程序化设计的简并引物克隆半滑舌鳎CYP17基因

采用1种新的简并引物设计方法--CODEHOP法来克隆半滑舌鳎CYP17基因.该法结合NCBI、Blastp、BlockMaker、CODEHOP等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,程序性设计半滑舌鳎CYP17基因的CODEHOP引物,从半滑舌鳎卵巢组织中成功克隆了CYP17基因,该基因片段与其它物种的CYP17家族具有较高的同源性,经鉴定,该基因属于整个脊椎动物的CYP17基因群,尤其是鱼类亚群.实验结果表明,程序性设计的简并引物较传统简并引物特异性更高,假阳性率少,更有利于实验成功.     

半滑舌鳎精子的超微结构

硬骨鱼类精子的超微结构,国内外已有较为广泛的研究,一般均为鞭毛型精子,由头部、中片和尾部三部分组成.但不同种硬骨鱼的精子,其细胞核、中心粒复合体、袖套和鞭毛等的结构和形态都各有特异之处.     

半滑舌鳎雌鱼基因组Fosmid文库构建及分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国的大型经济鱼类,其养殖发展迅速。有关半滑舌鳎的基因组文库构建和分析等方面的研究,目前尚未见报道。用流式细胞仪检测雌性半滑舌鳎基因组大小。从半滑舌鳎雌鱼肌肉提取基因组DNA,选取大小合适的DNA片段,经末端修复并回收后,再以Fosmid作为载体,构建半滑舌鳎雌鱼基因组文库。经检测,雌性半滑舌鳎基因组大小约为606.36 Mb。所构建的Fosmid文库含有49 920个克隆,重组率为96.88%;插入片段长度分布在33~45 kb之间,平均为39.2 kb;覆盖雌性半滑舌鳎基因组3.12倍;从文库中筛选得到单拷贝DNA序列的概率为95.6%。对培养第1天和第6天的克隆进行比较,结果表明文库稳定性高,培养过程中没有发生变化。     

半滑舌鳎三倍体诱导研究

采用冷休克抑制第二极体排出的方法诱导了半滑舌鳎三倍体,并探讨了三倍体诱导的最佳条件.通过流式细胞仪倍性检测和染色体观察验证各组三倍化率.结果显示:在受精后5 min开始,将受精卵放在4℃海水中进行冷休克处理,持续时间为20 min,三倍体诱导率最高为35％.通过对三倍体染色体进行分析,辨认其雌雄染色体型为ZWW/ZZZ,出现频率为1∶1,没有发现ZZW型雌鱼,暗示半滑舌鳎Z染色体和W染色体之间的交叉和互换受到严重抑制.     

半滑舌鳎仔稚鱼消化酶活性的变化

对半滑舌鳎不同发育阶段主要消化酶（酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及与消化吸收相关的碱性磷酸酶的活性变化进行了测定。结果表明，半滑舌鳎在仔鱼发育早期即可检出酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的活力，碱性蛋白酶的2个极低值分别出现在仔鱼开口期和仔稚鱼的转交期，从孵化后23d左右胃腺出现时，酸性蛋白酶的活性开始明显升高。早期仔鱼体内表现出较强的淀粉酶活性，孵化后12d其活性急剧下降，并一直保持较低的比活力状态。脂肪酶的活性在半滑舌鳎早期仔鱼体内一直较低，进入稚鱼期后开始缓慢上升。碱性磷酸酶活性在变态结束后出现大幅度的升高，这标志着肠组织结构和肠道消化功能的完善。     

雄性半滑舌鳎雄激素受体基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了雄激素受体(Androgen receptor,AR)基因cDNA的部分序列(434 bp),经BLAST比对与狼鲈(Dicentrarchus labrax)、花溪(Kryptolebias marmoratus)、三斑海猪鱼(Halichoeres trimaculatus)和三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的雄激素受体同源性分别为84%,82%,82%和81%.组织表达分析表明,AR基因在半滑舌鳎的性腺、肝、胃、脾、肾、头肾、肠、鳃、心、脑和肌肉这11种组织中均有表达,表达量有所差异.肾中表达量最丰富,鳃中最少.根据其他硬骨鱼类表达模式,推测半滑舌鳎可能只含有1种AR.     

半滑舌鳎精子发生的组织学研究

本文应用组织学方法对半滑舌鳎雄鱼精巢结构和精子发生过程进行了详细地研究．观察结果表明,它的精巢结构特点是随着精巢的发育可见它的精巢外面有一条管状贮精囊与输出管相连,在精巢发育成熟过程中,贮精囊中逐渐充满精子,这个特点有助于了解半滑舌鳎的受精生物学的复杂性．另外,从半滑舌鳎精子发生过程分析,它的精巢属于小叶型,精巢发育分为6期．精子发生经历精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子．最后,文中还讨论了半滑舌鳎精巢中非生殖细胞（间质细胞和Sertoli细胞）的分布及其可能的生理作用．     

半滑舌鳎苗种体外挂牌标志技术研究

研制了4种不同规格的T型标志牌(T-A,T-B,TC,T-D),对不同规格的半滑舌鳎苗种进行了标记试验,记录了标记后的脱牌率、成活率、行为特征和生长情况,筛选了适宜于半滑舌鳎苗种标志放流的T型标志牌.结果表明:T-A标志牌适宜于标记全长8 cm以上的苗种,标记后的实验鱼生长与对照组无显著差异,标志后暂养成活率92％～100％;T-B标志牌适宜标记全长16 cm的苗种,标记后实验鱼成活率达到100％,脱牌率为0.T-C和T-D标志牌不适宜于标记全长16 cm以下的半滑舌鳎苗种.2011年,利用本研究开发的T-A标志牌标记半滑舌鳎苗种,并在莱州开展大规模标志放流试验,标记效果良好.     

