螠Bcl-xL基因的鉴定及对硫化物的应激反应

Bcl-xL是Bcl-2家族中一类重要的抗凋亡因子,其功能主要是抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生。为了探知Bcl-xL在生物硫化物应激中的作用,本实验以耐硫生物单环刺螠(Urechis unicinctus)为研究对象,RACE扩增获得一个长度为1 426 bp的单环刺螠Bcl-xL全长c DNA序列,推导的氨基酸序列包含Bcl-xL4个保守的BH结构域和1个跨膜区域。使用该c DNA的完整开放阅读框序列,构建了原核表达载体p ET28a-Bcl-xL,体外诱导表达该重组蛋白;镍柱纯化得到纯度为90%的纯化蛋白,并制备多克隆抗体。Western blotting结果显示:单环刺螠暴露于50μmol/L硫化物中2 h-24 h内其呼吸肠中Bcl-xL含量显著增加(P0.05),然而在150μmol/L硫化物中48 h-72 h内其呼吸肠Bcl-xL含量显著降低(P0.05),暗示Bcl-xL抑制细胞凋亡途径在单环刺螠应对低浓度硫化物暴露时发挥作用,而在高浓度硫化物暴露下Bcl-xL不能发挥抑制细胞凋亡的作用。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化出的1组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性。根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3-’RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5-’RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp。该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsindomain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。     

单环刺螠GATAB2的基因克隆及表达分析

GATA家族是经典的转录因子家族,因其能特异性的与核苷酸序列T/A(GATA)A/G结合而得名.前期研究在单环刺螠(Urechis unicinctus)中筛选到GATA家族成员GATA B2与硫代谢关键酶硫醌氧化还原酶(Sulfide quinone oxidoreductase,sqr)启动子高转录活性区相互作用....     

单环刺螠育苗养殖及综合利用研究进展

单环刺螠(Urechis unicinctus)是我国北方沿海常见的一种海洋底栖无脊椎动物,也是具有较好市场开发前景的新型海水养殖品种之一。本文概述了单环刺螠的基础生物学、人工育苗和养殖现状,以及高附值开发潜力,并提出了构建单环刺螠新型海水养殖产业链的可行性。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶( UFE)是由本实验室分离纯化出的l组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活件和纤溶活性以及较好的生物安全性.根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3'-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5’-RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp.该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsin domain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶.     

单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其性质的初步研究

从单环刺中制得单一组分的纤溶活性纤溶酶,并对其性质进行初步研究.单环刺体组织液经离心,超滤,离子交换层析,凝胶过滤等方法进行分离纯化,制得单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE电泳分析,SDS-PAGE电泳分析和飞行质谱分析,鉴定了酶制品纯度和相对分子量,进行了体外溶血栓试验.所得纯品UFEIa水解酪蛋白的比活力为442.0 U/mg,纯化倍数为12.1倍,回收率为27.0%.UFEIa为单一组分,相对分子量约23 800 Da.体外溶血栓实验表明此纤溶活性蛋白酶与蚓激酶相比具有很好的溶血栓活性.     

单环刺螠生物学及生态学研究进展

单环刺螠(Urechisunicinctus)是中国沿海分布的唯一无管螠目(Xenopneusta)种类,具有较高的营养价值和经济价值。近年来由于过度捕捞,单环刺螠自然资源破坏严重,亟待开展人工养殖以满足人们的需求。本文综述了单环刺螠生物学和生态学方面的研究进展,同时提出了单环刺螠的研究方向,并分析了其养殖前景。     

