对虾病毒病暴发前期病毒和弧菌相互作用关系

模拟天然继发感染研究对虾病毒病暴发前期病毒和弧菌的关系。结果显示 ,弧菌先感染再病毒感染组比病毒先感染再弧菌感染组死亡率高、死亡快、生长慢、免疫功能低下。表明弧菌的潜伏感染对病毒的增殖有利 ,而病毒的潜伏感染对弧菌的继发感染没有明显的促进作用。说明病毒性流行病的暴发前期可能是由弧菌先感染 ,使对虾体内环境发生变化而助长病毒感染 ,其中对虾的免疫力下降是关键     

溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾白斑综合征病毒的抑制作用

从患病凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内提取白斑综合征病毒(WSSV),PCR证实WSSV毒性,将病毒粗提液稀释10-2、10-3、10-4和10-5倍,攻毒实验表明,最佳攻毒剂量为10-4倍稀释液。对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)分别注射0.05、0.10、0.15 mg/m L的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)肽聚糖,免疫24 h后感染WSSV,测定其免疫保护率和肝胰腺的免疫学指标,探讨溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾抗WSSV的影响。结果表明:对虾的保护率随着肽聚糖的浓度增大而增大,与对照组相比,0.05、0.10、0.15 mg/m L组的保护率分别为36.67%、46.67%、56.67%;实验组凡纳滨对虾肝胰腺中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合成酶(NOS)活力与对照组相比的差异有统计学意义(P0.01)。溶藻弧菌肽聚糖可有效增强凡纳滨对虾自身的非特殊性免疫能力,提高抗WSSV的能力。     

凡纳滨对虾和斑节对虾对WSSV敏感性的比较

用6.0×104拷贝、1.2×104拷贝和6.0×103拷贝3种剂量白斑综合症病毒(WSSV)对凡纳滨对虾和斑节对虾进行人工注射感染,比较了两种对虾对WSSV敏感性的差异。结果表明,凡纳滨对虾死亡时间随病毒剂量降低而延长,斑节对虾死亡时间没有明显差异;随病毒剂量的降低,凡纳滨对虾人工注射感染后病毒复制高峰时间显著延长,斑节对虾感染后病毒复制高峰时间相同,WSSV在凡纳滨对虾体内比在斑节对虾体内复制慢。对虾携带WSSV数量最低为3.3×107拷贝.g-1,最高为4.3×108拷贝.g-1。凡纳滨对虾比斑节对虾对WSSV的抵抗性更强。     

“克毒丹”和“虾丹特”提高斑节对虾成苗率的初步探讨

１９９３年,全球虾病大流行,使虾产量下降１２％,而我国虾病则从南到北发生了空前的大暴发,致使年产量大幅度地下降了一半以上［１］,因而养虾业遭受惨重损失。据分析,这次虾病流行的原因主要有：工农业和生活污水污染沿海,使养虾业直接受害;虾池老化,自净能力较差;对虾育苗滥用抗菌素,致病菌因而获得抗药性;更为严重的是,有多种病毒性病原侵害对虾苗种和成虾,致使对虾的抗病机能减弱,当减弱到一定的程度时,加上环境、水质、营养和细菌等不良因素,使虾病暴发,在短时间内遭受毁灭性的打击。目前,已发现的对虾病毒共１０余…     

溶藻弧菌肽聚糖和vp28-siRNA对凡纳滨对虾白斑综合征病毒的抑制作用

对感染白斑综合征病毒(WSSV)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)分别注射0.05和0.10μg/μL的vp28-si RNA,干扰效果实验表明,si RNA最佳浓度为0.10μg/μL。凡纳滨对虾感染WSSV 24 h时注射0.10μg/μL的vp28-si RNA,检测免疫后不同时间点的干扰效果。结果表明:在注射vp28-si RNA 6 h后,实验组与对照组WSSV病毒拷贝数差异有统计学意义(P0.05);在48 h时实验组病毒拷贝数急剧下降,对照组则保持较高水平,可较好干扰WSSV病毒复制,干扰效果持续120 h,对凡纳滨对虾的保护率为40%。凡纳滨对虾用0.10 mg/m L肽聚糖(Peptidoglycan)免疫24 h后感染WSSV,检测6、12、24 h注射vp28-si RNA的保护率。结果显示:6 h注射组的保护率为80%,12 h注射组为63.33%,24 h注射组为56.67%。凡纳滨对虾在肽聚糖和vp28-si RNA作用后,可增加其对WSSV抗感染作用,降低死亡率,干扰时间越早,对对虾的保护率越高。     

