哈维氏弧菌FlaA基因的克隆、序列分析及真核表达质粒的构建

哈维氏弧菌是水产病害中常见的致病菌.参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因序列设计简并引物,PCR扩增哈维氏弧菌TS-628株的FlaA全基因,并克隆到pMD 18-T载体中测序,经序列分析该基因全长1 140 bp,编码379个氨基酸.与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,哈氏弧菌FlaA基因与霍乱弧菌FlaA基因的同源性最高(79.5%),该基因编码的多肽缺乏半胱氨酸,并在N-,C-两端的氨基酸序列较为保守,中间区域的变异较大.对该蛋白的氨基酸组成及空间结构进行了分析和预测,并推测该蛋白质的平均分子量为40.6 kDa.在该基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得带哈氏弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因的真核表达重组质粒pcDNA-FlaA-tag,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究

以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼(Epinephlus awoara)和斜带石斑鱼(Epinephlus co-ioides)分离的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株为研究对象,采用平板玻璃纸覆盖技术,获得该菌株的胞外产物(ECP),并对其成分进行分析。利用杯碟法研究表明,哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性,且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,ECP蛋白条带主要集中在分子质量范围25.0~66.2 ku之间,经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白条带几乎一致。采用复性电泳方法(G-PAGE)分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性,结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下,蛋白酶活性较强,在碱性条件下,蛋白酶带明显减少,活性很弱。在相同的pH条件下,5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强,种类多,分子质量范围宽;而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少,活性也稍弱。     

6种海洋致病性弧菌36kDa外膜蛋白特性分析

研究本着筛选和制备弧菌共同外膜蛋白亚单位疫苗,用十二烷基肌氨酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和创伤弧菌(V.vulnificus)6种海洋致病性弧菌的主要外膜蛋白, SDS-PAGE图谱比较发现这6种弧菌都存在36 kDa的外膜蛋白条带.通过电泳洗脱分离纯化这6种弧菌的36 kDa外膜蛋白,并制备了鳗弧菌菌株SJ060621的36 kDa外膜蛋白多抗.ELISA和Western-blot印迹结果显示,仅鳗弧菌SJ060621、S010610-1和哈维氏弧菌的36 kDa外膜蛋白存在免疫交叉反应;双向电泳分析了鳗弧菌SJ060621、S010610-1、哈维氏弧菌和溶藻弧菌的36 kDa外膜蛋白,2-DE图谱显示出鳗弧菌SJ060621和S010610-1均由3种等电点相近的蛋白组成,存在很高的同源性,2株鳗弧菌与溶藻弧菌和哈维氏弧菌在蛋白质组成数量和等电点上都存在较大的差异,结果说明通过主要外膜蛋白的分子量和免疫特性研究,可为筛选不同弧菌共同外膜蛋白的亚单位疫苗提供有利参考.     

哈维氏弧菌密度感应系统对几种胞外酶的活性影响

密度感应系统是细菌通过感受群体密度变化而控制基因特定表达的1种机制。对病原菌密度感应系统的研究有助于找到新的抗感染策略。目前哈维氏弧菌分泌的蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等致病相关因子是否受密度感应系统的控制尚不清楚。哈维氏弧菌有3个平行的密度感应系统。本研究通过检测3个密度感应系统基因突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)活性,发现明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。结果表明,哈维氏弧菌胞外分泌的几种毒力相关因子都受密度感应系统的调控,但控制方式各不相同。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)ISG15基因单核苷酸多态性及与抗病性状的相关性研究

