合浦珠母贝、长耳珠母贝和大珠母贝种间人工杂交的研究——Ⅰ.人工杂交和杂交后代的观察

合浦珠母贝Pinctada fucata、长耳珠母贝 P.chemnitzi、大珠母贝 P.maxima都是海产珍珠养殖的种类,它们在形态、生理生态及分布等方面都存在较大的差异。为了改良合浦珠母贝育珠性状,提高贝体的生活力,我们从1976年开始进行了上述三种珠母贝的种间杂交试验研究,并获得几种杂交组合的后代。     

合浦珠母贝、长耳珠母贝和大珠母贝种间人工杂交的研究——Ⅲ.同工酶谱的比较研究

为了进一步从分子水平验证前文所述的形态学和细胞学的观察结果,并了解杂交后代基因表达的调控机理,我们进行了同工酶谱的比较研究。 一、材料和方法 1.实验材料 合浦珠母贝、长耳珠母贝和大珠母贝是野生贝。大珠母贝采自海南岛西部海域,其他二种采自广西合浦海区。杂交贝(图1:2,4,6)是1976—1980年间在徐闻珍珠场用人工杂交授精方法育成。活贝运回实验室后,置-30℃低温冰箱内贮存备用。     

马氏珠母贝(Pinctada martensii)2个地理群体杂交子代的杂种优势和遗传变异

采用马氏珠母贝的印度群体(II0)和三亚群体(SS0)的2×2双列式杂交获得了4组子代,II1(II0♀×II0♂)、IS1(II0♀×SS0♂)、SI1(SS0♀×II0♂)和SS1(SS0♀×SS0♂);分析表明,杂交组子代IS1和SI1在壳高、壳长、绞合线长、壳宽、壳重上都表现出杂种优势;IS1在壳宽指数上表现出杂种优势,而在总重和壳重指数上未表现杂种优势;SI1在总重和壳宽指数上表现出杂种优势,而在壳重指数上未表现杂种优势;SI1在壳高、壳长、绞合线长和壳重上的杂种优势较IS1高,差异极显著(P0.01),而IS1在壳宽上的杂种优势较SI1高,差异极显著(P0.01)。应用6个微卫星位点分析4个组合子代的平均FST值为0.357,表明4个组合子代间有较大的遗传差异和较高的分化水平;平均等位基因数依次为SI1(6.17)IS1(6.00)II1(5.00)SS1(4.67),等位基因丰度依次为SI1(5.34)IS1(5.04)II1(4.47)SS1(4.55),期望杂合度(He)依次为IS1(0.55)SI1(0.54)SS1(0.44)II1(0.42),观察杂合度(Ho)依次为SI1(0.52)IS1(0.46)SS1(0.35)II1(0.29),杂交子代的杂合度和遗传多样性高于自繁子代,杂交增加了杂交子代的杂合度和遗传多样性,杂种优势与杂合度和遗传多样性增加直接相关;综合考虑杂种优势与遗传变异的结果,确定三亚野生群体♀×印度养殖群体♂杂交组合作为"珍珠贝育种规划POBs"的主要育种方式。     

合浦珠母贝人工诱导四倍体的研究

用细胞松驰素B（CB）、聚乙二醇（PEG）和静水压抑合浦珠母贝Pinctadamarlensii（D．）制第1次卵裂以及CB抑制极体形成诱导四倍体。CB抑制第1次卵裂在早期胚胎2-4细胞阶段发现四倍体,但8细胞阶段以后四倍体胚胎消失。PEG和PEG＋CB能诱导细胞融合产生四倍体,但处理组幼虫在担轮期死亡。CB抑制极体形成能诱导出较高比例的四倍体,在胚胎初期和担轮幼虫期分别占40％和30％以上。处理组幼虫进行培育,附苗后当贝苗长成4-5cm大小时通过鳃细胞染色体倍性检查,却没有发现四倍体。文中对四倍体是否能成活进行了讨论。     

合浦珠母贝三倍体死亡率观察

以染色体倍性鉴定方法检查合浦母贝Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｒｔｅｎｓｉｉ三倍体处理组的４个不同发育生长期的三倍体比例，并将同一处理组培育出的贝苗经倍性鉴定后将二倍体和三倍体分开，在海上吊养１周年，分别检查其死亡率，观察比较三倍体合浦珠母贝的死亡状况。     

三倍体合浦珠母贝不育性研究

对三倍体合浦珠母贝Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ（Ｄ．）春、秋两繁殖盛期的生殖腺进行了组织学观察，并对其配子形成及受精、发育进行了研究。结果表明：合浦珠母贝三倍体的生殖腺发育差，生殖细胞数量少，极少个体能见到成熟卵母细胞和精子；三倍体的配子能完成受精作用，能发育至直线铰合期。配子多为非整倍体，其染色体数目多为１４－２８，胚胎染色体数目主要为２８－４２，故胚胎不能正常发育。因此，三倍体合浦珠母     

