海洋来源羽毛降解菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

微生物降解羽毛既可保护环境又能实现废物的资源化利用,具有显著的经济效益和社会效益。本研究从广西钦州港海鸭养殖淤泥筛选获得一株可高效降解羽毛的菌株Gxun-20,通过对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列进行分析,以确定菌株的分类,并对菌株产角蛋白酶的条件及酶学性质进行研究。结果表明：该菌为副短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis);菌株最适产酶条件为：温度34℃,初始pH 6.5,羽毛含量1.5%(质量分数),发酵48 h,角蛋白酶活性可达277.45 U/mL。菌株Gxun-20所分泌的角蛋白酶最适温度为50℃,且热稳定性较好,最适pH为7.5;金属离子Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe²⁺和Mn²⁺对酶活性有显著抑制作用,而Ca²⁺、Na⁺对酶活性有明显促进作用;金属螯合剂乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)可显著抑制酶的活性,蛋白...     

海洋源拮抗细菌的分离、筛选及1株拮抗芽孢杆菌的鉴定

对来自于不同海域的红树树皮、海苔(海洋生物样)和海泥(海洋底质)样品进行细菌分离,并采用管碟法测试了分离出的海洋细菌对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、白色念珠菌Candida albicans、黑曲霉As...     

海洋酵母菌胞外酶及其基因的最新研究进展

综述海洋酵母菌所产多种胞外酶的生产、纯酶性质及基因克隆工作的最新研究进展.从实验室建立的500多株海洋酵母菌种资源库中筛选出了数十株可以产生多种不同活性胞外酶的海洋酵母菌,它们分别属于耶鲁维亚酵母菌(Yarrowia)、类酵母(Aureobasidium)、毕赤氏酵母菌(Pichia)、梅奇酵母菌(Metschnikowia)和隐球酵母菌(Cryptococcus)等不同种属.所产生的胞外酶主要包括纤维素酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶(包括生淀粉酶)、菊糖酶、脂酶、植酸酶和嗜杀因子等.深入进行了各种胞外酶的生产,纯化及纯酶的性质研究,并对部分菌株的胞外酶基因进行了克隆、测序和表达,这些研究有助于对海洋酵母胞外酶的理论研究和生产应用价值的了解和对于海洋酵母菌资源、生理和遗传的进一步深入研究.     

Identification of a marine agarolytic bacterium Agarivorans albus QM38 and cloning and sequencing its beta-agarase genes

A total of 117 agar-decomposing cultures were isolated from coastal seawater around Qingdao,China.The phenotypic and agarolytic features of an agarolytic isolate,QM38,were investigated.The strain was gram negative,strictly aerobic,curved rod and polar flagellum.On the basis of several phenotypic characters,biochemical and morphological characters and phylogenetic analysis of the gene coding for the 16S rRNA,the strain was identified as Agarivorans albus strain QM38.This strain can liquefy the agar on the solid agar plate.An excellular agarase activity was determined in liquid culture.The enzyme exhibited maximal activity at 40℃,pH 7.6.Its activity was greatly affected by different concentrations of agarose.The highest activity 32 U/ml was achieved in the culture supernatant.The hydrolytic product was analyzed by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE).After complete hydrolysis of agarose,a series of agaro-oligosaccharides were produced.The main products of the enzymes were oligosaccharides in the degree of polymerization (DP) of 2,4,6 and 8.Three genes agaD01,agaD02 and agaD03,encoding β-agarases,had been cloned from genomic DNA of Agarivorans albus strain QM38.The open reading frame of agaD01,consisted of 2 988 bp,and shared 95.5%-98.9% identity to the β-agarase genes of some strains of Vibrio and Agarivorans.Gene agaD02 comprised 2 868 bp and encoded a 955-amino-acid protein.It showed 97.4% and 98.7% identity to the β-agarase genes of strain Vibrio sp.PO-303 and strain Vibrio sp.JT0107,respectively.Only partial sequence of agaD03 gene has been cloned.It showed 96.5% identity to β-agarase gene (agaB) of Pseudoalteromonas sp.CY24,and shared 96.8% identity to β-agarase-c gene of Vibrio sp.PO-303.     

