大竹蛏(Solen grandis)cDNA文库中微卫星标记的筛选

利用微卫星查找软件SSRIT对大竹蛏cDNA文库(2038条EST)中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行了筛选。最少重复次数设定为5次,共发现包含微卫星位点的EST96条,占整个EST数据库的4.71%;共发现微卫星位点103个,其中含双碱基重复序列77个,数量最多,占总数的74.76%;三、四碱基重复序列分别占微卫星序列总数的22.33%、2.91%,没有发现五或六碱基的重复。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列,利用在线引物设计软件Primer3设计合成引物14对,以南通野生群体为模板PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳发现,其中5对有多态性位点。在5个微卫星位点上,等位基因的数目从2—7个不等,观测杂合度和期望杂合度分别为0.067—1.000和0.066—0.775,香农指数在0.146—1.545之间。结果表明,所筛选的微卫星标记可用于遗传分析。     

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的(CA)15寡核苷酸探针从波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)基因组DNA Bsp143Ⅰ酶切位点的400~1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到73.33%。其中完美型(perfect)类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中,共有28条(31.82%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选,其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析,其中4对引物扩增产物为单态,20对扩增产物呈多态性;20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2~12,平均有效等位基因数为3.5。该波纹唇鱼群体的PIC、Ho、He的平均值分别为0.0782、0.8513、0.5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。     

基于de novo高通量测序的曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)ESTs中微卫星位点筛选与特征分析

对均一化转录组测序获得的47604个曼氏无针乌贼的微卫星序列进行分析,结果表明,乌贼转录组中微卫星位点丰富,每1402nt的EST中就有一段不小于12nt长度的微卫星序列。单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(38.69%),其次依次为三碱基(31.14%)、二碱基(26.35%)、四碱基(3.29%)、五碱基(0.38%)、六碱基(0.14%)重复,短序列类型占微卫星总量的96.18%。同碱基类型的微卫星序列组成又存在差异,AC(54.51%)和AG(31.22%)是最常见的二碱基重复序列;而AGC(16.37%)和AAC(14.06%)是最常见的三碱基重复序列。通过引物设计和体系优化,共筛选到了24对多态性微卫星位点,对来自福建漳州海域的35只野生曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)个体进行群体遗传学检测,结果表明,每个位点检测到的等位基因数3—10个不等(均值5.9个);平均杂合度观测值(Ho)和期望值(H_e)分别为0.518和0.681。除2个位点外所有位点的多态信息含量(PIC)都大于0.5。Hardy-Weinberg平衡检测表明,仅4个位点有显著偏离(P0.05),未检测到连锁不平衡现象。这表明转录组高通量测序技术适于乌贼微卫星位点的开发,获得的SSR标记可用于今后乌贼资源遗传评估和科学有效管理过程。     

条纹斑竹鲨5个地理群体的简单重复序列中间区域分析

简单重复序列中间区域(inter-simple sequence repeat,ISSR)是一种微卫星类分子标记。为明确条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)中国群体的遗传多样性和遗传关系,作者利用ISSR技术对福建厦门(XM)、福建平潭(PT)、广东湛江(ZJ)、海南海口(HK)和台湾(TW)5个土著地理群体的条纹斑竹鲨进行了遗传多样性和遗传关系分析。从56对ISSR引物中筛选出13对多态性引物,扩增共获得81个重复性的位点,其中多态性位点57个,多态位点百分率为70.37%。5个群体的多态位点百分率、Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数分别为38.27%~58.02%,0.1353~0.2155和0.2032~0.3193。UPGMA聚类分析表明PT群体首先和XM群体聚类,再与TW群体聚类,最后与ZJ群体和HK群体形成的分支聚类,即形成了与地理距离远近相关的基因交流模式。     

缢蛏(Sinonovacula constricta)EST-SSR 分布特征及引物开发利用

采用CAP3软件对NCBI上的5296条缢蛏ESTs序列进行了微卫星特征分析。结果表明,经拼接、去冗得到非冗余EST序列3453条,含SSR位点的EST序列267条,共307个SSR位点,检出率为8.89%,平均每6.83kb出现1个SSR位点。设计了40对EST-SSR引物并进行PCR扩增,29对引物能扩增出理想的PCR产物,其中多态性引物14对。利用14对多态性引物分析了乐清湾缢蛏遗传多样性,共检测到等位基因数(Na)61个,每个位点的等位基因数为2—12个。二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占15.96%、37.13%和35.50%。乐清湾缢蛏群体观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别为0.569、0.490和0.449,表明乐清湾缢蛏遗传多样性较丰富。     