溶藻弧菌对凡纳滨对虾血清中一氧化氮及氧自由基的影响

对凡纳滨对虾注射浓度为1×105、1×106、1×107mL-1的溶藻弧菌悬液,在注射后4、12、24、48、72和120 h于腹血窦取血,测定其血清中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量,以及一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物岐化酶(SOD)活力。结果表明,注射溶藻弧菌后,凡纳滨对虾血清中NO含量及NOS活力显著高于对照组,且NOS活力最大值出现时间较NO早;而SOD活力先升高后下降,MDA含量在SOD活力开始下降后逐渐升高,说明一氧化氮系统对凡纳滨对虾感染的溶藻弧菌有清除作用,并能在一定程度上对损伤过程中生成的氧自由基产生作用。     

斑节对虾白斑综合症杆状病毒感染的实验模式

在建立斑节对虾实验室养殖模式的基础上，对野外采集的有白斑综合症病毒（WSSV）病典型症状的斑节对虾初步纯化其病毒，并进行WSSV的PCR检测，得到WSSV的感染用样品。对健康斑节对虾分别进行浸浴感染，投喂感染和注射感染。对感染死亡个体进行WSSA的PCR检测和细菌检测，证实WSSV感染性和致死性。浸浴感染、投喂感染和注射感染的感染量分别为4mL/L、0.2g/10g虾体、1/2稀释液0.05mL/10g虾体，死亡开始时间分别为16d、42h、28h，三种感染模式最终死亡率100%，从开始死亡到全部死亡延续时间分别为15d、82h、44h。     

斑节对虾白斑综合症杆状病毒感染的实验模式

在建立斑节对虾实验室养殖模式的基础上．对野外采集的有白斑综合症病毒(WSSV)病典型症状的斑节对虾初步纯化其病毒．并进行WSSV的PCR检测，得到WSSV的感染用样品。对健康斑节对虾分别进行浸浴感染，投喂感染和注射感染。对感染死亡个体进行WSSA的PCR检测和细菌检测，证实WSSV感染性和致死性。浸浴感染、投喂感染和注射感染的感染量分别为4mL／L、0．2g／10g虾体、1／2稀释液0．05mL／10g虾体，死亡开始时间分别为16d、42h、28h，三种感染模式最终死亡率100％．从开始死亡到全部死亡延续时间分别为15d、82h、44h。     

凡纳滨对虾野田村病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立快速检测凡纳滨对虾野田村病毒的RT-PCR方法。【方法】根据GenBank中获得的凡纳滨对虾野田村病毒的基因序列,应用Oligo6.0软件设计合成1对特异性扩增引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立快速检测凡纳滨对虾野田村病毒的RT-PCR方法。用该方法对感染野田村病毒的凡纳滨对虾进行RT-PCR检测。【结果】RT-PCR可扩增出与设计相符的413 bp的特异性目的条带,而对白斑症病毒(WSSV)阳性虾、对虾杆状病毒(BP)阳性虾、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)阳性虾、肝胰腺细小病毒(HPV)阳性虾、黄头病毒(YHV)阳性虾、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)阳性虾、桃拉病毒(TSV)阳性虾和健康虾的扩增结果均为阴性。测序比对结果表明,该方法检测结果准确,最低可检测出约100 fg/mL的野田村病毒重组质粒DNA;用该方法对从福建、广东、海南、广西、江苏、浙江、山东等地的386份临床样品进行RT-PCR检测,共检出野田村病毒阳性样品64份。【结论】该方法可用于凡纳滨对虾野田村病毒的快速检测。     

溶藻弧菌疫苗对凡纳滨对虾免疫功能的影响

应用溶藻弧菌疫苗饲喂凡纳滨对虾,测定了弧菌疫苗对凡纳滨对虾免疫指标的影响以及 疫苗的免疫保护作用。结果发现,投喂弧菌疫苗后,溶菌活力在12～20d内迅速增强,在20d时 活力达到最高,VF1组高于VF2和VF3组,但VF2和VF3之间差异不显著;凝集效价在投喂后的 第8天开始升高,在14d时达到最高,实验组的凝集活力均高于对照组,但实验组之间无明显的差 异;而超氧化物歧化酶(SOD)活力和溶血活力变化不明显。以每克饲料含疫苗细胞1.0×109、 1.0×108和1.0×107个的浓度投喂,对凡纳滨对虾的免疫保护率分别为66.7%、46.7%和13.3%。 可见弧菌疫苗对凡纳滨对虾的免疫保护率随疫苗浓度的增大而升高。     