红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析

从广西北部湾红树林海洋淤泥中分离筛选到270株海洋细菌,用喉癌细胞Hep-2的细胞毒作用为筛选模型,用SRB法检测这270株海洋细菌的抑制肿瘤细胞生长活性,其中13株呈阳性反应。依据形态和生理生化反应特征及16SrRNA基因序列分析,确定其中一株为短小芽孢杆菌Bacillus pumilusPLM4。取该菌株液体培养上清液,检测对人喉癌细胞Hep-2的生长抑制率为63.9%,经过凝胶过滤层析分析获得2个活性峰,其中活性高的峰估计平均分子量为116kd。采用经典显色反应法初步判断该活性物质为多糖。     

南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的筛选与基因克隆

在10℃恒温培养条件下,从第29次南极科学考察获得的南极深海沉积物样品中分离筛选到产脂肪酶细菌3株,产脂肪酶真菌1株,对其进行分子生物学鉴定,确定为假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas arctica）、芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）、Glaciecola sp.以及白冬孢酵母属（Leucosporidium sp.）.通过测定各酶的最适反应温度,获得产低温脂肪酶芽孢杆菌XZ18,该菌所产脂肪酶最适反应温度为30℃,在0℃仍有部分活性.从NaCl浓度和pH值2个条件对产酶条件进行研究,最终确定了该菌最适产酶NaCl浓度5.0%、最适产酶pH值为6,最高产酶量为4.65 U/cm3.通过PCR扩增,获得了脂肪酶全长序列,对该序列进行系统发育分析,发现该脂肪酶基因处于较独立的分支.     

养殖浅色黄姑鱼体表溃烂症病原菌的分离与鉴定

浅色黄姑鱼的高密度养殖一直受到病害的困扰,导致成鱼养殖成活率低,直接影响了浅色黄姑鱼养殖业的发展.以汕头南澳岛患皮肤溃烂症的养殖浅色黄姑鱼为材料,从其溃烂头部组织中分离得到优势菌KLg,人工感染实验证实菌株KLg为浅色黄姑鱼的致病菌.药敏试验表明菌株KLg对头孢哌酮、红霉素、头孢曲松、先锋霉素V、复达欣、头孢呋辛和氧哌嗪青霉素等7种抗生素敏感,革兰氏染色、生理生化测定等手段初步确定菌株KLg为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),这一结果通过16S rDNA基因序列及进化树分析得到进一步确认.哈维氏弧菌是海水养殖鱼类的常见致病菌,但在浅色黄姑鱼养殖中尚属首次报道.实验结果可为我国沿海地区浅色黄姑鱼养殖中弧菌病害的防治提供重要参考.     

Molecular cloning and expression analysis of Crustin-like gene from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

A new member of antimicrobial protein genes of the Crustin family was cloned from haemocytes of the Chinese shrimp Fennero- penaeus chinensis by 3 ′and 5′ RACE. The full-length cDNA of Crustin-like gene contains a 390 bp open reading frame, encoding 130 amino acids. The deduced peptide contains a putative signal peptide of 17 amino acids and mature peptide of 113 amino acids. The molecular mass of the deduced mature peptide is 12. 3 ku. It is highly cationic with a theoretical isoelectric point of 8.5. The deduced amino acids sequence of this Crustin showed high homology with those of Penaeus （ Litopenaeus ） setferus. Northern blotting showed that the cloned Crustin gene was mainly expressed in haemocytes, gill, intestine, and RNA in situ hybridization indicated that the Crustin gene was constitutively expressed exclusively in haemocytes of these tissues. Capillary elec- trophoresis RT-PCR analysis showed that Crustin was up-regulated dramatically from 12 to 48 h after a brief decrease of mRNA during first 6 h in response to microbe infection. The level of Crustin mRNA began to restore at 72 h post-challenge. This indicated that Crustin gene might play an important role when shrimps are infected by bacterial pathogen.     

海洋放线菌ACMA006抗肿瘤活性成分的分离纯化及结构鉴定

对从中国江苏连云港海域中筛选出的海洋放线菌ACMA006的发酵产物进行了分离纯化,获得2种抗肿瘤活性化合物,并进一步鉴定其结构．海洋放线菌ACMA006经大规模发酵后,发酵液采用溶剂萃取法提取其中的抗肿瘤活性成分,并利用硅胶柱层析、制备薄层及HPLC等方法对萃取物进行分离得到单体化合物．利用红外光谱、质谱、核磁共振‘H—HMR谱和”C—NMR谱等波谱数据对单体化合物的结构进行解析和鉴定．结果表明化合物B为放线菌素D,其分子式为c62：H86N12016含有2个多肽酯环,由L一苏氨酸、D一缬氨酸、L．脯氨酸、N一甲基甘氨酸和L—N一甲基缬氨酸组成,通过羧基与发色母核吩唾嗪酮相连接．化合物A可能为放线菌素D的衍生物．这是国内外首次从海洋放线菌中分离提取出放线菌素D．     

一株产琼胶酶海洋细菌的分离与鉴定

为获得琼胶酶活性高产菌株,对采集的海水样品进行了产酶微生物的分离、筛选和鉴定。经过平板培养预筛和两次摇瓶培养筛选,从浙江省舟山市普陀区近海海水样品中分离到一株琼胶酶产生菌G-5,该菌株液体培养产酶活力可达到413.8 U/mL。G-5菌株的菌落呈乳白色、半透明、表面湿润;菌体革兰氏染色阴性,大小0.58~0.69μm×1.50~2.26μm;光学显微镜下呈短杆状,略有弧形。G-5菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库中15个弧菌属(Vibrio)菌株的16S rDNA有98%的同源性,可以确定G-5菌株是一株弧菌(Vibrio sp.)。     