刺参(Apostichopus japonicus)EST序列中微卫星分布分析及其标记的筛选

利用微卫星查找软件对现已公布的6632条刺参ESTs的数据库中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行筛选,进而对其微卫星的丰度和分布进行比较研究。共发现微卫星序列416个,占整个ESTs数据库的6.48%;其中含双碱基重复序列146个,数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的65.86%;三、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的26.68%、1.68%、0.24%、5.53%。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列利用Primer软件结合人工方法设计合成引物21对,其中13对有扩增产物且均为多态位点。扩增产物变性聚丙烯酰胺胶电泳,统计每个微卫星标记等位基因数目,计算等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度等统计学指标的评价。结果表明,在13个微卫星位点上,等位基因的数目从3到8不等,等位基因长度从175—382bp,观测杂合度和期望杂合度分别为0.158—0.650和0.198—0.841,所筛选微卫星标记可于遗传分析。     

基于基因组survey的横带髭鲷(Hapalogenys analis)微卫星位点筛选与特征分析

探究横带髭鲷(Hapalogenysanalis)的种质资源情况以及群体的遗传多样性和遗传结构,对于其增养殖实践尤为重要。微卫星分子标记在研究物种种质情况及遗传信息方面有很大优势。采用基因组survey测序方法开发横带髭鲷微卫星位点,结果表明,横带髭鲷基因组大小为543Mb;微卫星位点丰富,共检测到280 378个完美型微卫星位点,相对丰度为415.17个/Mb。二核苷酸重复是最丰富的微卫星类型(56.05%),其次为单核苷酸(29.20%)、三核苷酸(10.28%)、四核苷酸(2.99%)、五核苷酸(1.03%)、六核苷酸(0.45%)重复,短序列重复类型占95.53%。重复单元中A/T, TG/CA为优势重复单元,分别占总微卫星位点数的22.37%和21.98%;10次重复和6次重复的微卫星位点数量最多,占横带髭鲷基因组微卫星总数的14.60%和12.46%。利用筛选出的20对多态性微卫星位点扩增一个供试群体进行群体遗传学检测。结果表明,各位点等位基因数从5到13不等,均值为8.75个;平均观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.808和0.863;多态信息含量(PIC)均...     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)微卫星位点开发—基于(AG)12探针杂交

采用FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)技术和磁珠富集方法开发拟穴青蟹微卫星位点.结果表明,400bp以下长度的序列含微卫星的概率超过400bp以上长度的序列;从二碱基重复类型到五碱基重复类型,完美型微卫星的概率在增加.利用设计的28对引物扩增一个供试群体,其中12对引物能稳定扩增且片段大小基本符合理论长度,10个微卫星位点表现出高度多态性,9个微卫星位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05),两组两两位点间存在连锁不平衡现象(P＜0.0042,经Bonferroni法校正).Micro-Checker分析揭示其中的5个微卫星位点可能存在无效等位基因.排除混合微卫星位点的引物对以及扩增位点PIC值在0.5以下的引物对,8对引物能用于拟穴青蟹群体遗传学等研究.     

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)EST-SSR标记开发及通用性检测

利用已发表的EST序列设计引物并结合PCR筛选的方法,对许氏平鲉多态EST-SSR引物进行了开发。结果表明:(1)许氏平鲉EST-SSR位点发现率为9.14%,核心序列以二碱基重复出现频率最高,占到33.03%,其中以TG/CA基序最为丰富。(2)共设计引物56对,46对实现有效扩增,其中18对具有多态性。(3)野生群体遗传多样性分析显示,每个位点观测等位基因数(Na)为2—9,平均观测等位基因数为3.89;观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及平均值分别是0.0333—0.8000、0.0333—0.7927和0.3037、0.3757;每个位点的多态信息含量(PIC)在0.0323—0.7522之间,其中高度多态位点5个,中度多态位点5个;经Bonferroni校正后,3个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡,但两两位点间不存在连锁不平衡现象。(4)许氏平鲉多态EST-SSR引物对朝鲜平鲉、褐菖鲉通用性检测结果表明,引物对二者的通用率和多态率分别为88.89%、100.00%和33.33%、88.89%。研究表明,这些通用引物可用于相关物种的遗传多样性评价、系统进化分析和比较基因组作图等研究。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannanamei)不同世代养殖群体的遗传多样性分析

