溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附特性研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附机制.试验结果表明溶藻弧菌经营养饥饿、热处理、抗体处理、蛋白酶及高碘酸处理后黏附作用明显下降;在8种碳水化合物的干扰下溶藻弧菌的黏附作用会有一定程度的变化,其中葡萄糖、果糖、甘露糖能明显促进溶藻弧菌的黏附作用;溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液中较大分子量的物质有较强的亲和力.这些结果表明溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液存在特异性黏附作用,这种黏附与细菌活力、其表面的蛋白类、糖类等物质以及黏液的化学组成都有密切关系.     

河流弧菌对牙鲆表皮黏液黏附作用的研究

为了解河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附特性,采用3H-TdR同位素示踪方法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、阳离子、碳水化合物等因子对河流弧菌黏附作用的影响。试验结果表明:河流弧菌能很好地黏附于牙鲆表皮黏液,黏附量随菌浓度升高而增大并符合饱和黏附动力学:y=417.89ln(x)+691.57(R2=0.986);在30℃下黏附量随着孵育时间的延长而增加,180min趋于饱和;孵育温度在4~30℃范围内黏附量随温度升高而增多,30℃时黏附量最大;pH值酸性较碱性黏附作用明显,pH为5时最强;NaCl浓度在0.5%~4.5%范围内,细菌黏附作用随着浓度升高而增强,较纯水存在显著性差异(P<0.05);Ca2+,Mg2+能显著加强河流弧菌的黏附作用,但Ca2+作用明显超过Mg2+;葡萄糖等8种碳水化合物能显著促进河流弧菌的黏附作用(P<0.05)。以上结果说明:河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附量较大,这有利于进一步感染、致病;河流弧菌的黏附作用受温度、pH值、阳离子、碳水化合物等多种环境因子的影响,较高的水温有利于河流弧菌的黏附,有利于疾病的发生。     

不同碳源对溶藻弧菌黏附相关表型的影响初探及Hfq对其的调控

为探讨不同碳源对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)黏附相关表型的影响及Hfq对其的调控作用,研究了D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-海藻糖和D-果糖对溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq缺失株及回补株的运动性、菌落形态、鞭毛、胞外多糖及生物膜合成的影响。研究结果显示,4种碳源均使溶藻弧菌群集运动(swarmming)显著增强(P0.001),并受Hfq正调控;游动性(swimming)显著减弱(P0.01),但不受Hfq调控;菌落变得褶皱,并受Hfq负调控;4种碳源不影响溶藻弧菌鞭毛及胞外多糖合成,但D-果糖使其生物膜合成减少,并受Hfq负调控。实验分析表明:4种碳源可能通过调控溶藻弧菌黏性阻力及能量代谢来调控其运动性;并可能通过调控胞外多糖分子结构及理化性质影响其菌落形态;另外,D-果糖在调控生物膜形成过程中具有重要作用;因此,添加不同碳源会影响溶藻弧菌黏附相关表型,可能影响其致病性,但具体调控机制需进一步研究。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na (盐度为0)时,无粘附作用;Ca2 能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2 作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24～36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为107～108CFU/mL形成生物膜的量最大;在30℃,NaCl浓度为3%～5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD590值最大;C 2a+促进副溶血弧菌生物膜的形成,而M 2g+抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

r-干扰素对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在青石斑鱼(Epinephelus awoara)巨噬细胞胞内存活的影响

采用大肠杆菌重组?-干扰素(rIFN-gamma)单独和联合处理青石斑鱼(Epinephelus awoara)头肾巨噬细胞的方法, 进行了重组?-干扰素对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在巨噬细胞内存活研究。结果表明, 溶藻弧菌感染巨噬细胞后暴露于?-干扰素的细胞内细菌存活数量[(1380±80)CFU/mL]明显降低。然而, 在24h, ?-干扰素及脂多糖联合处理组巨噬细胞内溶藻弧菌的存活数量[(463±32)CFU/mL]比暴露于含有或者不含有脂多糖, NG-单甲基-L-精氨酸(NMMA)和过氧化氢酶的?-干扰素处理组少。采用?-干扰素, ?-干扰素和脂多糖, ?-干扰素、脂多糖和NMMA, ?-干扰素、脂多糖和过氧化氢酶四种方式处理24h能提高巨噬细胞过氧化氢的释放, 而不能提高NO2?的产物。另外, 经过?-干扰素处理能够明显降低巨噬细胞对溶藻弧菌的的吞噬作用, 但不影响对溶藻弧菌的杀伤作用。本文数据表明, 过氧化氢的释放和细胞吞噬作用能明显减少溶藻弧菌在巨噬细胞内存活的数量。     