三倍体合浦珠母贝不育性研究

对三倍体合浦珠母贝Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｒｔｅｎｓｉｉ（Ｄ．）春、秋两繁殖盛期的生殖腺进行了组织学观察，并对其配子形成及受精、发育进行了研究。结果表明：合浦珠母贝三倍体的生殖腺发育差，生殖细胞数量少，极少个体能见到成熟卵母细胞和精子；三倍体的配子能完成受精作用，能发育至直线铰合期。配子多为非整倍体，其染色体数目多为１４—２８，胚胎染色体数目主要为２８—４２，故胚胎不能正常发育。因此，三倍体合浦珠母贝是不育的．     

合浦珠母贝三倍体死亡率观察

以染色体倍性鉴定方法检查合浦珠母贝Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｒｔｅｎｓｉｉ三倍体处理组的４个不同发育生长期（即２—４细胞期、担轮幼虫期、６个月小苗及１４个月成员）的三倍体比例，并将同一处理组培育出的贝苗经倍性鉴定后将二倍体和三倍体分开，在海上吊养１周年，分别检查其死亡率，观察比较三倍体合浦珠母贝的死亡状况。结果表明，在胚胎发育期，三倍体和二倍体的死亡率差异不大；在直线铰合期至变态附着成为贝苗这段时期，三倍体死亡率明显高于二倍体；成贝的三倍体和二倍体死亡率没有显著差异。     

形态学和SNP标记分析马氏珠母贝杂交子代及其亲本群体的遗传结构

马氏珠母贝是重要的海水养殖贝类, 为了探究繁育亲本及其子代的遗传结构和关系, 本研究运用多元性形态学和SNP标记对马氏珠母贝母本深圳群体、父本海南群体和其杂交子代F1的外部形态和分子遗传结构进行分析。结果发现, 3个群体的综合判别率为72%, F1和母本群体的形态差异最小, 父本群体与母本、F1的形态差异较大。采用HRM法 (high resolution melting) 应用4个SNP位点对这3个群体进行分型, 3个群体的平均观测杂合度H_o和期望杂合度H_e分别为0.2110~0.2879和0.3317~0.4685, F1的杂合度高于两个亲本; 平均多态信息含量PIC值为0.2643~0.3556, 呈现中等程度遗传多样性。F1与母本之间的基因流N_m最大(7.7701), 遗传距离最小(0.0546), 亲缘关系最近; 两个亲本之间的N_m最小(1.9662), 遗传距离最大(0.1759)。rs8位点可以判别两个亲本群体, 可作为特异性的标记。该结果可以为马氏珠母贝群体遗传结构鉴别、育种群体管理提供指导。     

小黄鱼(♀)×大黄鱼(♂)杂交子代遗传特征分析

通过对小黄鱼(♀)×大黄鱼(♂)杂交子代及其双亲染色体核型和线粒体COI基因序列的比较分析,旨在对其杂交遗传特性进行研究。其中染色体核型分析表明:小黄鱼的核型为2n=6sm+42t,NF=54;大黄鱼的核型为2n=2sm+22st+24t,NF=72;杂交子代为2n=8sm+12st+28t,NF=68。杂交子代和亲本在染色体数目上一致,但在组型上存在差异,可能是由于杂交过程中双亲染色体组发生了融合和重配。同时,对杂交子代及其亲本672bp的COI基因同源序列进行分析,表明杂交子代与其母本小黄鱼的序列几乎一致,利用Kitumra-2-Parameter-Distance双参数模型分析显示杂交子代与小黄鱼的遗传距离为0.011,该数值接近其种内平均遗传距离。基于COI基因片段序列构建的系统树显示,杂交子代与小黄鱼聚成一支。杂交子代在线粒体COI基因上表现出严格的母系遗传特征。     

人工诱导合浦珠母贝多倍体的发生

用细胞松弛素B(C.B)(浓度1.2—1.5mg/L)和低温(12.0℃)处理诱导合浦珠母贝Pinctada martensii(D.)产生多倍体。抑制第一极体的三倍体诱导率达到40％左右;而抑制第二极体的三倍体诱导率分别为77％和52％。随着C.B处理时间的延长,则出现一定数量的五倍体。亚致死温度是低温诱导多倍体的合适温度。随着处理温度的降低和时间的延长,孵化率急剧下降,且非整倍体数量增加。结果提示,C.B处理和低温处理诱导多倍体的机制有所不同;后者不仅抑制极体排放和细胞分裂,而且影响染色体复制和分离。 抑制第一极体的C.B处理组的幼虫日增长率和幼贝大小均显著超过对照组。     