采用微卫星位点对凡纳滨对虾的海南群体(进口亲虾繁育的第1世代:G1)、山东和饶平群体(G2)、湛江2和湛江3群体(G3)、湛江1和上海群体(G4)共4个世代7个养殖群体的遗传多样性进行了分析.从21对微卫星引物中筛选出12对有效扩增引物,对7个群体共280个个体进行扩增,得到10个多态位点,共获得等位基因数63个.各位点的等位基因数在2-15个之间,各群体的平均等位基因数在4.70-5.80之间.平均观测(期望)杂合度在0.36-0.43(0.53-0.65)之间.杂合子偏离指数(D)为负值,表明存在杂合子缺失现象.对7个群体、10个多态位点进行Hardy-wleinberng平衡检测,共有54个偏离平衡.对7个群体间的遗传分化水平进行检测,得到近交系数FIS在9个多态位点均为正值,两两群体间的固定指数FST值在0.149-0.375之间.FST显著性检验表明,各群体之间的遗传分化极显著(P<0.01).分子方差分析结果显示,大部分遗传变异(72.17%)来自于群体内,来自于群体间的遗传变异(27.83%)较小.凡纳滨对虾不同世代间遗传变异大,随着繁育世代的增加,遗传多样性降低.     

中国鲎(Tachypleus tridentatus)微卫星标记筛选及种群遗传多样性和遗传结构分析

采用FIASCO方法构建了中国鲎(Tachypleus tridentatus)(CA)_n微卫星富集文库,对214个阳性克隆进行测序,筛选获得60条含有微卫星的序列,其中可设计引物的序列共38条。38对微卫星引物在37个中国鲎个体中PCR检测发现,只有9个位点具有多态性,其等位基因数为5—14个,每个位点平均具有8.1个等位基因。9个位点之间不存在连锁。利用该9个具有多态性微卫星标记分析了中国沿海9个中国鲎地理群体的种群遗传多样性和遗传结构。结果表明:中国沿海的中国鲎种群遗传多态性水平仍较高, 9个地方群体间无遗传差异,它们之间未见显著分化,且有着较高的基因流;推测人为的迁移是造成遗传无分化的主要原因。我们建议中国鲎已绝迹的海域可从其他海域引入中国鲎个体来恢复地方群体资源。     

单环刺螠(Urechis unicinctus)微卫星标记开发及5个地理种群遗传结构分析

采用高通量测序法从单环刺螠基因组中开发微卫星标记,并通过一个秦皇岛单环刺螠野生群体对其进行多态性评价,利用获得的多态性引物对秦皇岛、烟台、潍坊、青岛、大连5个不同海区的野生单环刺螠群体进行了遗传多样性及遗传结构分析。结果表明:本实验设计的50个微卫星标记能稳定扩增的有38个,其中22个微卫星位点在5个群体中均表现为高多态性,等位基因数(Na)介于24—44之间,多态信息含量(PIC)介于0.921—0.967之间。5个群体总的平均有效等位基因数(N_e)范围为6.629—8.850,平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)范围分别为0.790—0.912、0.851—0.896,大连群体的杂合度最大(H_e=0.8962),潍坊群体的最小(H_e=0.8510),其中有12个微卫星位点在不同群体中出现显著偏离Hardy-Weinberg平衡的现象。平均遗传分化指数(FST)表明,群体分化水平处于中等分化水平(FST值为0.0880—0.1136);聚类分析显示烟台群体先与青岛群体聚为一支,再与秦皇岛群体聚类,然后跟潍坊群体聚为一支,大连群体单独聚为一支;遗传距离模式(IBD)显示单环刺螠群体的地理距离与遗传距离间不存在显著的线性关系。本研究开发的22对微卫星标记可以用于单环刺螠遗传结构分析研究,为下一步单环刺螠种质资源保护和人工繁育提供参考依据。     

日本蟳(Charybdis japonica)微卫星位点的分离及遗传多样性分析

采用磁珠富集法,以生物素标记的(cA)12寡核苷酸为探针,构建了日本蟳基因组微卫星富集文库.通过PCR法从文库中共筛选出89个微卫星位点,其中完全型(perfect)共75个,占84.27%;不完全型(imperfect)12个,占13.48%;复合型(compound)2个,占2.25%.根据微卫星位点的侧翼序列,设...     