一株抑制浒苔生长海洋细菌的分离与鉴定

从青岛近海海泥中分离了57 株细菌, 通过毒性实验, 得到了一株对浒苔具有较强毒性的细菌EP23。对该菌株进行了菌落、菌体形态学观察、生理生化特征分析及16S rDNA 序列分析, 鉴定该菌为弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）。该菌培养液高速离心的上清液对浒苔具有较强毒性, 表明弯曲芽孢杆菌EP23 是通过...     

一株多环芳烃芘降解菌的鉴定及其降解特性研究

从红树植物红海榄叶片中分离一株对芘具有较好降解作用的海洋细菌,命名为B11,并对其菌体特征、生长条件及降解效能等进行了系统研究。结果发现该菌株为革兰氏阴性菌,结合其生理生化特征和16S rDNA序列比对,表明此菌株属于交替单胞菌属(Alteromonas sp.)。菌株在芘的起始浓度为100 mg/L,pH为中性或偏碱性条件下,盐度35时对芘的降解作用最强。外加碳源对B11对芘的降解效果都具有一定的抑制作用,其中水杨酸的抑制作用更为显著。综合菌株B11的生长特性和降解效能,初步认为B11菌株较适合用于降解多环芳烃芘,可用于红树植物多环芳烃生态污染的原位修复。     

刺参养殖池塘中一株益生芽孢杆菌的分离及鉴定

针对目前刺参池塘养殖中微生态制剂施用混乱、标准不一以及效果不稳定性等现状,本研究从刺参养殖池塘底泥中分离土著芽孢杆菌菌株,并通过菌落形态特征、16s rDNA测序分析和生理生化试验对该菌株进行了鉴定,确定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),命名为XA-01,该茵可为微生态制剂的制备提...     

一株群体感应抑制活性海洋放线菌的筛选与鉴定 *

群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitors, QSIs)可以通过干扰群体感应(Quorum Sensing, QS)而有效降低病菌的感染性和毒力, 并且不会胁迫致病菌使其产生耐药性, 是具有前景的抗生素替代品。海洋微生物是新型QSIs的潜在来源。本研究利用紫色杆菌(Chromobacterium violaceum 026, CV026)模型评价QS抑制活性, 在来源于南海中西部和印度洋深海沉积物样品的放线菌中筛选QS抑制活性菌株, 并且根据形态学特征和16S rRNA基因序列鉴定活性菌株。通过筛选获得了菌株SCSIO 53717, 其提取物在CV026模型中能够显著降低指示菌株的紫色菌素产量, 并且在0~1000mg·mL^-1的有效浓度范围内不影响紫色杆菌的生长。菌株SCSIO 53717被鉴定为Kocuria属, 是首次报道的具有QS抑制活性的Kocuria属菌株, 因而具有进一步深入研究的价值。     

日本鳗鲡UNAG蛋白的克隆及其在非结合胆红素检测中的应用

血清中非结合胆红素含量升高与新生儿脑损伤的发展相关,但目前临床上没有方法可以直接测定非结合胆红素的血清水平.从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中成功克隆了其UNAG基因,在原核细胞中成功表达UNAG重组蛋白,并通过Ni~(2+)-NTA进行纯化得到含量为1.8 mg/cm~3的UNAG目的蛋白,银染检测说明其纯度较高.利用该基因可以与非结合胆红素结合并发光的特异性,设计了一种新型的非结合胆红素检测方法,结果表明UNAG发光值与胆红素浓度呈良好的线性关系,回归方程为Y=17.96 X+4.333 3(R=0.994 9).该法可用于胆红素浓度的测定.     

热带太平洋活性微生物菌株的筛选和鉴定

从热带太平洋的生物、海水、沉积物样品中分离到细菌、酵母和霉菌共475株．选择8个指示菌并采用圆形纸片法对分离菌株的发酵液进行抗菌和抗肿瘤活性筛选，获得20个具有抗菌和／或抗肿瘤活性的微生物菌株．细菌、酵母和霉菌活性菌株的筛选得率都比较低，分别为5．4％、2．2％和3．4％，其原因可能与纸片的发酵液的添加量较少和菌株发酵条件的控制有关．同时采用分子生物学方法鉴定了活性菌株，除4株未有结果外，其余菌株分归为9个属，其中芽孢杆菌属7株、占活性菌株的35％，盐单胞菌属2株、占10％，其它菌属各1株、占5％．抑菌谱分析表明，大多数活性菌株对革兰氏阳性细菌具有抑制作用，而来源于鱼体的菌株抑菌谱较广，对细菌、真菌均有拮抗作用，另外还发现一株酵母（Rhodosporidium toruloides）可抑制金黄色葡萄球菌．作者提出“活性指示（activity index）”参数，对活性菌株的抗菌谱和活性强度进行综合评估，也表明源于鱼体的菌株的活性指示值较高．这4株芽孢杆菌尤其是DY-Y-11A1A菌株，具有潜在的后续开发价值．     

