海湾扇贝样品不同保存条件下DNA的提取及RAPD扩增比较

以海湾扇贝为材料，研究了鲜活样品以及采用冷冻保存、70％乙醇固定和10％福尔马林固定等方法保存的闭壳肌样品用于DNA提取的不同效果，并分析了不同保存条件下所提得DNA用于RAPD扩增的结果，研究表明，鲜活样品以及采肜冷冻保存和70％乙醇固定的样品可以得到很好的DNA，其质量和得率没有显著差异，利用上述DNA模板进行RAPD分析，可以获得一致性很好的扩增结果。10％福尔马林休固定样品则没有得到可用的DNA模板。采用70％乙醇固定保存海洋生物组织，是用于DNA提取及相关的分子生物学研究的快速、简易和有效的方法。     

用于单-藻细胞PCR扩增反应的样品保存方法比较

用室内培养的塔玛亚历山大藻（Alezandrium tamarense ATHK藻株）作为实验对象,分别选择了5％福尔马林固定后常温保存、95％乙醇固定后常温保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液（Lugol’s solution）固定后常温保存等方法,在5,15,30,60d后对保存的样品进行单细胞PCR反应,并与新鲜样品进行比较。实验结果表明,用95％乙醇保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液保存的样品在60d后仍可扩增出目标条带,与新鲜样品没有差别,但是样品中的藻细胞形态有一些改变;而以5％福尔马林固定保存的样品只能在5d后扩增出目标条带,但藻细胞形态比较完好。因此,对用于单细胞PCR实验的微藻样品,短期内（不多于5d）可以采用福尔马林保存,而需要长期保存的样品,应当采用乙醇或鲁哥氏液固定,或者采用-20℃冷冻保存的方法。     

固定标本的DNA提取及PCR扩增

报道福尔马林、酒精固定的日本绒螯蟹标本的 DNA提取及 PCR扩增 ,并与冷冻、煮沸标本进行了比较。结果表明 ,福尔马林固定标本与酒精固定标本一样可以提取 DNA,加入的蛋白酶 K量越多 ,DNA的回收率越高。以提取的 DNA为模板 ,进行了线粒体 DNA12 S r RNA和 D- loop基因片段的 PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物后均得到了与期待的碱基长度相一致的清晰谱带。     

不同保存方法的大黄鱼肌肉样品基因组DNA提取及RAPD分析

以－20℃冷藏、70％（V／V）乙醇、含50mmol/dm^3 EDTA的70％（V／V）乙醇和10％（V／V）福尔马林保存等方法处理大黄鱼肌肉样品，进行了DNA的提取及RAPD分析，并与新鲜样品作了对照。实验结果表明，鲜活样品以及冷冻保存、70％（V／V）乙醇以及含50mmol/dm^3EDTA的70％（V／V）乙醇保存的样品均可得到高质量的DNA，大小在21kbp左右，含量为100μm/cm^3左右。而从10％（V／V）福尔马林保存样品也能提到DNA，但其DNA得率低，约10μg/cm^3。分别以上述提取的DNA为模板进行RAPD扩增，未见有明显的差异。     

用于单一藻细胞PCR扩增反应的样品保存方法比较

用室内培养的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense ATHK藻株)作为实验对象,分别选择了5%福尔马林固定后常温保存、95%乙醇固定后常温保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液(Lugols solution)固定后常温保存等方法,在5,15,30,60 d后对保存的样品进行单细胞PCR反应,并与新鲜样品进行比较。实验结果表明,用95%乙醇保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液保存的样品在60 d后仍可扩增出目标条带,与新鲜样品没有差别,但是样品中的藻细胞形态有一些改变;而以5%福尔马林固定保存的样品只能在5 d后扩增出目标条带,但藻细胞形态比较完好。因此,对用于单细胞PCR实验的微藻样品,短期内(不多于5 d)可以采用福尔马林保存,而需要长期保存的样品,应当采用乙醇或鲁哥氏液固定,或者采用-20℃冷冻保存的方法。     

碱煮法:一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的实用方法

介绍了一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的方法——碱煮法。取少量海水样品(40μL)．直接经0．25mol／L艺机NaOH和99℃温育处理裂解细胞,从而得到环境样品总DNA。实验证明,该方法制备的模板DNA可用于细菌核糖体RNA、浮游植物叶绿体rbcL和浮游动物线粒体COI等基因的PCR扩增。但是,在使用通用引物扩增细菌基因时,假阳性很难避免。该法制备的模板DNA适用于扩增非细菌基因或者特异引物界定的细菌基因。该方法较传统制备方法快速、简便,样品需要量减少,适用于浮游生物分子遗传多样性研究。     

