南海有毒塔玛亚历山大藻的分子地理标记分析

采用聚合酶链扩增反应（ＰＣＲ）和限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）方法,对１９９２年５月和１９９４年１２月采自中国南海大鹏湾,大亚湾,香港海域的赤潮有毒甲藻塔玛亚历山大藻８个不同地理株的核糖体小亚基ＲＮＡ基因（Ｓｓ－ｒＤＮＡ）进行分析,并与北美,西欧等地的比较。结果表明,中国南海的塔玛业历山大藻缺少Ｂ基因,这与北美等地的塔玛亚历山大藻（包括有毒和无毒株）不同,而与西欧,澳洲等地的有毒和无毒株相似     

可用于相关亚历山大藻(Alexandrium affine)检测的一个寡核苷酸探针

针对分离自南海的相关亚历山大藻,在进行核糖体大亚基DNA（LSU rDNA）全序列测序及比对的基础上,设计了针对其核糖体大亚基RNA（LSU rRNA）D10区的一个新的荧光素（FITC）标记寡核苷酸探针,并建立了相应的荧光原位杂交检测方法。在GenBank数据库中,BLAST检索的结果显示所设计的探针具有较高的特异性。杂交实验的结果也表明,这条探针对相关亚历山大藻的标记具有特异性,且标记效率可以达到100％,标记信号清晰明亮。本研究结果为相关亚历山大藻的监测及其种群动态研究提供了方法学依据,也为其它微藻特异性探针的设计提供了新的思路。     

碱煮法:一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的实用方法

介绍了一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的方法——碱煮法。取少量海水样品(40μL)．直接经0．25mol／L艺机NaOH和99℃温育处理裂解细胞,从而得到环境样品总DNA。实验证明,该方法制备的模板DNA可用于细菌核糖体RNA、浮游植物叶绿体rbcL和浮游动物线粒体COI等基因的PCR扩增。但是,在使用通用引物扩增细菌基因时,假阳性很难避免。该法制备的模板DNA适用于扩增非细菌基因或者特异引物界定的细菌基因。该方法较传统制备方法快速、简便,样品需要量减少,适用于浮游生物分子遗传多样性研究。     

加权基因共表达网络探究链状亚历山大藻爆发性生长的分子机制

链状亚历山大藻(Alexandrium pacificum)作为典型的产毒赤潮甲藻,分布广泛,而对其爆发性生长的研究将有助于探究由其引发的赤潮的分子机制。本研究通过模拟赤潮爆发的条件对链状亚历山大藻进行表达谱测序,利用表达谱测序后得到的基因表达量数据,采用加权基因共表达网络(WGCNA)构建方法探究链状亚历山大藻的爆发性生长的分子机制。通过计算基因间表达量的相关性得到了35个基因共表达模块,将基因共表达模块与链状亚历山大藻爆发性生长性状相关联,在爆发性生长阶段,有6个显著性相关的模块,基于KEGG及GO功能富集分析,这些模块涉及蛋白质的加工合成、核糖体的合成,电子传递,碳水化合物代谢等过程,表明了细胞代谢能力的提升,为细胞增殖提供了物质基础。此外有大量的未知功能的枢纽基因被发现,基因模块可以用于推测这些基因的功能,从而为以后挖掘新基因,探究潜在的调控机制提供了基础。     

罗源湾口柱状沉积物中的甲藻孢囊

通过时福建罗源湾口海域KMZK5柱状沉积物中甲藻孢囊的分析，共鉴定出15属30种甲藻孢囊，对比发现这30种甲藻孢囊是该湾以前未被记录的种类．其中12种是附近海域也未曾发现的种类，6种为有毒种类：缘亚历山大藻、小型亚历山大藻、塔玛亚历山大藻、具剌膝沟藻、链状裸甲藻、锥状斯氏藻，同时对甲藻孢囊的主要属种和有毒种类的丰度、分布在垂直方向上的变化特征进行了初步研究。     