病原性副溶血弧菌在天然海水中的饥饿耐受研究

将副溶血弧菌培养至对数生长期,用天然海水洗脱,调整菌浓度至107个/cm3左右后置于27℃恒温培养箱进行饥饿试验.结果表明:饥饿初期细菌总数、可培养菌数和活菌数都有较大幅度上升;饥饿中、后期,总菌数与活菌数缓慢下降,而可培养菌数下降速度较快.饥饿前副溶血弧菌呈短杆状,染色均匀;饥饿后许多细胞中央出现染色较浅的区域,细胞形态变为椭圆形.副溶血弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附量随着饥饿时间延长而急剧下降,饥饿7 d后的黏附量接近于空白.用SDS-PAGE分析不同饥饿时期菌体蛋白质的差异,结果表明:饥饿30 d后菌体蛋白条带比饥饿前的蛋白质条带少;饥饿60 d后菌体蛋白质条带比饥饿30 d时的多,但比饥饿前少.研究结果对于揭示副溶血弧菌的流行病学特征有重要的参考价值.     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24~36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为10⁷~10⁸CFU/mL形成生物膜的量最大;在30 ℃,NaCl浓度为3%~ 5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD₅₉₀值最大;Ca²⁺ 促进副溶血弧菌生物膜的形成,而Mg²⁺ 抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

两株潜在益生菌安全性评价及其对凡纳滨对虾免疫力和抗WSSV能力影响

本研究以2株潜在益生菌(芽孢杆菌(Bacillus.sp)BZ5株和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)VZ5株)为研究对象。通过研究其溶血特性、常见抗生素的敏感性及感染菌体后凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的存活率,探讨了两菌株对凡纳滨对虾的安全性。注射和浸泡方式下,研究两菌株对凡纳滨虾的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化酶(POD)、抗菌酶活力变化的影响以及感染WSSV的凡纳滨对虾的存活率,探讨了两菌株对凡纳滨对虾免疫力和抗WSSV能力的影响。研究显示:芽孢杆菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株均未表现出溶血特征,且对多数常见抗生素敏感或中度敏感。在106cfu/mL浓度下,芽孢杆菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株未对凡纳滨对虾表现出明显的毒害作用。注射和浸泡方式下,芽孢杆菌组和溶藻弧菌组对虾的SOD、POD活力显著高于对照组(P0.05),其中芽孢杆菌组对虾的SOD、POD活力显著高于溶藻弧菌组(P0.05)。感染WSSV后,芽孢杆菌组和溶藻弧菌组对虾的半数致死时间比对照组分别延长了27.38%和21.43%(注射菌体)、24.73%和8.60%(浸泡菌体)。研究结果表明,芽孢杆菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株在提高对虾免疫力和抗WSSV能力方面具有较好的效果,在对虾养殖生产中有潜在的应用前景。     

Adhesion of pathogenic Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea

Adhesion of Vibrio alginolyticus to the gill mucus of Pseudosciaena crocea has been investigated using [methyl—3H]thymidine as isotope tracer. The results showed that: the adhesive quantity of V. alginolyticus increased with bacterial concentrations and reached equilibrium after incubated for 180 min; the higher adhesive quantity was obtained at 15~30 ℃ and sourish conditions; adhesion of V. alginolyticus could not achieved without Na , and Ca2 played an auxiliary role in the bacterial adhesion; adhesion of V. alginolyticus was inhibited remarkably by starvation, heat treatment and periodic acid treatment; all of the eight kinds of carbohydrates investigated enhanced the adhesion of V. alginolyticus to the gill mucus of P. crocea, among them, glucose, mannose, fructose and maltose showed the specially enhanced adhesion. The results indicated that V. alginolyticus could adhere to the gill mucus of P. crocea facilely in seawater, and this bacterial adhesion was influenced by environmental factors and closely related to superficial carbohydrate structures and some heat-sensitive structures.     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对大黄鱼( Pseudosciaena crocea ) 鳃粘液粘附特性研究