海绵动物保存及DNA提取方法的研究

海绵标本长期、完整的保存是开展海绵分类学及分子进化研究的重要前提, 本研究以建立通用的海绵动物标本的保存方法及快速、完整的基因组DNA 提取方法为主要目的, 通过对硅质的山海绵(Mycale sp.)和钙质的白枝海绵(Leucosoleniidae sp.)为材料进行–20℃冰冻、乙醇固定、冰冻后风干和乙醇固定后风干等4 种保存方法进行研究, 同时采用酚-氯仿法、高盐法、CTAB 法等3 种基因组DNA提取方法, 测试了4 种保存方法的DNA 提取效率。实验结果显示, 海绵样品的4 种保存方法以及3 种DNA 提取方法对于硅质海绵以及钙质海绵虽然在提取的DNA 得率上有差异, 但都能获得较高纯度基因组DNA。从经济成本、方便性、潜在的污染等因素考虑, 高盐法是首选的提取海绵基因组DNA 的方法; 乙醇固定保存的海绵样品DNA 得率最高, 冰冻的海绵样品得率最低, 推荐采用乙醇固定保存海绵样品的方法。     

不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较

以采自厦门港的中华哲水蚤(Calanus sinicus)为对象，研究多种保存条件对中华哲水蚤基因组DNA提取的影响。结果表明，除5％福尔马林保存的样品没有提取到DNA之外，其余样品均能成功提取出基因组DNA；以该DNA为模板通过相应引物成功扩增出线粒体DNACOI基因片段。其中无水乙醇保存样品提取可靠的基因组DNA方法的建立，为野外样品保存工作提供了一个简便，经济的途径。     

几种热浸镀层钢丝在青岛海水中腐蚀行为的对比研究

以热浸镀Zn、0．2％Al-Zn-RE、5％Al-Zn-RE和55％Al-Zn-Si合金镀层钢丝为研究对象,进行了为期6个月的室内海水浸泡试验。结果表明,热浸镀Zn钢丝和0．2％Al-Zn-RE合金镀层钢丝的腐蚀速度是5％Al-Zn-RE和55％Al-Zn-Si合金镀层钢丝样品的2～3倍：同时建立了一种“极化-弛豫-电化学阻抗测量”的循环测试方法,对这几种热浸镀层在青岛海域海水中的腐蚀行为进行了初步探讨。     

斜带髭鲷养殖群体遗传多样性RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对广东饶平海水网箱养殖的斜带髭鲷（Hapalogenys nitens Richardson）人工苗养殖群体DNA多样性进行检测。首先从40个引物（S461～S480,S501～S520）中快速筛选出32个引物,它们均能扩增出清晰稳定的DNA片段。再将该32个引物对46尾斜带髭鲷进行RAPD分析,共检测到177个位点,其中多态位点55个（分别由18个引物获得）,占31．07％。由此得出该群体的平均多态性为31．07％,平均遗传差异度为0．089,表明该养殖群体遗传多样性水平较高。     

纤毛虫单细胞基因组DNA微量提取方法的比较及优化

在纤毛虫的分子生物学研究中,单细胞基因组DNA的微量提取是后续基因分析的关键。本研究以海洋纤毛虫红色伪角毛虫为材料,采用直接取完整虫体、裂解法以及3种改良后的试剂盒微量提取DNA方法,分别提取了新鲜样品与4种不同方法保存样品的基因组DNA,比较了9种组合在PCR产物质量、提取所需时间、成本及便捷性方面的优劣,并进一步比较、讨论和探索了4种样品保存方法和5种DNA微量提取方法在纤毛虫单细胞基因组PCR扩增中的可行性。本工作旨在为后续的纤毛虫分子生物学研究提供可资借鉴的技术路线和方法。     

MALBAC技术扩增微生物群落基因组的效率评估

环境样品的低生物量是微生物宏基因组学研究面临的首要挑战,通过基因组扩增技术来满足高通量测序对DNA样品量的需求是最常用的解决策略。MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)基因组扩增试剂盒最初为扩增和研究哺乳动物的单细胞基因组而研发。本文中,我们通过人工构建的微生物群落来检测该试剂盒在微生物宏基因组扩增方面的效率和应用可行性。结果表明,每个标准反应中,10 pg的DNA模板量足以满足MALBAC试剂盒对样品扩增的需要。每个标准反应DNA模板用量为10和100 pg时,所扩增DNA样品的基因组覆盖度与原始未扩增样品表现出高度的一致性,证明MALBAC试剂盒扩增效果的高度稳定性和一致性。常用的GenomePlex全基因组扩增试剂盒使我们可以在每个标准反应DNA模板量为100 pg的条件下扩增获得足够的DNA样品,但是结果表明该参照试剂盒无法有效的实现对群落中低丰度细菌菌株基因组的线性扩增。对于MALBAC试剂盒和参照试剂盒而言,在扩增高GC含量的微生物物种基因组DNA方面效率低下。我们的实验结果表明MALBAC试剂盒在高效扩增环境样品宏基因组DNA方面的可行性,但对该试剂盒在扩增环境样品中高GC含量微生物物种方面的适用性存在疑虑。     

