许氏平鮋( Sebastes schlegeli) CYP19B 基因cDNA克隆及在生殖周期中的表达分析

从许氏平鲉脑组织中克隆到细胞色素P450芳香化酶(P450aromB)(CYP19B)基因核心功能区cDNA。结果表明,许氏平鲉CYP19B主要功能区片段编码369个氨基酸,包括I-螺旋区、Ozol’s肽区及部分芳香化酶特异性保守区。RT-PCR分析表明,CYP19B在雌鱼和雄鱼各组织中表达情况不同,在雌鱼中表达较丰富,但是两者都在性腺和脑中有表达,且脑中的表达量高于性腺。生殖季节表达结果表明,CYP19B在繁殖前期表达较为丰富,退化期未见有表达。CYP19B在精巢处于Ⅲ期的许氏平鲉脑组织中表达最为丰富,在精巢发育Ⅳ期的脑组织表达量最低。上述研究结果说明,CYP19B在雌性和雄性许氏平鲉繁殖周期中均发挥重要生理作用。     

环境浓度的丁草胺暴露对雌性褐菖鲉卵巢发育的干扰

丁草胺是使用最广泛的酰胺类除草剂之一,目前丁草胺对鱼类的生殖毒性研究集中于淡水种类,近海鱼类鲜有报道。本研究以分布于我国东南海域的近海经济鱼类褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)为受试对象,探讨丁草胺对海洋鱼类卵巢发育的影响及机制。褐菖鲉在以环境相关浓度(2、20、200 ng/L)的丁草胺暴露50 d后,褐菖鮋卵巢生殖细胞发育受到不同程度抑制,卵巢17β-雌二醇(E2)水平下降,Caspase-3活性上升。相对定量PCR分析结果显示,卵巢芳香化酶基因(CYP19s)及雌激素受体基因(ERβ)表达量下降。结果表明：丁草胺对褐菖鮋具有明显的生殖毒性,卵巢CYP19s基因与ERβ基因表达被抑制而导致卵巢雌激素水平的下降引起卵细胞在发育早期的细胞凋亡是主要原因。     

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)卵子发生及妊娠过程中雌激素、芳香化酶及其受体的变化规律

雌二醇是鱼类卵巢分泌的主要的性类固醇激素之一,在脊椎动物卵子发生、性别分化、卵黄形成、生理免疫以及中枢神经系统调节等生理过程中发挥重要的作用。许氏平鲉营胎生繁殖,且经过漫长的卵黄积累期和妊娠期,这一特殊的生殖方式使得它受到了国内外学者的广泛关注。通过分析与雌二醇合成及作用密切相关的cyp19a和Era在许氏平鲉卵巢上的定位、cyp19a和cyp19b mRNA在不同卵巢发育时期及不同组织中的表达以及不同发育期的卵巢中雌二醇含量变化,发现在卵巢发育的过程中,许氏平鲉体内雌二醇含量的峰值出现在IV期和体节期。并且cyp19a和cyp19b在卵巢中均有表达且在不同的卵巢发育期表达量不同。在卵黄积累的过程中, cyp19a和cyp19b在IV期的表达量最高,在妊娠时体节期表达量最高。不仅如此,在V期卵巢的滤泡层、基质和囊胚期的滤泡胎盘上检测到了强烈的Era的信号。这些结果说明雌二醇在胎生鱼类卵子发生及妊娠过程中均起到非常重要作用。这一研究为深入解析许氏平鲉胎生生殖特性积累了资料。     