凡纳滨对虾烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析

【目的】研究广东湛江地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)烂尾病主要病原及其药敏特征。【方法】从对虾病灶部位分离纯化细菌,用2株代表菌株对健康虾进行创伤浸浴感染试验,分析菌株形态特征、生理生化特征以及16S rRNA和HSP60基因序列,以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和坎氏弧菌(V. campbelli)溶血素基因特异引物扩增菌株基因组DNA,通过纸片扩散法测试菌株对17种药物的敏感性。【结果】从患病亲虾和养殖对虾分别分离获得编号2018B22和2018MZ1的代表菌,两株菌16Sr RNA和HSP60基因序列均与哈维氏弧菌最相似,且均可被哈维氏弧菌溶血素基因引物特异扩增,表型特征亦与哈维氏弧菌相近;两株菌均可引起凡纳滨对虾烂尾病,其中菌株2018B22的致病力较2018MZ1更强,而后者的耐药谱更广。【结论】湛江地区凡纳滨对虾烂尾病主要病原为哈维氏弧菌。     

溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾虾青素、免疫指标及保护率的影响

从溶藻弧菌中提取肽聚糖,以0.05、0.1、0.15 mg/mL 3种浓度为注射凡纳滨对虾后,测定血淋巴中的血细胞数目、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合成酶(NOS)的活性和虾青素的含量,探讨溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾虾青素含量、免疫指标、免疫保护率的影响。结果表明:注射不同质量浓度的溶藻弧菌肽聚糖都对血清中的血细胞数目、PO、SOD、NOS活性影响显著(p值﹤0.05),对虾青素的含量影响极显著(p值﹤0.01);虾青素的含量与血细胞数目、PO、NOS活性变化趋势无明显的相似性,与SOD活性变化有相似的变化趋势;0.05 mg/mL组的免疫保护率为40%,0.1 mg/mL组为53.33%,0.15 mg/mL组为66.67%。溶藻弧菌肽聚糖可有效地增强凡纳滨对虾非特异免疫力,提高对溶藻弧菌的抗病力,虾青素含量与SOD活性的高低变化趋势相似。     

水解单宁对副溶血弧菌感染凡纳滨对虾血液及血细胞免疫指标的影响

【目的】研究水解单宁饲养的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)胁迫24 h后的生理响应,初步探究水解单宁对凡纳滨对虾血液和血细胞的影响。【方法】在基础饲料中分别添加质量分数为0%(对照组)、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的水解单宁(HTs),饲喂凡纳滨对虾60 d。对对虾注射0.2 mL的副溶血弧菌(2.5×10~8 CFU·mL~(-1)),感染24 h后,分析血细胞凋亡率、活性氧含量(ROS)、一氧化氮含量(NO)、酯酶活性、Toll样受体(TLR)和热休克蛋白70(HSP70)基因的表达水平;测定血清的碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD),总抗氧化能力(T-AOC)和溶菌酶(LZM)活性。【结果】在感染副溶血弧菌24 h后,实验组对虾的血细胞凋亡率,ROS、NO水平显著低于对照组,酯酶活性显著高于对照组(P 0.05)。实验组凡纳滨对虾血清的AKP、ACP、SOD活性,T-AOC和LZM活性均显著高于对照组(P 0.05)。实验组对虾血细胞TLR和HSP70基因的表达水平显著上调(P 0.05)。【结论】饲料中添加水解单宁可提高凡纳滨对虾的非特异性免疫能力和抗氧化功能,阻止氧化损伤的发生,清除机体受到刺激产生的ROS和NO,增强酯酶活性,减少细胞凋亡,从而提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的能力。     