许氏平鲉(Sebastes schlegeli)微卫星标记开发及野生、养殖群体遗传多样性分析

对许氏平鲉进行简化基因组测序,设计微卫星引物200对,可稳定扩增的引物190对,占95%。利用一个荣成野生群体对24个多态性较高的微卫星标记进行了评价,每个位点的等位基因数(Na)为2—21个,观测杂合度(Ho)为0.0417—0.9167,期望杂合度(He)为0.0278—0.9722,多态信息含量(PIC)为0.1948—0.9496,结果显示有20个微卫星位点为中高度多态。利用这些引物对荣成野生群体和烟台养殖群体的遗传多样性进行了比较分析,野生和养殖群体的平均等位基因数(Na)分别为8.5000、6.9583,有效等位基因数(Ne)的均值分别为4.5484、3.6365,期望杂合度(He)均值分别为0.6421、0.5840,多态信息含量均值(PIC)分别为0.6088、0.5490,平均香农-威纳指数均值为1.4605、1.2834,但F检验发现无显著差异,发现两个群体的遗传多样性都处于高度多态水平,但养殖群体遗传多样性水平低于野生群体。本研究结果说明许氏平鲉的人工繁育中,通过使用较大数量的亲本进行繁育可有效防止选育群体的遗传多样性降低,但人工定向选育对选育群体的遗传多样性也产生了一定的影响。Bonferroni校正后在两个群体中各有4个位点偏离Hardy-Weinberg平衡。本研究开发的微卫星标记为许氏平鲉遗传图谱构建、分子标记辅助育种等提供了更多标记选择,对野生和养殖群体遗传多样性分析为下一步的遗传育种提供参考。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)野生与选育群体的微卫星遗传多样性分析

为了评估长牡蛎(Crassostrea gigas) 2个壳长性状(掌心形)快速生长选育群体(LY2-K4、LY2-K7)、1个壳高性状(速生型)快速生长选育群体(LY2-K11)和6个野生群体(QHD、LS、HD、ZH、WD、KTD)的遗传多样性和遗传结构, 用21对多态性丰富的微卫星引物对9个长牡蛎群体的269个个体进行了遗传分析。结果显示: 21个微卫星位点共检测出了460个等位基因(N_a),平均等位基因数为21.905; 21个微卫星位点的多态信息含量(PIC)均大于0.5, 具有高度遗传多态性; 选育群体LY2-K11的遗传多样性最低(N_a=13, I=2.128,H_e=0.831, PIC=0.825), 野生群体KTD的遗传多样性最高(N_a=29,I=3.112, H_e=0.941, PIC=0. 938); 189个群体位点组合有66%偏离哈代-温伯格平衡, 表明这些群体存在一定程度的杂合子缺失; 9个群体间的遗传分化指数(F_st)为0.012~0.064, 处于较低的遗传分化水平; AMOVA分析显示遗传变异主要来自于个体内; PCoA分析结果与UPGMA聚类树一致, LY2-K11群体单独聚为一类, QHD和HD群体聚为一类, 其他6个群体聚为一类。综上所述, 长牡蛎3个选育群体和6个野生群体遗传多样性均较高, 遗传分化水平较低; 选育群体LY2-K11多样性略有下降, 选育过程中应保证亲本的数量及质量, 防止因近交衰退造成遗传多样性降低, 苗种抗逆性变差。该结果将为长牡蛎新品种的选育和野生种质资源的保护提供科学指导。     

基于SLAF-seq技术的黑棘鲷微卫星标记开发及其在鲷科鱼类中的通用性研究

黑棘鲷(Acanthopagrusschlegelii)是广泛分布于西北太平洋的暖温性中下层经济鱼类,也是我国沿海重要的海洋捕捞鱼类和增养殖对象。然而,目前有关黑棘鲷的微卫星标记研究报道较少,难以对其种质资源状况作出精确评估。本研究采用SLAF-seq技术测序共获得22489个二至六碱基重复的黑棘鲷微卫星序列,短重复序列(二、三碱基)占总微卫星序列的90.8%,长重复序列(四至六碱基)占有9.2%。经过157对随机合成引物的多态性筛选,开发出49个高多态性的黑棘鲷微卫星标记,其中短重复序列位点有25个,长重复序列位点有24个。每个位点的等位基因数(Na)为2—20(均值为8.3),观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.097—0.938和0.122—0.922(均值分别为0.663和0.701),多态信息含量(PIC)为0.118—0.897(均值为0.655)。经Bonferroni校正后,有47个位点符合哈迪-温伯格平衡(HWE),各位点间未检测到连锁不平衡现象,仅2个位点偏离HWE。结果表明,所开发的大部分微卫星标记具有高多态性,蕴含的遗传信息含量较为丰富,能够为黑棘鲷的种群遗传资源评估提供数量充足、类型多样的有效分子标记。跨物种扩增结果显示,有43个黑棘鲷微卫星标记可在9种鲷科鱼类中成功扩增,其中28个标记在太平洋棘鲷(Acanthopagruspacificus)、黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)和澳洲棘鲷(Acanthopagrusaustralis)中具有较好的通用性,2个标记在平鲷(Rhabdosargussarba)、蓝点赤鲷(Pagruscaeruleostictus)、真赤鲷(Pagrusmajor)、二长棘犁齿鲷(Evynnis cardinalis)及黄牙鲷(Dentex hypselosomus)中具有通用性。这些通用性标记可为阐明鲷科属、种间的系统进化关系和棘鲷属鱼类的群体遗传学分析提供新的标记来源和研究角度。     