由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)等细菌感染引起的弧菌病对我国大黄鱼(Larimichthys crocea)的养殖造成了严重危害。通过哈维氏弧菌人工感染大黄鱼建立易感组和抗病组,采用PCR扩增和直接测序法对大黄鱼干扰素刺激基因ISG15双拷贝(ISG15-1和ISG15-2)进行单核苷酸多态性(SNPs)检测和分型,并与其哈维氏弧菌抗性进行关联分析。结果表明,从大黄鱼ISG15-1和ISG15-2基因中分别筛选到10个和4个SNP位点并进行了成功分型。经统计分析,ISG15-1基因的186G/C和318C/T位点以及ISG15-2基因的297G/T位点的基因型频率和等位基因频率在易感群体和抗病群体中均存在极显著差异,表明这3个SNP位点与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关。连锁不平衡分析结果显示,ISG15-1的SNPs可形成1个单倍块和11种单倍型,而ISG15-2的SNPs可形成1个单倍块和5种单倍型。其中,ISG15-1基因的单倍型H2(CCCCGGTACC)、H6(TCCCACTGTC)和H9(TCCCAGTGCC)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关;ISG15-2基因的单倍型H1(CCCG)和H4(TCCG)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性极显著相关。这些ISG15-1和ISG15-2基因的SNP位点以及单倍型可以作为抗哈维氏弧菌病大黄鱼选育的候选分子标记。     

哈维氏弧菌溶血素基因vhhA在大肠杆菌中的表达及活性研究

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是水产养殖动物（鱼、虾）的重要致病菌。已发现哈维氏弧菌对鱼类的致病性与其分泌的胞外产物中的溶血素相关，致病力最强的菌株VIB645有2个碱基序列非常相似的溶血素基因，vhhA和vhhB。本研究将vhhA克隆于pET-24d（＋）表达质粒，VHH溶血素蛋白作为1种带6组氨酸的融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到了过量表达。重组菌在鱼血平板上表现出很强的溶血活性，并且在卵磷脂平板上表现出磷脂酶活性。SDS-PAGE分析表明，表达蛋白的分子量约为43kDa。在17，25和37℃时重组的VHH溶血素蛋白都能得到很好的表达，达到最大表达量的时间分别为9,6和3h。在25℃进行诱导时，分泌到上清液中的表达蛋白的量最多。     

半滑舌鳎体表溃疡病病原的分离鉴定

为研究引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)体表溃疡病的病原,从发生体表溃疡的半滑舌鳎体表病灶、肝脏和肾脏上进行细菌分离,得到2株优势菌株051001和051002,采用腹腔注射进行回感实验,证实菌株051001和051002能够引起养殖半滑舌鳎发病死亡,该菌株为本次半滑舌鳎体表溃疡病的致病菌。经形态学观察和生理生化特性分析,初步判定菌株051001为鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)、菌株051002为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi);基于16SrRNA基因构建的系统发育树显示,菌株051002与哈维氏弧菌聚为一支,菌株051001与鱼肠道弧菌聚为一个分支;基于hsp60的基因序列分析表明051002与哈维氏弧菌(AY332570、AF230931)聚为一个分支,置信度为92%。对16种药物的敏感实验证实,菌株051001对利福平、庆大霉素、氟苯尼考等敏感,菌株051002对诺氟沙星、头孢曲松钠、庆大霉素敏感。     

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

大菱鲆CD55负调控补体激活及其广谱细菌结合能力

CD55蛋白在哺乳动物中是一种补体调控因子,但其在鱼类中的功能未知。本研究探索了大菱鲆(Scophthalmus maximus) CD55(SmCD55)蛋白的功能。结果表明,SmCD55蛋白由344个氨基酸残基构成,含有一个N端信号肽和3个补体调控蛋白(CCP)功能域。SmCD55基因在大菱鲆多种组织中均有表达,其中,在肌肉中表达量最低,在脑组织的表达量最高。通过原核表达获得了重组的SmCD55(rSmCD55)蛋白,发现rSmCD55蛋白能够抑制大菱鲆血清的溶血活性和杀菌活性,表明其负调控补体系统的激活。此外,本研究还发现rSmCD55蛋白可以结合包括重要水产病原菌迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、鳗弧菌(Vibrio anguilla­rum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和海豚链球菌(Strep­tococcus iniae)在内的多种细菌,其中与哈维氏弧菌的结合能力最强。以上这些研究结果丰富了鱼类补体系统的理论知识,加深了对鱼类补体激活调控的了解。     