海链藻目核糖体RNA基因片段的扩增及多样性分析

海链藻目(Thalassiosirales)的海链藻属(Thalassiosira)和骨条藻属(Skeletonema)微藻是形成春季赤潮的主要种类。为利用分子生物学方法分析表层海水主要赤潮形成藻的动态变化、快速鉴定赤潮形成藻种,设计了海链藻目特异引物,扩增了胶州湾近岸表层海水海链藻目18S核糖体RNA基因片断。随机测定10个序列,其中4个与海链藻属的Thalassiosi-ra concaviuscula的完全相同,其余的可确定属于海链藻属。表明该引物对能选择性地扩增海链藻目18S核糖体RNA基因片断。     

北黄海中部及四十里湾海域甲藻孢囊种类多样性研究

从2008年至2011年,采集了北黄海和烟台四十里湾海域共49个站点的表层沉积物的样品,并对沉积物中的甲藻孢囊进行鉴定。研究发现41种孢囊,隶属于16属：其中,原多甲藻（Protoperidinium?sp.）孢囊Brigantedinium?aymmetricum?Matsuoka为中国海域新记录种。塔马/链状亚历山大藻Alexandrium?tamarense?/?catenella、微小/相似亚历山大藻Alexandrium?minutum?/?affine、网状原角管藻Protoceratium?reticulatum和膝沟藻Gonyaulax?spp.的孢囊是北黄海中部海域孢囊优势种;膝沟藻Gonyaulax?sp.（Spiniferites?bentori?var.?truncata）、具刺膝沟藻Gonyaulax?spinifera（Spiniferites?hyperacanthus）和网状原角管藻P.?reticulatum的孢囊在烟台四十里湾占优势。另外,研究中还发现三种产虾夷扇贝毒素（YTX）甲藻（具刺膝沟藻G.?spinifera、多边舌甲藻Lingulodinium?polyedra和网状原角管藻P.?reticulatum）的孢囊,在芝罘岛到北黄海中部海域都有较高丰度的分布,另三种产麻痹性贝类毒素（PSP）甲藻（塔马/链状亚历山大藻A.?tamarense?/?catenella、微小/相似亚历山大藻A.?minutum?/?affine和链状裸甲藻Gymnodinium?catenatum）的孢囊,在北黄海中部丰度很高。因此,应加强这些海域的甲藻孢囊监测和研究,预防有毒甲藻赤潮的爆发。最后,通过对比分析北黄海中部及烟台四十里湾这两个海域甲藻孢囊分布特征和环境特征的差异,进一步证明了人类活动对近岸海洋生态环境的影响。     

链状亚历山大藻不同生长状态差异表达microRNA的筛选和验证

从链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)延迟期、对数期2个小RNA文库中选择了2个差异表达的microRNA(osa-miR2876和rgl-miR5139),设计f/2培养下延迟期、对数期和高氮、高磷、高锰对数期5个条件,用qPCR的方法对其表达进行了检测。研究建立了以5.8srRNA为内参基因,以SYBR Green I为荧光染料,用加尾法荧光定量PCR检测microRNA在不同生长状态相对表达的方法。microRNA的表达量在对数期和诱导下对数期均低于延迟期,高锰条件下对数期均为最低,且延迟期的表达量分别是高锰条件表达量的18.63和14.12倍。microRNA负调控靶基因的表达,而osamiR2876和rgl-miR5139在对数期均为下调表达,说明其靶基因参与的细胞生理过程:DNA复制、修复、嘌呤、嘧啶碱基的代谢、RNA聚合酶的代谢等过程呈现激活状态,而上述生理过程的激活均有利于藻细胞增殖。这些结果表明:osamiR2876和rgl-miR5139可能在链状亚历山大藻的快速分裂和增殖中发挥着非常重要的调控作用。本文研究结果为甲藻兼性营养型正确性提供了进一步的证据,同时rgl-miR5139在细胞快速生长阶段的下调表达提示在该阶段下异养营养型可能占优势。本研究说明了microRNA在链状亚历山大藻快速生长过程中可能发挥着重要的调节作用。也为其他物种microRNA的研究和检测提供了快速简便、特异性好的研究方法。     

