3种水产病原菌简型基因芯片检测技术的建立

根据水产养殖中常见的3种病原菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的研究资料,筛选3个毒力相关基因toxR、aerA、evpA设计引物和探针,构建简型基因芯片,并使用对虾白斑病综合征病毒(WSSV)variable region的PCR荧光标记产物作为表面化学质控。通过已构建和优化的多重PCR反应条件,获得了3个目的基因的PCR产物;经过芯片制作过程的优化,将探针以终浓度20μmol/L溶于50%DMSO,在室温、相对湿度45%的条件下点印于醛基基片表面。扩增的PCR产物与杂交液混合后,在42℃杂交2 h就可检测到理想的杂交信号。芯片的灵敏度试验结果表明,可以检测到的3种水产病原菌的最低模板DNA为:鳗弧菌3×102拷贝、嗜水气单胞菌5×103拷贝、迟缓爱德华氏菌6×101拷贝。该芯片可成功应用于患病大菱鲆内脏的细菌分离物的鉴定。     

乳酸杆菌LH对几种水产养殖病原弧菌的抑制作用

为探明乳酸杆菌（Lactobacillus spp．）LH对水产养殖病害的生物防治功能，采用试管稀释法和平板抑菌圈检测法，探讨了乳酸杆菌LH代谢产物对沙蚕弧菌（Vibrio nereis）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyicus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、漂浮弧菌（Vibrio natriegen）的抑制能力，并在模拟养殖水体实验中探讨了乳酸杆菌LH对哈维弧菌的抑制效果．结果显示，乳酸杆菌LH培养12h的代谢产物没有抑菌活性，培养24～96h的代谢产物有明显抑菌活性，随着培养时间的延长，其代谢产物的抑菌活性增强；乳酸杆菌LH代谢产物对病原弧菌的最低抑菌浓度为8倍稀释液；在模拟养殖水体中，10^3个／cm^3乳酸杆菌LH即对哈维氏弧菌有明显的抑制作用，抑制作用随哈维氏弧菌菌量（10^3～10^6个／cm^3）的增大而减弱．结果表明乳酸杆菌LH对病原弧菌具有良好的抑制作用．     

采用UPPCR-SSCP技术快速鉴定水产养殖病原性弧菌的研究

采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPPCR－SSCP技术,对弧菌科弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、费尼斯弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌的16S－RNA基因进行检测。结果发现,UPPCR－SSCP技术能较好地鉴别细菌的不同种,但对同种不同株细菌的区分较困难。认为PCR－SSCP是将病原菌至种的有力工具。上研究对水产养殖病原菌的快速诊断与及时防治有重要意义。     

鱼类4种病原弧菌耐药性及主要外膜蛋白OmpK基因检测

对鱼源4种病原弧菌(鳗弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌、秦皇岛弧菌)进行了对常用抗菌类药物的耐药性测定,结果表明,鳗弧菌对青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、克林霉素、万古霉素、杆菌肽等6种常用药物耐药;哈氏弧菌对青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、杆菌肽等4种常用药物耐药;鱼肠道弧菌对苯唑青霉素和杆菌肽等2种耐药;秦皇岛弧菌对青霉素G、苯唑青霉素、氨苄青霉素、克林霉素、杆菌肽等5种耐药.根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从4种病原弧菌总DNA中均扩增外膜蛋白OmpK的基因片断,结果鳗弧菌、哈氏弧菌、秦皇岛弧菌及鱼肠道弧菌均扩增得到约800bp DNA片段,但鱼肠道弧菌扩增的片段较模糊.     