一种快速制备甲藻细胞PCR扩增DNA模板的方法

报道了一种快速制备PCR扩增甲藻细胞模板DNA的方法。以赤潮甲藻塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）和链状亚历山大藻（Acatenella）为目标藻，对藻液预处理后直接用于PCR扩增，获得5,8S核糖体RNA基因及其两侧的核糖体RNA基因转录单元内基因间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列片段，成功测序。此方法避免了复杂的DNA提取过程。     

Screening of protease-producing marine yeasts for production of the bioactive peptides

Over 400 yeast strains from seawater and sediments were obtained, but only five strains named HN2 -3, N13d, N13C, Mb5 and HN3 - 2 among them could form clear zones around their colonies on the double plates with 2.0% casein. Peptides in the hydrolysate produced by the proteases from strains HN2 -3 and N13d had higher angiotensin I-converting-enzyme （ACE）-inhibitory activity. The two marine yeast strains were identified to be Aureobasidium pullulans according to the results of routine yeast identification and molecular methods. After purification of the proteases from the two marine yeast strains, it was found that the optimal pH for them was both 9.0, both of them were serine alkaline protease. However, the optimal temperature for the protease from the strain HN2 -3 was 52℃ while that from strain N13d was 48℃. ACE-inhibitory activity of the peptides in the hydrolysate of shrimp protein produced by the purified protease from the strain HN2 -3 was the highest while antioxidant activity in the hydrolysate of spirulina protein produced by the purified protease from the strain N13d was the highest.     

白斑综合症杆状病毒(WSBV)PCR检测方法的改进及应用

斑节对虾Penaeusmonodon白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒 (WSBV)所致。患有典型白斑综合症的斑节对虾 ,用两种提取病毒模板DNA的方法 ,进行PCR扩增 :一种是用传统的方法 ,即蛋白酶K ,CTAB等消化 ,酚 /氯仿抽提 ,乙醇沉淀得到DNA ;另一种是用改进的煮沸法提取病毒DNA。对比发现后一种方法稳定性及敏感性比前者高 ,重复性好。用后一种方法对病虾的复眼进行检测 ,PCR结果为阳性。应用后一种方法还对病虾的各组织器官及人工感染的虾进行检测 ,发现病虾中除肝胰腺外 ,附肢、肌肉、心脏、鳃、胃、中肠、神经、复眼、表皮结果均为阳性。感染实验中 ,出现阳性结果注射感染比投喂感染早 ,而且肌肉和附肢较敏感。     

中华白海豚SRAP分子标记多态性的初步研究

首次将SRAP(sequence-related amplified polymorphism)方法引入中华白海豚(Sousa chinensis)多态性研究中,利用高分辨率的毛细管凝胶电泳分析了模板DNA、Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶等因素对SRAP-PCR扩增结果的影响.确定了me1-em5为扩增中华白海豚基因组DNA的最佳引物对.并进一步确立了适合中华白海豚的SRAP最佳反应体系:25 mm3体系中,模板DNA浓度为0.8 ng/mm3,Mg2+浓度为1.0 mmol/dm3,dNTP浓度为0.1 mmol/dm3,引物浓度为0.2μmol/dm3,Taq DNA聚合酶浓度为0.04 U/mm3.利用该反应体系对10个白海豚样品进行SRAP分析的结果表明,不同样品间DNA谱带清晰、多态性丰富.证实该体系稳定可靠,可以用于中华白海豚的分子标记研究.     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长性状相关的微卫星标记筛选

采用分群分离分析法,以同一批受精卵孵化的同池养殖大菱鲆生长性状发生分离的群体为材料,进行微卫星DNA遗传分析,以揭示影响大菱鲆生长发育速度方面的遗传信息。30个多态性微卫星位点对生长高值组(F组)和生长低值组(S组)各10个样本建立的DNA混合池进行扩增时,在两池间出现了7个差异片段。通过对两组大菱鲆个体PCR扩增出的差异条带进行统计,分析微卫星位点与大菱鲆生长性状的相关性。结果表明,有1个微卫星位点(SmaC10)在355bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在一定的负相关性;有4个微卫星位点(SmaC02、SmaC06、SmaC09、B11-I12/6/3)分别在258bp、182bp、226bp、175bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在正相关性,其中位点Smac09在226bp的等位基因片段与生长性状的正相关性极显著,相关系数达到0.354。位点SmaC09所扩增出的等位基因片段可作为具有良好生长特性人工选育群体的分子标记,指导大菱鲆的辅助育种。     

流行性造血器官坏死病毒（EHNV）PCR快速检测试剂盒的研制

以流行性造血器官坏死病毒（EHNV）中的主衣壳蛋白基因保守区序列作为扩增靶序列,设计合成了一对特异性引物,应用快速的模板制备方法和优化PCR扩增条件,建立了EHNV病毒PCR快速检测技术,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒.该试剂盒的检测灵敏度相当于31个病毒粒子,模板制备时间约30 min,约4 h即可得到准确的结果;且无非特异性扩增带,适用于由EHNV病毒感染的鱼类苗种和水产品的检疫及水质环境的监测.