凡纳滨对虾miRNA-184克隆与表达分析

【目的】研究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)miRNA-184 [microRNA-184(miR-184),记作LvmiR-184]在健康虾及染病虾中的表达,探讨其免疫功能。【方法】用茎环法克隆鉴定凡纳滨对虾LvmiR-184,通过荧光定量PCR检测LvmiR-184在对虾血淋巴、肝胰腺、鳃、肌肉、心脏、胃、肠和眼柄等8个组织中的分布。对凡纳滨对虾注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),检测LvmiR-184不同时间点的响应变化。对感染副溶血弧菌的凡纳滨对虾分别注射0.3、3.0和30.0 ng的mi R-184模拟物和抑制物,检测不同时间点对虾血细胞凋亡率。【结果与结论】LvmiR-184在所有组织中均有表达,在胃中表达量最高,其次是肌肉,鳃表达量最低。注射副溶血弧菌后1.5 h,LvmiR-184表达量显著上调;在24 h达到峰值,较对照组高8.25倍;对照组则维持在较低的水平。模拟物、抑制物注射量为30 ng时对虾血细胞凋亡率差异有统计学意义(P 0.05);与对照组凋亡率相比,注射模拟物6 h后提高62%。LvmiR-184可调控凡纳滨对虾的血细胞凋亡。     

凡纳滨对虾输入蛋白α1基因的克隆与表达分析

输入蛋白α(importinα)是核转运蛋白家族的重要成员,可通过帮助具有核定位信号(Nuclear location signal,NLS)蛋白入核而参与免疫过程。克隆并鉴定凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的importinα1基因,命名为Lv IMα1,基因全长c DNA为2 181 bp,包括1 575 bp的开放阅读框,编码525个氨基酸,5′非编码区长110 bp,3′非编码区长496 bp。Smart分析显示,Lv IMα1蛋白包含一个N端的输入蛋白β结合域和一个包含8个串联重复序列的NLS中央结合结构域。同源性分析发现,Lv IMα1与原鸡(Gallus gallus)IMα1的相似度最高,为73%;与水蚤(Daphnia magna)IMα1相似度最低,为61%。系统进化分析显示,Lv IMα1和多种无脊椎动物IMα1聚为一类。实时荧光定量PCR(QRT-PCR)分析表明,Lv IMα1在所测试组织中均有表达,在神经组织中表达量最高。白斑综合征病毒感染后,凡纳滨对虾血液中Lv IMα1基因的表达量呈先下降后上升趋势,除感染后4 h外,其余时间点的表达量均低于对照组(P0.05),12 h最低,为对照组的0.22倍,随后逐渐升高。副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞中Lv IMα1基因表达量低于对照组,在感染后4、24、48、72 h尤为显著,24 h时最低,为对照组的0.38倍。Lv IMα1基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

酵母培养物替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能、血清生化指标、免疫力和抗病力的影响

【目的】探讨高蛋白酵母培养物替代鱼粉对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长性能、血清生化指标、非特异性免疫力和抗病力的影响。【方法】在基础饲料中分别添加质量分数0、2.5%、5.0%和7.5%酵母培养物(记为Y0、Y2.5、Y5.0和Y7.5组),分别替代质量分数0、10%、20%和30%的鱼粉,配制4种等氮等脂饲料,饲喂凡纳滨对虾(初始体质量0.70±0.03 g)56 d后,测定对虾生长性能、血清生化及免疫酶指标;用哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)攻毒,测定对虾累计死亡率。【结果】Y2.5和Y5.0组凡纳滨对虾增重率和特定生长率与Y0组的差异无统计学意义(P> 0.05),Y5.0组凡纳滨对虾摄食率显著高于Y0和Y2.5组(P <0.05);Y5.0组凡纳滨对虾血清甘油三酯含量显著低于Y0组(P<0.05),Y7.5组凡纳滨对虾血清谷丙转氨酶含量显著高于Y0、Y2.5组(P <0.05),血清总胆固醇显著低于Y0、Y2.5组(P <0.05);酵母培养物替代饲料中20%和30%的鱼粉可显著提高对虾攻毒前肝胰腺超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性(P <0.05),Y7.5组对虾肝胰腺丙二醛含量在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)攻毒后显著低于Y0组(P <0.05);攻毒7 d后,Y7.5组凡纳滨对虾累积死亡率显著低于Y0组(P<0.05)。【结论】酵母培养物替代鱼粉比例小于20%时,不会显著影响凡纳滨对虾生长性能;替代比例为30%时,生长受抑制。当替代量比例为30%时可显著提高凡纳滨对虾非特异性免疫力和抗病力。     