一种牙鲆新病原弧菌的主要生物学特性研究

从一起呈败血症感染病例的养殖牙鲆 ( Paralichthys olivaceus L.Temminck et Schlegel ) 肝、腹水及腐烂组织中检出了一种相应的病原菌,取 10 株该病原菌的纯培养菌做形态特征、培养特性、理化特性及代表菌株 16S rRNA 基因序列测定等,表明为弧菌属 ( Vibrio Pacini 1854 ) 细菌的一个新种 ( sp. nov. ) 并定名为牙鲆弧菌 ( Vibrio olivaceus sp.nov. ).同时,对该菌进行了人工感染的致病作用及对抗菌类药物的敏感性等方面的检验,结果显示对牙鲆具有较强的致病作用,对供试的 37 种抗菌类药物在不同菌株间的敏感及耐药无明显差异.     

四种弧菌对中国对虾的致病性研究

１９９５年８月－１９９６年４月,采用注射感染、浸浴感染、创伤感染和投喂感染比较溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、弗尼斯弧菌及其胞外产物对中国对虾的致病性,测定它们的半致死浓度,观察弧菌感染引起的病理组织变化。结果表明,注射感染中,溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和弗尼斯弧菌２４小时的半致死浓度（ＬＤ５０）分别是１．２×１０＾６,６．５×１０＾７,４．０×１０＾８,６．８×１０＾９（ＣＦＵ／ｍｌ）;４８小时     

3种水产病原弧菌(Vibrio)的16S—23S rDNA间区(IGSs)的克隆、测序与分析

根据细菌16S rDNA3端和23S rDNA5端的高度保守区设计引物,PCR扩增了5株溶藻弧菌、2株河流弧菌和2株创伤弧菌的16S—23S rDNA间区,克隆到pGEM-T载体上,测序;采用BLAST和DNAstar软件对16S—23S rDNA间区序列及其内的tRNA基因进行比较分析研究。结果表明,3种弧菌共测出的16S—23S rDNA间区有33条,类型有6种:IGSGLAV、IGSGLV、IGSIA、IGSG、IGSA和IGS0,其中IGSIA和IGSG最为常见,9株弧菌均包含有此两类IGS;在3种弧菌中,大部分IGS序列tRNA基因两端的非编码区具有较高的种内同源性,可以成为设计种特异性引物和探针的靶区。16S—23S rDNA间区结构的差异为建立一类新的弧菌检测方法奠定了基础。溶藻弧菌的16S—23S rDNA间区序列为首次报道。     

3种致病弧菌感染对大黄鱼7种酶活性的影响

大黄鱼溃疡病主要由3种致病弧菌引起:溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈维弧菌V. harveyi和副溶血弧菌V. parahaemolyticus。为了解大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理,对其疾病防御提供重要的理论基础,本实验将健康的大黄鱼随机分为3个实验组和1个对照组,分别注射0.2 mL的哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水。在人工感染后的第0,1,2,4,7,10,13,16,20天分别采样,通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性,比较这3种致病弧菌对大黄鱼影响的差异性。结果表明:在感染后的1～10 d,实验组大黄鱼血清中血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性变化,总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于-致的现象,且不同病原菌之间存在-定的时效差异。 碱性磷酸酶(AKP)对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感,ACP、POD和MPO对溶藻弧菌反应较敏感,LSZ和PO对副溶血弧菌反应较敏感。     

牙鲆病原秦皇岛弧菌的血清型及荧光抗体检验

用分离于病(死)牙鲆(Paralichthys olivaceus L.)的一种新病原弧菌——秦皇岛弧菌(Vibrio qinhuangdaora sp.nov.)的代表菌株(HQ010712-1株),分别制备全菌(OK)及热处理(121℃作用1h)的菌体(O)免疫原,强化免疫接种家兔制备相应抗血清,对供试12株秦皇岛弧菌进行了血清型检定,结果表明均存在同种的K抗原和同种的O抗原(血清同源),其中O抗原具有强免疫原性、K抗原的免疫原性弱但具有强O凝集抑制作用;以相应OK抗血清为第一抗体,以标准的羊抗兔IgG荧光抗体为第二抗体,对12株秦皇岛弧菌的纯培养物及用代表菌株(HQ010712-1)人工感染病死牙鲆的肝组织进行了间接荧光抗体染色,结果显示了特异的荧光反应。     

溶藻弧菌的PCR快速检测方法

为建立溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR快速检测方法,本研究根据弧菌toxR基因的高变区序列设计1对扩增片段为161 bp的引物,进行了特异性和敏感性试验.结果表明该方法能特异地检测溶藻弧菌,每个PCR反应检测的敏感度为0.01 pg的DNA和3.7CFU的细菌.用溶藻弧菌人工感染大菱鲆,以建立的PCR方法检测感染鱼的肝、脾、肾阳性检出率为100%.该方法可用于对感染溶藻弧菌的水生动物疾病进行诊断.     