单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达

单环刺螠(Urechis unicinctus)纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化得到的一组有抗凝和纤溶活性及较好生物安全性的纤溶酶。本研究为获得重组表达的UFE,根据该纤溶酶Ⅲ的(UFEⅢ)N端测序结果,设计简并引物,扩增出该蛋白的部分基因编码序列,利用5′-RACE PCR获得(UFEⅢ)的cDNA全长序列863bp,其中开放阅读框编码261个氨基酸。通过生物信息学分析其为丝氨酸蛋白酶家族成员,并与之前实验室提取的UFEⅢ进行同源性分析,推测其为一组同工酶。以PMD18-T-UFE为模板,扩增单环刺螠纤溶酶的成熟肽片段,构建重组表达载体pET32a-UFE和pET28a-UFE,转入Rosetta2(DE3)菌中诱导表达,UFEⅢ分别以可溶蛋白和包涵体的形式得到了表达。     

单环刺螠幼虫的体壁发生和体节形成

研究螠虫动物体壁发生和体节形成,可为阐释其早期发育机制以及体节在螠虫动物进化中的意义提供科学数据。本文以生活于沿海底质U形洞穴中的单环刺螠为材料,研究了单环刺螠幼虫的体壁发生和体节形成过程。研究显示,单环刺螠(Urechis unicinctus)担轮幼虫的体壁由单层上皮组织构成;至体节幼虫时,体壁变为单层上皮组织、结缔组织和纵向分布的肌纤维组成的多层结构,且体壁表面出现明显的分节;蠕虫状幼虫体节消失,体壁单层上皮细胞聚集形成不规则的乳突状结构,上皮中黏液细胞增多、结缔组织和肌纤维增多;至幼螠时,体壁的组织结构与成体基本一致,由复层上皮组织、结缔组织和肌肉组织(外环肌-中纵肌-内环肌)构成;单环刺螠体壁结构的不断分化,体现了其由浮游生活方式向爬行和穴居生活方式转变的适应过程。TUNEL检测发现,在单环刺螠幼虫体节发生过程中未出现明显的细胞凋亡现象。使用细胞增殖标记分子PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)检测单环刺螠体节发生区域增殖细胞的分布时发现：在担轮幼虫中期,其后体部首先出现增殖细胞带,并在随后的发育过程中形成体节细胞增厚区;担轮幼虫晚期...     

单环刺螠耐硫机制研究进展

本文概述了硫化物的生理毒性,包括对生物体的有氧呼吸毒性,神经毒性,线粒体毒性,核酸和蛋白质毒性。总结了单环刺螠在硫化物胁迫下存在的应对机制,包括体壁分泌粘液,细胞凋亡过程中某些酶活性的升高和凋亡通路的放大;体内氧化酶活性的改变;体腔液某些成分含量及细胞器结构的变化,线粒体内相关酶系的氧化以及RNA、DNA结构和含量的变化等。     

基于线粒体COI序列莱州湾单环刺螠遗传多样性分析

为系统地了解莱州湾单环刺螠(Urechis unicinctus)遗传多样性,作者基于线粒体COI序列利用基因测序技术研究了莱州湾3个单环刺螠不同群体的遗传多样性。实验结果显示,84个莱州湾单环刺螠样本有变异位点数125个,其中包括43个单一变异位点,82个简约信息位点;48个单倍型,单倍型多样性0.977;核苷酸多样性指数0.01048;平均核苷酸差异数量13.725;莱州湾单环刺螠遗传多样性水平较高;个体聚类并没有体现出和地理位置相关。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶相互作用蛋白质的筛选

硫化物是沿海水域中常见的有害物质,对于多数生物来讲,其在微摩尔级水平便可导致生物体中毒。硫醌氧化还原酶(SQR)是一种谷胱甘肽还原酶家族的膜结合黄素蛋白,为硫化物氧化解毒的一种关键酶。本研究以体外原核表达并复性的单环刺螠SQR为材料,采用His-pulldown技术和SDS-PAGE分析,从单环刺螠体壁细胞裂解液中筛选出两个可能与SQR结合的蛋白质,分子质量分别为40 ku和60 ku。通过毛细管液相色谱-离子肼质谱分析,初步判断其为细胞色素P450(cytochrome P450)和腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter),并初步探讨了其可能的功能。     