采用间接ELISA法(最低检测值约104cfu)研究不同培养条件、不同培养阶段、抗体处理、营养饥饿等对河流弧菌粘附作用的影响。结果表明,经TSB培养的菌体的粘附作用极显著强于TSA培养的菌体的粘附作用(P<0.01);河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼粘液,粘附量随菌浓度升高而增大并符合饱和粘附动力学:y=0.1782ln(x)1.6923(R2=0.9810);不同生长阶段河流弧菌的粘附能力不同,在培养初期阶段细菌的粘附量先是随着培养时间的延长而增大,并在培养24h后粘附量达到最大,而后随着培养时间的延长其粘附量急剧下降;抗体处理后河流弧菌的粘附量显著低于对照组(P<0.05);营养饥饿菌体的粘附量明显降低。以上结果表明:海水中的河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼鳃粘液,其粘附作用受细菌培养条件、营养状况等自身因素的显著影响。本研究结果有助于了解河流弧菌的流行病学和致病机理。     

Starvation effects on pathogenic Vibrio alginolyticus in natural seawater

To get a better understanding of the starvation survival strategy of pathogenic Vibrio alginolyticus, log-phase cells were inoculated into sterile natural seawater for starvation studies. The results showed that all of total bacteria number, viable bacteria number and CFU number of V. alginolyticus increased remarkably at the initial starvation stage; after reaching their peaks at 5 d, both total bacteria number and viable bacteria number of V. alginolyticus fell slowly, while the CFU number fell more quickly after reaching its peak at 10 d; V. alginolyticus elongated their cells at the prophase of starvation, and then shrunk their volume and turned their shapes into ovals from rods at the anaphase of starvation; starved cells showed more sensitivity to heating and UV; starved cells showed no significant difference from unstarved ones at the lowest detection limit determined by indirect enzyme-linked immu- nosorbent assay （ELISA） ; starved cells＇ ability to adhere to the skin mucus of large yellow croaker （ Pseudosciaena crocea） showed a sharp decline as the starvation time increases; the cellular protein of V. alginolyticus increased remarkably at the ariaphase of starvation. The results indicated that pathogenic V. alginolyticus could survive in starvation for relatively long periods of time （ ≥2 months） in 28℃ natural seawater due to the morphological and physiological changes; however, starved V. alginolyticus cells showed less virulence and higher sensitivity under environmental stresses.     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对牙鲆(Paralichthys olivaceus)粘液的趋化和粘附作用

采用生长曲线法测定了河流弧菌在牙鲆表皮、鳃和肠粘液中的生长情况,结果表明,河流弧菌在3种粘液中都能生长,生长前期符合Logistic模型,然后进入Gompertz模型,在鳃粘液中的生长量高于肠粘液和表皮粘液。采用毛细管法研究了河流弧菌对牙鲆3种粘液的趋化作用,结果表明,河流弧菌对牙鲆3种粘液具有较强的趋化应答,在粘液总蛋白含量相同的情况下,河流弧菌对牙鲆鳃粘液的趋化应答显著强于对表皮粘液的趋化应答（P〈0．05）,而对肠粘液的趋化应答极显著低于对鳃粘液和表皮粘液的趋化应答（P〈0．01）。采用^3H—TdR示踪法进行了河流弧菌对牙鲆3种粘液的粘附作用研究,结果表明,河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率较高,而对肠粘液的粘附率较低,特别是孵育30、60和90min时河流弧菌对牙鲆表皮粘液和鳃粘液的粘附率显著高于对肠粘液的粘附率（P〈0．05）。这些结果表明,河流弧菌能够在牙鲆粘液,尤其是鳃粘液中生长和定植,有利于其进一步感染、致病。     

溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测

建立了大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体检测方法，溶藻弧菌的特异性抗血清由新西兰兔制备，试管凝集法测定抗血清及交叉反应效价，吸附离心法去除交叉反应，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白，现场检测对具典型弧菌病表症大黄鱼病原检出率为100％，表观健康大黄鱼病原检出率为30％，养殖海水检测结果均为阴性，结果表明，间接荧光抗体检测法不仅可以用于已感染发病大黄鱼的快速检测，而且还能用于已感染未发病大黄鱼的检测。     

利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。