不同提取缓冲液对红树林土壤DNA提取品质的影响

针对1种典型的酸性、高有机质含量类型土壤-红树林土壤,从DNA产量、DNA纯度、土壤腐殖酸类物质的提取量以及DNA提取物PCR(polymerase chain reaction)扩增反应的敏感度等方面比较了不同提取缓冲液对土壤DNA品质的影响.结果表明,酸性SDS(sodium dodecyl sulfate)提取缓冲液所获得的土壤DNA产量及纯度均较低;PVP (polyvinylpyrrolidone)提取缓冲液所获得的土壤DNA产量较高,但土壤腐殖酸类物质的提取量亦远高于其他提取缓冲液;酸性SDS提取缓冲液及PVP提取缓冲液所获得的土壤DNA提取物即使稀释到10-3量级亦不能获得目的基因PCR扩增条带.PVPP(polyvinylpolypyrrolidone)提取缓冲液及CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)+PVPP提取缓冲液所获得的土壤DNA产量较PVP提取缓冲液低,但其纯度较高,并且其纯度随提取缓冲液中PVPP浓度的升高而提高;当2%PVPP提取缓冲液及CTAB+PVPP提取缓冲液所获得的土壤DNA提取物分别稀释到10-2及10-1量级时,均能获得PCR扩增条带.综上所述,酸性提取缓冲液及PVP提取缓冲液不适用于酸性、高有机质含量类型土壤DNA的提取,而2%PVPP提取缓冲液及CTAB+PVPP提取缓冲液均能提高此类土壤DNA的提取品质.     

纤细角毛藻培养条件优化

采用正交实验的方法，对影响纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)生长的主要营养因素进行了优化，获得了以海水为基础的优化培养基配方：NaHCO30．15g／L，NazSiO3(9H2O0．20g／L，NANO3 1．00g／L，KH2PO4 0．02g／L，VB1 2．7mg／L，VB12 1.5μg/L。实验表明，用该优化配方培养纤细角毛藻具有生长速度快、产量高的显著优势，为该微藻在光生物反应器中的进一步高密度培养提供了良好条件。     

Detection of DNA damage in mussels and sea urchins exposed to crude oil using comet assay

The single-cell microgel electrophoresis assay or the comet assay was used to evaluate DNA damage of dispersed crude oil on sea urchins (Strongylocentrotus droebachiensis) and mussels (Mytilus edulis L.). Sea urchins were exposed to 0.06 and 0.25 mg/L dispersed crude oil in a continuous flow system, while the mussels were exposed to 0.015, 0.06 and 0.25 mg/L dispersed crude oil. Sea urchin coelomocytes and mussel haemocytes were sampled after 4 and 5 weeks exposure, respectively. In the sea urchin coelomocytes, there was a significant concentration-related increase in the percentage of DNA in comet tail. In mussel haemocytes, there was a significantly higher percentage of DNA in comet tail for all treatments compared to the control. The responses were concentration-related up to 0.06 mg/L oil. The two highest exposure concentrations of mussels were not significantly different from each other. These results indicate that the comet assay can be used for biomonitoring of DNA damage in marine invertebrates following oil contamination.     