半滑舌鳎促黄体激素受体基因片段的克隆及组织表达分析

采用巢式RT-PCR法克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis促黄体激素受体(Luteinizing Hormonene Receptor, LHR)基因部分序列,经过BLAST比对,认为该序列与庸鲽、牙鲆、黑鲷、尼罗罗非鱼、青鳉和红鳍东方鲀的LHR基因同源性分别为97%,94%,85%,83%,82%和80%.该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TM helix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族.组织表达分析表明,LHR基因在半滑舌鳎的卵巢、精巢、肝脏、胃、肠、鳃、心、脾、肾、头肾和脑中均有表达,表达量有所不同,以脾和肾中表达量最丰富.     

促激素及其受体在雄性半滑舌鳎脑垂体和精巢中的定位

应用兔抗血清对抗鱼类和哺乳类促激素及其受体的多克隆抗体对雄性半滑舌鳎脑垂体和精巢进行了免疫组织化学定位.其结果显示GnRHR、LHR和GtH免疫活性定位在不同发育时期的腺垂体和精巢中.GtH免疫阳性细胞的数量和免疫强度随着精巢发育成熟而明显增强.同时还发现睾酮（T）和雄激素受体（AR）在半滑舌鳎精巢中的定位有别于其他鱼类,尤其是雄激素受体（AR）免疫活性在精原细胞中的数量很少.依据这个特点文中还讨论了其可能与精巢发育的关系,同时证明了半滑舌鳎精巢发育像其他硬骨鱼类一样受激素的调控.     

基于WGP物理作图法的虾夷扇贝Fosmid克隆混池策略及解码率研究

利用全基因组解析(Whole genome profiling,WGP)法进行物理图谱构建时,克隆混池策略及克隆解码率的高低是影响物理图谱构建效果的关键性因素。如何通过调控混合克隆数目,来平衡克隆解码率和测序的成本,是利用WGP法构建物理图谱的亟需解决的问题。本研究利用虾夷扇贝Fosmid文库的部分克隆,使用序列特异性标签的WGP方法,对虾夷扇贝物理图谱构建方法的混池策略及克隆解码率进行了初步研究。通过计算机分别模拟了384 N(N=1,2…24)孔培养板内的克隆混合,计算出了对应混合尺度下BsaXI和FspEI两种酶的克隆解码率。以该模拟数据作为参照,最终分别以4、8、12、16张384孔培养板内的克隆混合构建了克隆超级池;并利用2b-RAD技术构建了基于BsaXI和FspEI两种限制性内切酶的测序文库。通过对酶切标签数据的分析,成功实现了混合池内的克隆解码,且在利用两种酶对应的酶切标签联合解码后,联合解码率达到84%以上。本研究最终确定了由8张384孔培养板混合的混池策略及利用BsaXI和FspEI两种酶切标签进行联合克隆解码,为后期利用WGP方法构建虾夷扇贝物理图谱提供了参考方案。     

温度、盐度对半滑舌鳎胚胎发育的影响

温度及盐度是鱼类苗种生产当中2个重要的因子。研究了在不同水温、盐度条件下,半滑舌鳎胚胎发育的情况。通过对孵化时间、孵化率、初孵仔鱼畸形率、活力的比较,发现温度对受精卵的孵化影响显著。受精卵在18℃以下及28℃以上均不能孵化出仔鱼,在18~28℃水温条件下,受精卵可以孵化,其适宜的孵化水温为22~23℃,且随着温度升高受精卵孵化时间逐渐缩短。在水温23℃下,受精卵在盐度16以下及48以上均不能孵化出仔鱼,在盐度18~46的范围内,受精卵均可以孵化出仔鱼,盐度38以上均为畸形,且孵化时间不受盐度的影响,其适宜孵化盐度为28~32。     

长牡蛎dpp同源基因的克隆及其在贝壳发生中的功能研究

dpp是转化生长因子β家族的重要成员,在胚胎发育中作为形态发生子参与体轴形成及附肢发育等过程。为了研究牡蛎dpp同源基因在贝壳发生中的作用,揭示贝壳发生的分子机理,作者克隆了一种长牡蛎(Crassostrea gigas)的dpp基因,命名为cgdpp。序列和进化分析显示,cgdpp分子中不同位点的氨基酸残基变异程度不同。作者用整装原位杂交的手段研究了dpp同源基因在长牡蛎早期发育中的表达情况。结果表明,dpp同源基因参与了从贝壳形成区开始分化到早期贝壳形成的全过程。在担轮幼虫(Trochophore)中,dpp同源基因似乎调控了贝壳的形状与扩张速度;在早期D形幼虫中,dpp同源基因表达量突然下降至痕量水平,并与贝壳发育区无明显的关联,提示dpp同源基因可能仅仅参与了贝壳的发生,不参与其进一步的发育过程。