广西养殖拟穴青蟹携带病原体状况的初步调查

采用微生物分离培养技术和巢式PCR技术相结合方法对2011年采自广西北海南万和古城、钦州茅岭和钦州港、防城港企沙和公车的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)携带寄生虫、细菌和病毒状况开展调查.寄生虫检测结果显示,仅钦州茅岭拟穴青蟹鳃组织中发现寄生虫茗荷(儿).细菌性病原体检测结果显示,共有11种病原性细菌存在于健康养殖拟穴青蟹体内,弧菌属细菌性病原出现频率最高,其中副溶血弧菌和溶藻弧菌在调查区域内均有分布,其他菌种则呈现一定的地域特异性.病毒性病原体检测结果显示,白斑综合症病毒仅在钦州茅岭拟穴青蟹检出,阳性率为4.94%;双顺反子病毒于北海古城和钦州茅岭拟穴青蟹检出阳性携带率为3.70%;呼肠孤病毒携带率则较高,北海、防城港以及钦州拟穴青蟹均有检出,阳性率达25.93%.由此可见,10-11月广西区内健康养殖拟穴青蟹携带弧菌和呼肠孤病毒的比例远远高于其他病原体,为拟穴青蟹携带的主要病原体.     

凡纳滨对虾含酪氨酸酶结构域血蓝蛋白的免疫功能

【目的】克隆凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)一种新的含酪氨酸酶结构域血蓝蛋白(Tyrosinase-domain containing hemocyanin,TDCH),研究其免疫功能。【方法】根据NCBI上公布的tdch基因序列设计克隆引物,通过RT-PCR方法获得tdch的编码区;采用生物信息学方法分析tdch的结构特征;使用荧光定量PCR技术分析tdch在凡纳滨对虾12个组织中的表达,以及在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphhylococcu saureus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、白斑综合征病毒、脂多糖及聚肌苷酸-聚胞苷酸[Poly(I:C)]刺激后在鳃和血细胞中的表达变化;利用RNAi技术敲降tdch在对虾中的表达,研究其在对虾抗副溶血弧菌免疫中的作用。【结果与结论】克隆获得tdch的编码区全长,编码551氨基酸的蛋白,理论分子质量为63.37 ku,等电点为7.74;tdch除含有血蓝蛋白结构域以外,还含有酪氨酸酶Tyrosinase结构域;tdch在对虾肌肉、肝胰腺、鳃、...     

不同养殖模式虾池弧菌对抗菌药物的耐药性与虾池水质评价

研究了湛江东海岛3种不同养殖模式虾池弧菌对抗菌药物的耐药性,并对虾池水域环境的水温、盐度、DO、pH、叶绿素a、DOC、无机氮、无机磷、硅酸盐、细菌总数和弧菌数量变化进行了监测和评价。结果表明,调查的三个虾池的弧菌对万古霉素产生耐药性,高位新池和传统精养池的弧菌对利福平产生耐药性,对其他抗菌药尚未形成耐性,3个虾池的弧菌对恩诺沙星和氯霉素高度敏感,传统精养池和天然虾池的弧菌对复方新诺明、庆大霉素、TMP和环丙沙星高度敏感;在水平差异上,高位新池的弧菌比传统精养池和天然虾池对12种抗菌药更具耐药性,同时多重耐药菌株在高位新池中出现,可能与虾苗来源和配合饲料中添加了抗菌药物有关。水质监测结果表明,养殖过程中,虾池水域环境逐渐富营养化,无机氮和Chla超过富营养化阈值,细菌总数增加;两个精养池的水体富营养化程度高于天然虾池;调查期间的弧菌数量在对虾发病的感染剂量阈值范围之内,尚无弧菌病害发生的潜在危险。     

壳多糖对罗氏沼虾、斑节对虾苗生长和抗菌防病作用研究

探讨壳多糖（chitosan）对虾苗的生长和抗菌防病的作用。用玻璃缸培育罗氏沼虾和斑节对虾苗,在水体中添加不同浓度的壳多糖,人为感染气单胞菌或弧菌,观测虾苗的生长和抗病情况。结果表明：（1）在培养水体中加入壳多糖（50×10-6）能净化水质,防止水质恶化,因而可进行不换水育苗;（2）壳多糖（25×10-6～100×10-6）可抑制气单胞菌和弧菌的生长繁殖,增强抗病能力,提高虾苗的成活率;（3）适宜浓度25×10－6～50×10-6）的壳多糖对虾苗的生长有促进作用。