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。     

苗期中国对虾幼体异养细菌区系及其变化与病害发生的关系

研究了2个育苗场不同发育期的中国对虾(Penaeus chinensis)幼体的异养菌和弧菌种群变化的动态过程。以典型特征法、BIOLOGGN法和数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明，对虾幼体样品中所分离的细菌，大多是革兰氏阴性杆菌。鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻弧菌(Vibrioal-ginozyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。在对虾幼体发育早期，假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势，随着对虾幼体的发育，弧菌(Vibrio)渐成为优势，其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。二者的消长与苗期病害的发生相关，溶藻弧菌总是在虾幼体健康时出现或成为优势，而哈维氏弧菌成为优势时，苗期病害容易发生。     

哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术

哈维氏弧菌是1种革兰氏阴性、发光的海洋细菌,广泛分布于海洋环境中。它是最近10多年才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。文中综述哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学、致病机制、密度感应系统、检测技术、疾病的防治及其应用。     

Antimicrobial peptide hepcidin contributes to host defense of Centropristis striata against Vibrio harveyi challenge

Hepcidins are small cysteine-rich antimicrobial peptides that play a vital role in immunity against pathogen invasion.Here,a hepcidin(Cshep) from Centropristis striata was described,which is considered as a valuable aquaculture marine species in China.The open reading frame consisted of 273 bp.Eight conserved cysteine residues were identified.Phylogenetic analysis showed that Cshep had a relatively close relationship with the hepcidin from Epinephelus moara.Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that Cshep was highly expressed in liver and significantly up-regulated when challenged with Vibrio harveyi.In addition,the synthetic Cshep peptide had a high antimicrobial activity against V.harveyi,but low against other pathogenic bacteria tested in this study.The killing kinetics analysis revealed that Cshep had a fast bactericidal effect on V.harveyi.These results suggested that Cshep may be involved in the immune response of C.striata against V.harveyi infection.     

哈维氏弧菌生物被膜体外模型的建立及成膜特性研究

采用改良微孔板法建立哈维氏弧菌Vibrio harveyi TS-628菌株生物被膜体外模型,并进一步研究环境因子对哈维氏弧菌体外形成生物被膜的影响。结果发现,哈维氏弧菌TS-628菌株可以在聚苯乙烯板中形成生物被膜,并且该菌生物被膜的形成受起始菌液浓度、温度、pH等理化因子的显著影响。温度为30℃、NaCl质量分数为3%—6%、pH为7、孵育时间为36h是哈维氏弧菌形成生物被膜的最佳条件。此外哈维氏弧菌在分别经表皮黏液、鳃黏液、肠道黏液、肝脏提取液、脾脏提取液、肌肉提取液包被的基质上成膜效果显著,其中在经肝脏提取液包被的基质上形成的生物被膜量显著高于在其他生物基质上形成的生物被膜量(p<0.01)。     

三种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic-us)是引起大黄鱼(Pseudosciaena crocea)溃疡病的3种主要致病菌.将试验大黄鱼随机分成4组,分别腹腔注射哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和灭菌生理盐水,在感染后的不同时间采样,通过白细胞数量、白细胞分类计数、NBT阳性细胞数量以及溶菌酶活力的变化趋势来探讨3种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响.结果表明,大黄鱼各项血液指标的变化主要发生在感染后的1～7 d.在人工感染的初期,各实验组大黄鱼外周血的白细胞数量、NBT阳性细胞数量呈现先增加后降低的趋势,淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比显著降低(p<0.05),单核细胞百分比显著提高(p<0.05);随着时间的延长,白细胞数量开始下降;淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比有所上升,7 d以后各类血细胞数量变化不显著.其中哈氏弧菌感染组在白细胞数量、NBT阳性细胞数量等多个指标上的变化最为明显.血清中溶菌酶活性显著高于脾组织,鱼体受感染后两者溶菌酶活性均较对照组有显著提高,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.研究认为反映鱼体受感染后从应激反应发生至非特异性免疫功能的发挥主要发生在病原菌感染前期,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.     

副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质

用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质.核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100％.其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67％～92％.将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27 kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带.研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础.