罗源湾口柱状沉积物中的甲藻孢囊

通过对福建罗源湾口海域KMZK5柱状沉积物中甲藻孢囊的分析,共鉴定出15属30种甲藻孢囊。对比发现这30种甲藻孢囊是该湾以前未被记录的种类。其中12种是附近海域也未曾发现的种类,6种为有毒种类:缘亚历山大藻、小型亚历山大藻、塔玛亚历山大藻、具刺膝沟藻、链状裸甲藻、锥状斯氏藻.同时对甲藻孢囊的主要属种和有毒种类的丰度、分布在垂直方向上的变化特征进行了初步研究.     

流行性造血器官坏死病毒（EHNV）PCR快速检测试剂盒的研制

以流行性造血器官坏死病毒（EHNV）中的主衣壳蛋白基因保守区序列作为扩增靶序列,设计合成了一对特异性引物,应用快速的模板制备方法和优化PCR扩增条件,建立了EHNV病毒PCR快速检测技术,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒.该试剂盒的检测灵敏度相当于31个病毒粒子,模板制备时间约30 min,约4 h即可得到准确的结果;且无非特异性扩增带,适用于由EHNV病毒感染的鱼类苗种和水产品的检疫及水质环境的监测.     

单条固定线虫基因组DNA提取及18S rRNA基因PCR扩增

根据线虫18S核糖体RM基因PCB扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇 0．05mol／L FDTA(pH8．0)和5％海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备RR模板DNA,而5％海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。结果有助于分子生物学方法在海洋线虫分类、多样性和生态学研究中的应用。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长性状相关的微卫星标记筛选

采用分群分离分析法,以同一批受精卵孵化的同池养殖大菱鲆生长性状发生分离的群体为材料,进行微卫星DNA遗传分析,以揭示影响大菱鲆生长发育速度方面的遗传信息。30个多态性微卫星位点对生长高值组(F组)和生长低值组(S组)各10个样本建立的DNA混合池进行扩增时,在两池间出现了7个差异片段。通过对两组大菱鲆个体PCR扩增出的差异条带进行统计,分析微卫星位点与大菱鲆生长性状的相关性。结果表明,有1个微卫星位点(SmaC10)在355bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在一定的负相关性;有4个微卫星位点(SmaC02、SmaC06、SmaC09、B11-I12/6/3)分别在258bp、182bp、226bp、175bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在正相关性,其中位点Smac09在226bp的等位基因片段与生长性状的正相关性极显著,相关系数达到0.354。位点SmaC09所扩增出的等位基因片段可作为具有良好生长特性人工选育群体的分子标记,指导大菱鲆的辅助育种。     

Detection of Hepatitis A virus in shellfish by reverse transcription PCR

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ　ｂｙ　ｒｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＰＣＲTXＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｉｎｓｈｅｌｌｆｉｓｈｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒ...     

坛紫菜别藻蓝蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

以野生坛紫菜色素体DNA为模板, 通过PCR扩增获得编码坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基和β亚基的序列及两者之间的间隔序列,该序列全长为1 055 bp,其中编码α和β亚基的序列均为486 bp,间隔序列为83 bp.该序列与GenBank收录的其他4种红藻相关序列的同源性在75.6%~87.4%,与2种蓝藻的同源性分别为66.9%,68.5%,其中编码区同源性更高.     