CLONGING AND THE EXPRESSION ANALYSIS OF CYP19A GENE cDNA DURING THE REPRODUCTIVE CYCLE OF SEBASTES SCHLEGELI

从许氏平鲐脑组织中克隆到细胞色素P450芳香化酶（P450aromB）（CYP19B）基因核心功能区cDNA。结果表明,许氏平铀CYP19B主要功能区片段编码369个氨基酸,包括I-螺旋区、Ozol’s肽区及部分芳香化酶特异性保守区。RT-PCR分析表明,CYP19B在雌鱼和雄鱼各组织中表达情况不同,在雌鱼中表达较丰富,但是两者都在性腺和脑中有表达,且脑中的表达量高于性腺。生殖季节表达结果表明,CYP19B在繁殖前期表达较为丰富,退化期未见有表达。CYP19B在精巢处于Ⅲ期的许氏平鲐脑组织中表达最为丰富,在精巢发育Ⅳ期的脑组织表达量最低。上述研究结果说明,CYP19B在雌性和雄性许氏平鲐繁殖周期中均发挥重要生理作用。     

饥饿对金鱼卵巢型和脑型芳香化酶基因表达的影响研究

采用RT-PCR技术,研究了金鱼性腺型芳香化酶基因(CYP19A)和脑型芳香化酶基因(CYP19B)的表达对饥饿胁迫的响应机制.研究结果表明:正常投喂的雌性金鱼中CYP19A基因mRNA在卵巢、肝脏、肾脏、肌肉、鳃、头肾、脾脏、脑、肠和心脏10个组织均有表达,表达量呈现递减趋势;饥饿胁迫后,CYP19A基因mRNA在脑和卵巢中表达的变化规律基本一致,即饥饿5d时表达量显著降低(P<0.05),随后表达水平维持稳定.正常投喂的雌性金鱼CYP19B基因mRNA在脑、头肾、性腺、脾、肌肉和心脏6个组织中表达呈现递减趋势;CYP19B基因mRNA在脑和卵巢中的表达量,在饥饿5d时表达量显著降低(P<0.05),随后表达水平维持稳定.这些结果说明,雌性金鱼在饥饿条件下,性激素合成关键酶基因在脑和卵巢中的表达量显著降低,可能影响卵巢发育。     

饥饿对金鱼卵巢型和脑型芳香化酶基因表达的影响研究

采用RT-PCR技术,研究了金鱼性腺型芳香化酶基因(CYP19A)和脑型芳香化酶基因(CYP19B)的表达对饥饿胁迫的响应机制.研究结果表明:正常投喂的雌性金鱼中CYP19A基因mRNA在卵巢、肝脏、肾脏、肌肉、鳃、头肾、脾脏、脑、肠和心脏10个组织均有表达,表达量呈现递减趋势;饥饿胁迫后,CYP19A基因mRNA在脑和卵巢中表达的变化规律基本一致,即饥饿5d时表达量显著降低(P＜0.05),随后表达水平维持稳定.正常投喂的雌性金鱼CYP19B基因mRNA在脑、头肾、性腺、脾、肌肉和心脏6个组织中表达呈现递减趋势;CYP19B基因mRNA在脑和卵巢中的表达量,在饥饿5d时表达量显著降低(P＜0.05),随后表达水平维持稳定.这些结果说明,雌性金鱼在饥饿条件下,性激素合成关键酶基因在脑和卵巢中的表达量显著降低,可能影响卵巢发育.     

急性高温胁迫对雄性许氏平鲉血液生理生化及相关基因表达的影响

本文以雄性许氏平鲉(Sebastes schlegelii)为研究对象,对急性高温处理下雄性许氏平鲉的血液生理指标及肝脏相关基因的表达水平进行研究。研究显示,红细胞(RBC)和血红蛋白(HGB)均呈先增加后减少的趋势,白细胞(WBC)在实验中增加显著(P0.05);同时急性高温处理后,血清皮质醇(COR)、血清葡萄糖(GLU)和蛋白水平发生显著变化(P0.05),GLU出现与血细胞相似的变化规律,COR在整个处理过程中均显著增加(P0.05);血清蛋白水平整体显著下降(P0.05);丙氨酸氨基转移酶(GPT)和天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)在处理2、6h后显著升高(P0.05);HSP70mRNA表达水平在2和6h后显著升高(P0.05);甲状腺激素水平在高温处理下显著下降(P0.05);TRα和TRβmRNA表达水平显著下降(P0.05)。研究结果表明,在急性高温处理下雄性许氏平鲉处于胁迫状态,其血液生理生化指标和肝脏相关基因表达受高温影响显著。     