微量生物碳酸盐ICP-OES 元素分析中的仪器优化

为优化电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测试微量生物碳酸盐中元素含量的工作条件, 在Thermo-Fisher 公司生产的iCAP 6300 Radial 型ICP-OES 上, 对1 050 组仪器条件、32 种不同组成的标准溶液、36 个谱线对和两种仪器校正工作曲线进行了测试; 借助开源科学计算软件Scilab 数据插值和可视化技术对测试数据进行了比较分析。结果表明, 该仪器测试微量生物碳酸盐中Mg/Ca 和Sr/Ca 比值的最佳条件为: 雾化器, 0.1 mL/min 同心雾化器; 冷却气流量, 缺省设置12 L/min; 辅助气流量, 0.5L/min; 雾化气压力, 0.24 MPa; 蠕动泵速, 16 r/min; RF 功率, 1 000 W; 观察高度, 15 mm; 谱线, Ca373.690 nm, Mg 279.553 nm {121}, Sr 407.771 nm; 仪器校准工作曲线为强度-浓度工作曲线。     

微量生物碳酸盐ICP-OES元素分析中的仪器优化

为优化电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测试微量生物碳酸盐中元素含量的工作条件,在Thermo—Fisher公司生产的iCAP6300 Radial型ICP—OES上,对1050组仪器条件、32种不同组成的标准溶液、36个谱线对和两种仪器校正工作曲线进行了测试;借助开源科学计算软件Scilab数据插值和可视化...     

半滑舌鳎封闭式循环水养殖系统的设计与应用

设计了生物承载量为45t、养殖密度为45kg/m3的半滑舌鳎封闭式循环水养殖系统,对养殖半滑舌鳎8个月的水处理效果进行测定和分析。循环水系统设计主要参数为:养殖半滑舌鳎3万余尾,补水量53m3/d,补水率约5%,供氧量7.4kg/h,循环量1 281m3/h,循环次数为20次/d,生物过滤器有效体积为106m3。经系统处理后,养殖池内水温为18～21℃,pH=7.0～8.0,DO≥6.6mg/L,养殖池进水氨氮0.017～0.178mg/L,亚硝酸氮0.012～0.064mg/L,细菌0～220个/mL,弧菌0～30个/mL。系统的水处理效果达到了养殖鱼对水质的要求。试验期间,共投喂饵料34 511kg,饵料系数1.1。试验结束时,生产半滑舌鳎成鱼41 469kg,与传统养殖模式相比,提高了养殖产量。本系统在水产养殖生产中具有一定的借鉴和推广使用价值。     

PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交 检测白斑综合症病毒(WSSV)

用PCR法成功制备了DIG标记探针，探针长度为547bp，探针的产量为21.6ng/μL。此探针与随机引物合成探针检测样品灵敏度相近。用此探针核酸斑点杂交法检测了54尾中国对虾。结果表明此探针在对白斑综合症病毒的检测、对虾暴发性流行病的诊断等方面具有很高的应用价值。     

亚硝酸盐现场自动分析仪化学分析工艺流程的优化研究

通过对亚硝酸盐分析工艺的优化研究,为亚硝酸盐现场自动分析仪的设计提供了可靠的依据;简化了分析工艺,便于实现仪器的自动化;有利于仪器的小型化。哑硝酸盐分析工艺的优化技术,还可以推广到其它化学要素的现场自动分析仪的研制过程中。     

用于紫菜无性系种质鉴定的计算机化DNA指纹的建立

研究用RAPD技术对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)、坛紫菜(P.Haitanensis)、半叶紫菜(P.Katadai var.Hemiphylla)和少精紫菜(P.Oligospermatangia)的15个无性系丝状体进行了遗传多样分析,用120个Operon引物进行了筛选,从中选用来自OPJ-18和OPN-02扩增出的8条多态性条带构建了这15个紫菜无性系的DNA指纹图谱,在该图谱中每个紫菜无性系均有各自特异的DNA指纹.用1和0分别表示DNA带的出现和缺失,将各个无性系的DNA指纹用计算机语言表示,建立了15个紫菜无性系的计算机化DNA指纹;在此基础上设计了紫菜无性系种质鉴定的计算机软件PhGI.