单环刺螠线粒体基因组全序列的获得——长PCR 结合鸟枪法测序

由于具有单基因所不可比拟的优势,线粒体基因组现已成为后生动物种群遗传和分子系统发育研究中一个重要的信息来源。本研究选取螠虫动物的代表物种——单环刺螠(Urechis unicinctus),详细阐述了利用长PCR方法扩增其线粒体DNA,获得约15 kb的扩增产物,进而构建shotgun文库,最终成功获得单环刺螠线粒体基因组全序列的流程。本实验流程样品需求量少、设备要求低、简便快捷。     

4 种病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析

利用十二烷基磺酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、河口弧菌(V.aestuarianus)、霍乱弧菌(V.cholerae)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)4种致病性弧菌的主要外膜蛋白,通过SDS-PAGE分析比较4种弧菌主要外膜蛋白的组分。结果表明:4株弧菌的外膜蛋白电泳图谱一般可得到5～10条蛋白带,分子量多数集中在26~40 kD和48~85 kD。对所提取的4种弧菌主要外膜蛋白进行SDS-PAGE后,分别与自制的兔抗鳗弧菌血清、抗河口弧菌血清、抗副溶血弧菌血清进行Western-blotting印迹分析。结果显示每种全菌抗血清可与相应菌的外膜蛋白部分组分发生免疫反应,并与其他3种弧菌外膜蛋白的部分组分产生交叉免疫反应,这些反应条带分子量主要集中于30~48 kD之间。本研究为进一步研究致病性弧菌外膜蛋白免疫学特性提供参考。     

副溶血弧菌攻毒过程中文蛤肝胰腺弧菌载量变化的分析

文蛤(Meretrixpetechialis)是我国一种重要的海水养殖贝类,其养殖过程中病害导致的规模性死亡时有发生,已有的工作证实致病性弧菌是导致文蛤大规模死亡最为常见的病原。在本研究中,我们通过浸泡感染实验模拟了文蛤在自然条件下的弧菌胁迫环境,明确了攻毒水体中弧菌生长变化规律;攻毒过程中宿主载菌量分析显示,文蛤肝胰腺组织弧菌载量在攻毒后呈第1天急剧上升,第3天迅速下降的变化趋势,而且不同个体间载菌量差异较大;通过不同弧菌含量攻毒实验,发现在攻毒早期文蛤体内弧菌载量与水体环境的弧菌含量之间呈显著的正相关(Spearman’sρ=0.899,P=0.000),而在感染中后期不同攻毒强度组之间无显著差异,且呈现较低水平,为0～205CFU/mg,预示着宿主免疫系统和肝胰腺微生物群落可将致病菌的数量控制在一定的范围。上述研究为开展文蛤感染发病过程中弧菌载量和免疫抗性评价相关研究提供了参考。     

基于MALDI-TOF MS快速鉴定弧菌的数据库的扩展和应用

近年来由海洋细菌导致的感染越来越常见,弧菌是海洋细菌中最常见的细菌之一。目前,对弧菌缺乏快速有效的鉴定。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）已成为快速鉴别细菌强有力的工具。然而,它的准确性取决于数据库中的菌株数量。本研究中,我们利用MALDI-TOF MS对弧菌数据库进行了扩展和应用。我们将74株弧菌纳入了新的数据库,构建了基于RpoB序列的进化树（邻接法和最大似然比法）,并针对扩展后数据库和扩展前数据库进行了聚类分析。我们利用30株弧菌,对扩展后数据库进行了评价,并进行了主成分分析。本研究中,我们创建了一个新的数据库,促进了弧菌的快速准确鉴定。MSP(main spectrum profile)和PCA（Principal Component Analysis）分析为追踪弧菌感染的来源和发生率提供了理论支持。此外,特征峰和差异峰的发现对弧菌的鉴定也有帮助。