合浦珠母贝3个养殖群体双列杂交F1代的生长和遗传分析

为开展合浦珠母贝(Pinctada fucata)遗传改良和培育优质新品种,作者利用合浦珠母贝北海养殖群体(B)、徐闻养殖群体(X)和三亚养殖群体(S)进行双列杂交,获得3个种群内自繁群体及6个种群间杂交群体。对8月龄F1代的壳长、壳高、壳宽和体质量4个生长性状进行了测定,计算了各组合的一般配合力、特殊配合力及杂种优势。结果表明,杂交组合的各性状值普遍高于自繁群体,其中S(♀)×B(♂)和S(♀)×X(♂)杂交组合的各性状值极显著高于其他组合。三亚群体各性状的一般配合力最大,S(♀)×X(♂)组合各性状特殊配合力最大,其次是S(♀)×B(♂)组合。杂交子一代4个生长指标均表现出一定程度的杂种优势(0.24%~52.62%)。不同杂交组合间和不同性状间的杂种优势存在差异,其中,S(♀)×B(♂)杂交组合杂种优势明显,其反交组合B(♀)×S(♂)杂交优势程度不高,且在壳宽上表现出较低的杂种优势率(0.24%);S(♀)×X(♂)杂交组合杂种优势率比反交组合X(♀)×S(♂)高。体质量的平均杂种优势率均高于其他3个性状。该研究的结果表明杂交群体性状的改进为进一步选育奠定了基础。     

合浦珠母贝四倍体诱导过程中非整倍体的产生

合浦珠母贝Pinctadamartensii (Dunker)三倍体的卵与二倍体的精子授精 ,以细胞松弛素B(CB)抑制第一极体释放诱导四倍体 ,得到胚胎期非整倍体占 (88.1 8± 6 .79) % ,1龄贝中非整倍体约占 2 8.70 %。成贝非整倍体染色体数目有 2 9,3 0 ,40 ,41 ,43条 5种类型。非整倍体作为一个群体其壳长和体重与二倍体无明显差异 (p >0 .1 0 ) ,但与三倍体有显著差异 (p<0 .0 1 ) ;二倍性水平的非整倍体的壳长和体重明显小于二倍体 (p <0 .0 1 ) ,而三倍性水平的非整倍体与二倍体无明显差异 (p >0 .1 0 )。研究结果表明 ,合浦珠母贝能耐受约单倍体染色体数目 7%— 1 4%的增加或减少 ,且表明合浦珠母贝非整倍体在一定条件下是可以存活的。     

金虎杂交斑三倍体血细胞特征及染色体核型分析

为了解三倍体金虎杂交斑(棕点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus♀×蓝身大斑石斑鱼E. tukula♂)的细胞遗传特性。以静水压休克诱导的三倍体金虎杂交斑为研究对象,通过细胞DNA含量测定鉴定出三倍体金虎杂交斑、对三倍体金虎杂交斑进行红细胞大小、形态的比较及染色体核型分析。结果显示,三倍体金虎杂交斑的DNA含量与二倍体金虎杂交斑的DNA含量的比值为1.45︰1。三倍体金虎杂交斑血细胞长轴、短轴分别为二倍体的1.34、1.14倍(P<0.01)。三倍体金虎杂交斑血细胞体积、表面积分别为二倍体的2.07和1.54倍(P<0.01),三倍体金虎杂交斑血细胞核长轴、短轴、核表面积、核体积分别为二倍体的1.22、1.05、1.29、1.57倍(P<0.01)。通过头肾-秋水仙素注射法进行染色体核型分析结果显示,二倍体金虎杂交斑的染色体数目为48,核型为2n=48=2sm+46t, NF=50,三倍体金虎杂交斑的染色体数目为72,核型为3n=72=1m+2sm+69t,NF=75,未发现有性染色体。实验结果为石斑鱼杂交种多倍体育种提供了丰富生物学基础数据。     

真鲷、黑鲷及其杂交子代的染色体构成与AFLP分析

采用核型分析和AFLP技术对真鲷、黑鲷及其杂交子代进行遗传差异分析。结果显示真鲷、黑鲷和杂交子代均含有48条染色体,核型分别为2n=2st+46t,NF=48、2n=4m+4sm+2st+38t,NF=56和2n=30m+8sm+2st+8t=48,NF=86,杂交子代核型与其父、母本种均不一致。两对AFLP选扩引物组合在真鲷、黑鲷和杂交子代中共扩增到278个条带,其中黑鲷特异性条带93条、真鲷特异性条带108条;杂交子代中分别出现了21条父本种(黑鲷)特异条带和67条母本种(真鲷)特异条带,另出现了15条非双亲条带。杂交子代与真鲷、黑鲷的遗传相似系数和遗传距离分别为0.113、0.350和2.180、1.050,表明杂交子代总体上更偏向于母本种。染色体核型和AFLP条带分析结果表明真鲷(♀)×黑鲷(♂)所获得的杂交子代为含有48条染色体的异源二倍体,且父、母本遗传物质在杂交中发生了部分重组,杂交子代表现出一定的偏母系遗传特性。     