三斑石斑鱼(Epinephelus trimaculatus)两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性

通过设计引物,从三斑石斑鱼的卵巢中克隆鉴定出性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的cDNA序列,EtP450arom a开放阅读框为1557bp,编码519个氨基酸残基;EtP450arom b开放阅读框为1530bp,共编码510个氨基酸残基;性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的氨基酸序列的同源性为63.3%,并且包含了芳香化酶经典的功能保守结构。构建了芳香化酶的系统进化树。采用半定量RT-PCR方法研究了性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)在雌性成鱼各组织中的mRNA的表达情况。组织表达结果显示,性腺芳香化酶EtP450arom a只在性腺中特异性表达,而脑芳香化酶EtP450arom b主要在脑区和垂体中表达,表明三斑石斑鱼两种芳香化酶基因的组织特异性及功能的差异。     

急性温度胁迫对许氏平鲉肝脏代谢机能和血液指标的影响及生理机制

为探究急性温度胁迫下许氏平鲉(Sebastes schlegelii)的生理适应性,在低温5℃、常温16℃和高温27℃胁迫12h后,对其肝脏的组织结构、血液生理生化指标变化和肝脏中相关酶的基因表达进行了研究。研究显示:27℃时,肝脏损伤较明显,肝细胞排列杂乱、较多肝细胞均出现空泡化、细胞间界限杂乱模糊、细胞核溶解;5℃时,肝脏组织损伤不明显。27℃时,平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)显著下降(P0.05),白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞数目(RBC)和红细胞压积(HCT)均显著上升(P0.05),血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的活性显著上升(P0.05);5℃时,WBC和红细胞分布宽度标准差(RDW-SD)显著下降,MCHC显著上升(P0.05)。血清中ALP和乳酸脱氢酶(LDH)的活性显著下降(P0.05)。在低温和高温胁迫下,血糖(GLU)水平显著上升,谷草转氨酶基因(GOT1)、谷丙转氨酶基因(GPT1)和乳酸脱氢酶基因(LDH)表达水平有所变化,但均无显著性差异(P0.05)。研究结果表明,高温时血清中AST和ALT活性升高,是由于高温胁迫导致许氏平鲉肝脏组织受损,AST和ALT进入血液导致的,而非由基因表达水平变化导致。高温对各项血液指标影响显著,而低温对肝脏和各血液生理生化指标无显著影响,这表明许氏平鲉对高温胁迫更加敏感。     

许氏平鲉卵巢发育的周年变化研究

利用石蜡切片技术对卵胎生许氏平鲉(Sebastes schlegeli Hilgendorf)的卵巢发育期、卵母细胞发育时相进行了划分,并对性腺成熟系数、肝重指数和肥满度的年周变化进行了研究。结果表明,许氏平鲉卵巢发育可以分为7个期,卵母细胞分为6个时相;以Ⅲ期卵巢越冬,翌年5月进入分娩期,7~11月上旬卵巢保持在重复发育Ⅱ期。许氏平鲉卵巢平均成熟系数波动在0.33~19.82之间,平均肝重指数波动在0.33~3.10之间,平均肥满度波动在2.51~3.20之间。分娩期之前,肝重指数与性腺成熟系数基本呈正相关,产仔期后肝重指数显著下降。该鱼1年成熟1次,属于一次性生殖类型。     