固定标本的DNA提取及PCR扩增

报道福尔马林、酒精固定的日本绒螯蟹标本的 DNA提取及 PCR扩增 ,并与冷冻、煮沸标本进行了比较。结果表明 ,福尔马林固定标本与酒精固定标本一样可以提取 DNA,加入的蛋白酶 K量越多 ,DNA的回收率越高。以提取的 DNA为模板 ,进行了线粒体 DNA12 S r RNA和 D- loop基因片段的 PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物后均得到了与期待的碱基长度相一致的清晰谱带。     

逆转录-PCR扩增文昌鱼LIM类同源框基因片段

于1997年6月在青岛市沙子口海域采集文昌鱼样品，采用RT－PCR方法进行青岛文昌鱼LIM类同源框基因片段的扩增研究。结果表明，用一对引物一次PCR扩增的方法未能得到特异的PCR产物，用一对引物两次PCR扩增的方法也同样未果。在对套式PCR进行研究时发现，用普遍PCR方法进行的套式PCR结果不够理想，而用三步两段法和四步两段法套式PCR则可进行成功的扩增。用这两种方法扩增的PCR产物具有高度特异性。相比之下，用简并的引物对未知的基因片段进行PCR扩增时，三步两段法和四步两段法的套式PCR应是首选方法。     

Diversity analysis of protistan microplankton in Sagami Bay by 18S rRNA gene clone analysis using newly designed PCR primers

The diversity of protistan microplankton in Sagami Bay was revealed by 18S rRNA gene clone analysis using newly designed PCR primers. PCR amplification consisted of a first reaction targeting the V3–V5 region of the 18S rRNA gene, followed by a nested reaction targeting the V3–V4 region. In total, 629 clones consisting of 108 phylotypes were affiliated with a variety of protistan groups including dinoflagellates, diatoms, prymnesiomonada, chlorophyta, ciliophora, cercozoa, and heterokonta. The dinoflagellate group was detected most frequently and shared approximately 74?% of the total clones. Within this group, approximately half of the clones belonged to the parasitic dinoflagellate Syndiniales group I, which was first reported from Sagami Bay. The genera Woloszynskia, Gonyaulax, Neoceratium, and Karlodinium have not been reported from this bay until now. The second most frequent group was diatoms, which shared approximately 22?% of the total clones. Within this group, highly diverse Thalassiosira phylotypes were detected, and they shared approximately 70?% of the diatom clones. Therefore, highly diverse protists including some candidate groups were successfully detected, indicating that the designed primers and PCR protocol will be useful for molecular diversity analyses of protistan microplankton communities in aquatic environments.     

A simple method for the detection of hepatitis A virus in the environmental samples by polymerase chain reaction

Hepatitis A virus (HAV) is very persistent in the environment and is especially difficult to detect in the seafoods. In recent years, molecular cloning of the genome of HAV has led to sensitive polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of HAV RNA. Here we describe a new and simple procedure to extract RNA from contaminated clams and the PCR method for detection of HAV in environmental samples. The specificity and efficiency of PCR amplification were studied using cDNA and RNA of HAV. Three primer couples gave satisfactory results. Some basic parameters of the PCR were modified to perform a highly specific and sensitive test.     

同时检测海洋贝类包纳米虫和派琴虫的双重TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法

根据包纳米虫（Bonamia sp.）SSU rDNA和派琴虫（Perkinsus sp.）ITS rDNA的保守区序列,设计特异性引物和Taqman MGB探针,建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光PCR方法.该方法可检测到包纳米虫基因的446拷贝质粒,以及派琴虫基因的171拷贝质粒,具有较高的灵敏度.以10倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板,测得该方法的定量标准曲线相关系数分别为0.999和1.000,显示出很好的扩增效率.同时该方法与尼氏单孢子虫（Haplosporidium nelsoni）、沿岸单孢子虫（H.costale）等其他贝类原虫,以及副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和鮰爱德华氏菌（E.ictaluri）等海水养殖常见致病菌之间无交叉反应,表现出较高的特异性.福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采集的296份贝类临床样本的检测证明,该方法是一种有效的快速检测鉴定上述2种贝类原虫的方法,具有良好的灵敏度和特异性,可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查,以及贝类疫病检疫监控等领域.