南、北极海洋不同种类细菌分离株中DMSP-依赖型脱甲基酶基因dmdA的系统发育多样性

Dimethylsulfoniopropionate(DMSP) is mainly produced by marine phytoplankton as an osmolyte, antioxidant,predator deterrent, or cryoprotectant. DMSP is also an important carbon and sulfur source for marine bacteria.Bacteria may metabolize DMSP via the demethylation pathway involving the DMSP demethylase gene(dmdA) or the cleavage pathway involving several different DMSP lyase genes. Most DMSP released into seawater is degraded by bacteria via demethylation. To test a hypothesis that the high gene frequency of dmdA among major marine taxa results in part from horizontal gene transfer(HGT) events, a total of thirty-one bacterial strains were isolated from Arctic Kongsfjorden seawater in this study. Analysis of 16S rRNA gene sequences showed that,except for strains BSw22118, BSw22131 and BSw22132 belonging to the genera Colwellia, Pseudomonas and Glaciecola, respectively, all bacteria fell into the genus Pseudoalteromonas. DmdA genes were detected in five distantly related bacterial strains, including four Arctic strains(Pseudoalteromonas sp. BSw22112, Colwellia sp.BSw22118, Pseudomonas sp. BSw22131 and Glaciecola sp. BSw22132) and one Antarctic strain(Roseicitreum antarcticum ZS2–28). Their dmdA genes showed significant similarities(97.7%–98.3%) to that of Ruegeria pomeroyi DSS–3, which was originally isolated from temperate coastal seawater. In addition, the sequence of the gene transfer agent(GTA) capsid protein gene(g5) detected in Antarctic strain ZS2–28 exhibited a genetically closely related to that of Ruegeria pomeroyi DSS–3. Among the five tested strains, only Pseudomonas sp. BSw22131 could grow using DMSP as the sole carbon source. The results of this study support the hypothesis of HGT for dmdA among taxonomically heterogeneous bacterioplankton, and suggest a wide distribution of functional gene(i.e., dmdA) in global marine environments.     

企鹅珍珠贝Dmrt2基因的克隆及表达分析

本研究利用RACE-PCR技术获得企鹅珍珠贝(Pteria penguin)一个Dmrt2基因cDNA的全长序列,通过荧光定量PCR分析Dmrt2基因在各组织中的表达特征,以及在早期卵巢、成熟期卵巢、早期精巢、成熟期精巢和排放期精巢中的表达变化。结果表明,Dmrt2基因全长1 257bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为951 bp,编码316个氨基酸,5′非编码区(untranslated region,UTR)为52 bp,3′UTR为254 bp,第20位到第73位氨基酸为DM结构域。预测其分子质量为36.61ku,等电点为9.80。氨基酸序列比对显示该企鹅珍珠贝Dmrt2基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada martensii)的Dmrt2基因同源性(identity)最高,分别为46.0%和45.7%。其中在DM结构域高度同源。荧光定量PCR分析组织表达特征显示,Dmrt2在企鹅珍珠贝的外套膜、鳃、消化盲囊、足、精巢和卵巢均有表达,其中在精巢中表达量最高(P0.05),足为其次,在闭壳肌中没有检测到Dmrt2表达。对性腺发育不同时期的表达量分析发现,Dmrt2在发育早期和成熟期卵巢中表达量都很低,在发育早期精巢中表达量较高,在成熟期精巢检测到最大表达量(P0.05),到精巢排放期表达显著下降,推测Dmrt2可能与企鹅珍珠贝精巢的发育有关,可能参与了企鹅珍珠贝雄性性别分化和性腺发育这一生理过程。     

印度洋深海沉积物样品纯培养细菌的分离鉴定

为探索印度洋深海沉积物中纯培养细菌的多样性,本文对采自印度洋12个沉积物样品进行细菌纯培养分离,共获得343株细菌。所有细菌采用16S rRNA 基因进行比对分析,鉴定为4个门：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）,5个纲,13个目,26个科,39个属下的121个种。分离出的优势类群为链霉菌属（Streptomyces,分离率为16.53%）和芽孢杆菌属（Bacillus,分离率为8.26%）,其中可能有12个潜在的新分类单元。研究结果表明,印度洋深海沉积环境中纯培养细菌资源丰富,潜在新物种较多;其次,分离培养方法与从海洋沉积物中获得的细菌物种多样性直接相关。