珠母贝亲贝催熟培育和催产技术的研究

对不同来源珠母贝(Pinctada margaritifera)亲贝分别进行海上浅吊疏养促熟和室外水泥池人工催熟培育,且采用阴干、藻液、温度、低盐度刺激和异性产物诱导亲贝排放精卵,比较不同方法、不同来源亲贝性腺发育及亲贝开始排放时间、排放率、受精率和幼虫畸形率情况.结果表明,室外水泥池人工催熟法亲贝性腺成熟度比浅吊疏养促熟法好、死亡率低;相同培育方法,北部湾亲贝比海南亲贝性腺成熟快,但死亡率高;阴干刺激3 h+藻液刺激1 h+异性产物诱导,性腺达到第四期(排放期)的亲贝才排放,且排放的性细胞成熟度好,受精率高,幼虫畸形率低.     

雌性虾夷扇贝与雄性栉孔扇贝杂交子代及其亲本的核型研究

采用滴片法制片-吉姆萨染色对雌性虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)与雄性栉孔扇贝(Chla-mysfarreri)杂交子代及其双亲的核型进行了研究,报道了在扇贝杂交过程中产生的特殊的细胞遗传学现象,结果表明,栉孔扇贝染色体核型2n=38=6m+10sm+22st;虾夷扇贝染色体核型2n=38=6m+10sm+16st+6t;两者杂交子代染色体数目2n=38,但其染色体组型不符合预期型,不是简单地由两个亲本各自一套染色体组型组合而成,呈现出复杂的形态多态性,端部着丝点染色体明显增多.     

马氏珠母贝家系遗传结构的微卫星分析

利用6个微卫星位点研究了9个马氏珠母贝(Pinctada fucata)养殖家系的遗传结构,为后续育种工作提供了指导。从60对引物中筛选出6对能够稳定扩增且多态性较好的引物。6个微卫星位点在9个家系中共检测到17个等位基因,每个位点等位基因数(A)为2~4个,平均2.833个。6个位点在9个家系上的有效等位基因数(Ne)平均值为2.030~2.632,平均杂合度观测值(Ho)为0.4306~0.6354,平均杂合度期望值(He)为0.4380~0.5962。家系间遗传分化系数(FST)为0.0749。采用NJ法进行聚类分析显示,9个家系分为明显的两支,根据遗传距离计算结果, F7和F9家系之间的遗传距离最近, F11与F12家系遗传距离最远。结果表明,9个家系的遗传多样性和遗传分化处于中等水平,可以考虑F11与F12家系杂交,以期获得较好的杂种优势, F11自交培育出遗传稳定的优良家系。     

夏牙鲆(♂)与牙鲆(♀)人工杂交的细胞遗传学初步研究

于2004年11～12月在青岛薛家岛养鱼场采用夏牙鲆(Paralichthysdentatus)的精子与牙鲆(Paralichthysolivaceus)的卵子实施了多次人工杂交实验,并进行了父本母本鱼类个体、子代的染色体制片观察和细胞中DNA相对含量的流式细胞仪检测。结果表明,夏牙鲆染色体数为48,核型为2n=48t、臂数NF=48;子代的染色体数和核型与父母本的一样,也为2n=48t;子代的细胞中DNA的相对含量也表明其为二倍体。因此,可以明确其为杂交的后代,而不是雌核发育。     

马氏珠母贝生长性状相关QTL在两个群体中的验证

对两个通过遗传图谱构建定位的马氏珠母贝(Pinctada ucata)生长性状相关的QTL在两个不同群体中进行验证分析。结果显示:QTL471489在深圳群体中与壳高、壳宽显著相关(P0.05),其CT基因型个体的壳高、壳宽和体质量显著大于CC基因型,CT为优势基因型;而在杂交群体中该QTL与生长性状关联不显著(P0.05),但CT基因型的生长性状值仍最大。QTL410206在深圳群体中与生长性状关联不显著(P0.05),而在杂交群体中该QTL与壳高、壳长、壳宽和体质量显著相关(P0.05),AA为优势基因型。基于这两个QTL在这2个群体中分别构建二倍型,发现在深圳群体中C1(CTAT)型和杂交群体中D1(CTAA)、D2(TTAA)、D3(CCAT)、D4(TTAT)、D5(CTAA)型对马氏珠母贝的生长最为有利,可作为优选的基因型组合。