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)DAZ基因家族的鉴定及表达分析

高度保守的DAZ(Deleted in Azoospermia)家族成员包括Daz,Dazl(Daz-like)及Boule基因,它们是精子生成的重要调控因子并在生殖组织中特异性表达。本研究发现许氏平鲉的Daz基因家族包括Dazl及Boule基因,通过对其基因结构和氨基酸序列分析发现Dazl及Boule基因分别有两个剪接型,均具有一个相同的保守RNA识别域(RRM)和DAZ结构域。通过系统发育分析,发现它们分别与其它硬骨鱼类具有较高的同源性,与哺乳动物亲缘关系较远。根据转录组数据分析,Dazl和Boule在配子发生的表达模式类似,均在卵子不同发育时期高表达而胚胎各时期表达量降低甚至无表达,而在组织中仅表达于精巢和卵巢中且表现出明显的性别二态模式。本研究为探究Dazl和Boule基因在许氏平鲉中的生殖发育调控机制及在许氏平鲉两性配子发生过程中的调控作用奠定基础。     

17β-雌二醇促进鲻鱼性腺发育的作用机制:雌激素受体的定位

应用免疫组织化学技术对雌激素受体α和β亚型在鲻鱼性腺进行定位研究．结果显示．在早期卵巢．α与β受体蛋白均在早期初级卵母细胞的卵被膜、核膜和核仁表达．受体阳性物质沿胞膜分布．核显免疫阴性；在卵黄发生期，ER，α和β则在卵被膜、卵黄膜和核膜表达．在精巢，α与β受体蛋白在生精细管生殖被膜、精原细胞、初级和次级精母细胞、精子细胞、足细胞和间质细胞表达．受体免疫阳性物质沿细胞膜分布、这些结果表明．鲻鱼性腺(卵巢和精巢)存在雌激素α与β受体亚型，该受体在介导17β-雌二醇对性腺的生理效应中起重要作用、     

三种放流方式对许氏平鲉分布模式的影响

由于海洋环境污染及过度捕捞造成渔业资源不断衰退,人工增殖放流已成为修复水生生物资源的重要途径。安全有效的放流方式对增殖放流实践的成功与否起着至关重要的作用。本文采用行为学方法,对体长(4.5±0.5)cm,体重(3.5±0.5)g的许氏平鲉(Sebastes schlegelii)在实验室水槽的行为特性进行观察,分别记录了在无礁(对照组)和有礁条件下,保护装置、滑道和直接放流三种方式对许氏平鲉分布模式的影响。实验发现,在保护装置放流方式下许氏平鲉在放流有效区的数量显著多于滑道和直接放流两种方式。有人工鱼礁时,许氏平鲉幼鱼在放流有效区的分布率明显高于对照组。实验结果表明,保护装置放流方式对许氏平鲉的应激性最小,结合人工鱼礁的生态效应,能够有效地提高增殖放流效果。     

正方体人工礁单位鱼礁的关键参数研究

实验室条件下,研究了正方体人工礁7个不同引入数量比例(0~60%)和人工礁摆放布局(每个数量比例设置10个布局)对许氏平鲉(Sebastes schlegelii)聚集率的影响,确定了单位面积正方体人工礁的适宜投放数量和礁体摆放布局,得出单位鱼礁的适宜布设方案。在此基础上,探讨了大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)和许氏平鲉的种类、密度和鱼体规格对聚集率的影响。研究显示,单体礁引入数量比例50%时,数量比例与许氏平鲉聚集率呈显著正相关线性关系,且摆放布局对许氏平鲉的聚集率有显著影响;单体礁引入数量比例为50%时,许氏平鲉的聚集率达到最大值(76%),显著高于0~40%处理组(P0.05),且当单体礁引入数量比例达到50%和60%时,礁体摆放布局对许氏平鲉聚集率的影响无统计学意义(P0.05)。在适宜布设方案条件下,种类和密度对试验鱼聚集率的影响均达到显著性水平(P0.05);鱼体规格对大泷六线鱼的聚集率无显著影响,对许氏平鲉的聚集率影响显著。结果表明,正方体人工礁单位鱼礁的适宜单体礁引入数量比例为50%,在该数量比例时,单体礁摆放布局对恋礁性鱼类的聚集效果无显著影响。     