我国沿海不同地理原种文蛤(Meretrix meretrix)的SRAP分析

采用序列相关扩增多态SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)标记对国家级江苏文蛤良种场(筹)保存的广西北海(GX)、江苏南通(JS)、辽宁大连(LN)三个地理种群原种文蛤进行种质资源分析。结果表明:(1)15对引物在文蛤3种群共扩增223个位点,其中多态位点数为159个,多态性位点百分率为71.30%,显示了较高的多态性;(2)GX、JS、LN3种群的多态性位点百分率分别为69.12%、57.81%、51.85%,平均杂合度分别为0.2532、0.2162、0.1836,香农信息指数分别为0.3649、0.3127、0.2714,均以GX种群最高,表明GX种群遗传多样性更为丰富;(3)3种群扩增位点显性基因频率的分布规律揭示,与LN和JS两种群相比,GX种群中低频基因位点显著增加,而隐性纯合基因位点显著减少,表明GX种群中存在大量稀有等位基因。各地理种群原种文蛤遗传多样性水平相对较高,遗传改良潜力大,GX种群作为选择育种的基础群更为适合。     

中国鲎基因组微卫星富集文库的构建及分析

本研究旨在从DNA分子水平上研究中国鲎(Tachypleus tridentatus)种群遗传多样性及种群结构等相关信息,以期为保护其野生群体种质资源提供科学依据。本研究通过生物素—磁珠富集法筛选微卫星标记,构建中国鲎基因组微卫星文库。基因组DNA经Fast Digest Tru1I酶切后,选取400 bp~1000 bp片段,用生物素标记的(GT)15、(CT)15混合探针与其杂交,杂交复合物与链霉亲和素磁珠结合,捕获含有重复序列的微卫星片段,纯化后连接PMD19-T载体克隆,构建基因组微卫星文库。从334个阳性克隆中随机选取196个片段大于400 bp的阳性克隆进行测序,共获得127个微卫星序列,其中完美型占69.3%、非完美型占11.0%、复合型占19.7%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到多碱基GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA的重复序列。根据微卫星序列设计选择合成40对引物,结果显示其中3对具有较高多态性,可作为进一步评价中国鲎野生种质资源等遗传信息的有效遗传标记。     

我国沿海棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）群体遗传结构的AFLP分析

利用AFLP技术分析了我国沿海棘头梅童鱼8个地理群体（山东荣成、江苏南通、启东、上海芦潮港、浙江温州、瑞安、福建福州和广州番禺）的遗传结构特征。10对引物组合在8个群体160尾个体中共扩增出272个位点,多态位点72个,多态位点比例为26．47％。8个地理群体的多态位点比例、Nei遗传多样性指数分别为8．82％-15．...     

洞庭湖水系五强溪水库光泽黄颡鱼(Pelteobagrus nitidus)遗传多样性的AFLP分析

为了了解沅水五强溪大坝阻隔对光泽黄颡鱼可能造成的遗传多样性影响,采用AFLP分子标记技术,对沅水五强溪水库库区和沅水下游两个光泽黄颡鱼野生群体进行了遗传多样性分析。9对选择性引物在两个光泽黄颡鱼群体中,共扩增出1243个位点,多态位点1091个,多态位点比率为87.77%。其中库区和沅水下游群体多态位点比率分别为85.41%、83.25%,观测等位基因数分别为1.854±0.592、1.803±0.622,有效等位基因数分别为1.597±0.381、1.574±0.377,Nei’s多样性指数分别为0.220±0.211、0.207±0.195,Shannon’s信息指数分别为0.330±0.305、0.302±0.338;两个群体内的平均遗传距离分别为0.124±0.072、0.119±0.057,群体间的平均遗传距离为0.127±0.100。两个群体的遗传参数比较不存在显著差异(P0.05)。聚类分析显示,UPGMA系统树没有依据群体而形成明显的两大分支。以上结果表明,五强溪水库库区和沅水下游两个光泽黄颡鱼群体的遗传多样性丰富,光泽黄颡鱼种群遗传结构对水库大坝阻隔的响应不明显。