固定气泡幕对许氏平鲉阻拦效果的研究

为探究固定气泡幕对许氏平鲉(Sebastes schlegelii)的阻拦效果,设定气泡幕的孔距、孔径如下:当孔径为0.5mm时,设定孔距为1.0、2.0、3.0、5.0、10.0cm,当孔距为2.0cm时,设定孔径为0.2、0.5、0.8、1.0、1.5mm,研究了这9种类型的固定气泡幕对许氏平鲉的阻拦效果,并探究了许氏平鲉对孔距2.0cm、孔径0.5mm气泡幕的适应性。研究表明:上述各规格的气泡幕对许氏平鲉均有显著的阻拦效果(tt0.01)。在孔距实验中,孔距为1.0、2.0、3.0、5.0、10.0cm的气泡幕对许氏平鲉的平均阻拦率分别为71.43%、95.24%、92.98%、53.85%、80.14%,其中孔距2.0cm的气泡幕阻拦率最高。在孔径实验中,孔径为0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mm的气泡幕对许氏平鲉的平均阻拦率分别为96.03%、95.24%、82.05%、100%、98.74%,其中孔径1.0mm的气泡幕阻拦率最高。在4h的适应性实验中,许氏平鲉对孔距2.0cm、孔径0.5mm的气泡幕表现出一定的适应性(FF_(0.05))。本研究结果可为我国海洋牧场中许氏平鲉鱼群控制技术提供参考。     

许氏平鲉三种促性腺激素释放激素基因的启动子克隆及生物信息学分析

促性腺激素释放激素(GnRH)是1种在下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamus-pituitary-gonad,HPG)的活动中发挥关键作用的神经激素。研究采用染色体步移方法,从许氏平鲉的肌肉组织中克隆得到GnRH1、GnRH2和GnRH3共3个基因的启动子序列,长度分别为4,3.5和2.5kb。利用在线生物信息学软件对这3个GnRH基因的启动子进行预测分析,结果表明,3个基因均存在Sp1,Oct-1,C/EBP,CREB,Pit-1,NF-1,Brn,GATA-1,USF和MyoD等转录因子的结合位点,以及糖皮质激素受体(GR),雄激素受体(AR),雌激素受体(ER),黄体酮受体(PR),视黄酸受体(RAR)和视黄醇受体(RXR)等核受体的结合位点,推测其对GnRH的调控起到关键作用。但是甲状腺激素受体(TR)和嗅觉相关的Olf-1的结合位点只在GnRH1和GnRH2基因启动子中发现,而在GnRH3中没有预测出。本研究结果表明许氏平鮋不同类型的GnRH是受不同的机制调控的,从而在生理过程中发挥着不同的作用。     

金钱鱼脑型芳香化酶基因cDNA 的克隆及表达分析

为了探讨Cyp19a1b基因表达与温度及鱼油添加量的相互关系,奠定金钱鱼人工繁育理论基础,作者采用RT-PCR和RACE法,克隆了金钱鱼(Scatophagus argue Linnaeus)脑型芳香化酶基因(Cyp19a1b);采用实时荧光定量PCR法,检测了不同温度(23、26和29℃)和不同水平鱼油(0、2%和6%)处理后二龄雌性金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA表达。结果表明:Cyp19a1b cDNA全长2409bp,5′端非编码区164 bp,3′端(不包括poly(A))712 bp,开放阅读框(ORF)1506 bp,编码501个氨基酸,推测其蛋白质分子量为56.697 kDa。序列分析及分子系统进化树结果表明:金钱鱼Cyp19a1b氨基酸序列与黄锡鲷和舌齿鲈Cyp19a1b同源性较高,分别为86.2%、86.5%,与鲤鱼(Cyprinus carpio)、稀有鲫(Gobiocypris rarus)、斑马鱼(Danio rerio)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、南方大口鲇(Silurus meridionalis)和鲻鱼(Mugil cephalus)Cyp19a1b同源性为64.1%~84.4%,但与上述7种鱼性腺芳香化酶(Cyp19a1a)同源性低于63.5%,同源性分析结果与根据传统形态学和生化特征分类的结果相一致。荧光定量PCR结果显示,随处理时间的延长,26℃和29℃组金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量都逐渐降低,但29℃组显著低于26℃组(P0.05),而23℃组在6周时则显著高于26℃和29℃组(P0.05),约为26℃组2倍的表达量;鱼油处理3个投喂组脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量均逐渐降低,但鱼油对金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量无显著影响(P0.05)。以上结果表明:随着卵巢发育或鱼油含量的提高,可降低雌性金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达,这种降低可能是E2反馈调节所致;水温高于26℃将抑制Cyp19a1b mRNA的表达。     

环境内分泌干扰物生殖毒性的表观遗传学机制研究进展

环境内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs)广泛分布于环境中,能够对哺乳动物的生殖系统产生多方面干扰。近年来对于EDCs生殖毒性的研究多集中于激素水平和mRNA水平,但有研究发现EDCs能够在生殖过程中引起表观遗传学变化。在DNA甲基化方面,EDCs能够降低PDE4 D4基因的甲基化水平、升高干细胞因子基因(Kitlg)和妊娠相关性血浆蛋白-A基因(PAPP-A)的甲基化水平、改变磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinases,PI3K)通路和雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)通路中相关基因的甲基化水平,进而影响原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)的增殖和原始卵泡的生成和发育;EDCs还能够升高细胞色素P450芳香化酶基因(Cyp19a1a)的甲基化水平,干扰性激素的合成。在组蛋白修饰方面,有研究发现EDCs能降低激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)组蛋白的乙酰化水平,影响生殖器官的发育。根据这些研究本文综述了EDCs生殖毒性的表观遗传学机制,期望能为以后的研究提供理论依据。     

许氏平鲉致病菌P5W的分离鉴定及致病力分析

为明确养殖过程中许氏平鲉(Sebastes schlegelii)病害爆发的原因，本研究从烟台养殖区自然发病的许氏平鲉病灶处分离获得1株优势菌株P5W,综合采用形态特征观察、结合线粒体16S rDNA序列比对与系统发育进化鉴定分析，明确菌株P5W为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。进一步开展了人工感染实验、组织病理学观察、胞外产物酶活性及溶血性分析、理化特性及药敏实验等研究，结果显示：人工感染证实菌株P5W为导致此次许氏平鲉患病的病原菌，且半数致死量LD₅₀为5.7×10⁶ CFU/mL;患病许氏平鲉肝、脾、肾和肌肉等组织器官出现了不同程度的病变，主要表现在肝细胞出现明显空泡化，脾脏组织细胞发生离散，肾小管上皮细胞脱落坏死，肌纤维断裂；P5W胞外产物具有蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、尿素酶及明胶酶活性，对绵羊红细胞有溶血活性；P5W的适宜生长条件为15～35℃, pH值5～10, NaCl含量(w/v%)1～8,最适生长条件为温度25℃, pH值7, NaCl含量2～4; P5W对头孢噻肟、头孢曲松、左氟沙星、四环素、复方新诺明...     

绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)CYP19a基因克隆与表达特征分析

利用简并引物扩增及RACE全长克隆技术, 克隆得到绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis)CYP19a基因cDNA全长序列。通过多序列比对, 发现具有芳香化酶特定保守序列, 包括一个I-螺旋区, 一个Ozol肽区, 一个亚铁血红素结合区域以及一个芳香化酶特异性结合区域。通过RT-PCR技术检测了其在绿鳍马面鲀成鱼各组织表达的情况, 发现其CYP19a基因只在卵巢中有表达; 同时也分析了其在不同卵巢发育期的表达情况, 发现CYP19a在卵黄发生后期表达量达到最高值, 卵巢退化吸收期表达量达到最低值。