江蓠总DNA提取及其PCR扩增方法的建立

通过对CTAB法、SDS法和植物基因组提取试剂盒3种方法提取江蓠Gracilaria总DNA的得率比较,并将得到的总DNA用于限制性酶切和PCR扩增反应进行纯度检测,选择出适合江蓠属总DNA的提取方法,建立了江蓠RAPD、ISSR和ITS等遗传多样性和系统学研究的分子生物学方法.实验结果表明,SDS法和植物基因组提取试剂盒均适用于江蓠总DNA的提取;其中SDS法适用于新鲜和冰冻材料的总DNA提取,不仅得率和纯度高,且方法稳定性好,提取时间较短,在本实验中是江蓠总DNA提取的最佳方法.植物基因组提取试剂盒的得率低,但质量好,操作快速简便,适用于大量新鲜样本总DNA的提取.CTAB法由于相对耗时长且产物稳定性差,不推荐在江蓠中使用.     

柳珊瑚4种不同DNA提取方法的比较研究

通过2种样品前处理方式和4种不同的DNA提取方法相结合,提取橘色刺柳珊瑚(Echinogoria aurantiaca)基因组DNA,并对其18S rRNA基因进行了克隆和测序。实验结果表明,对于2种样品前处理方式,采用纯酒精进行样品前处理比PBS(磷酸缓冲液)进行样品前处理效果要好。在4种不同的DNA提取方法中,以CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组DNA效果最好,其余3种方法如PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)法、高盐法和酚/氯仿法的提取效果较差。并且不同样品的钙质沉淀对DNA都有一定程度的吸附。最后,通过PCR扩增、克隆测序得到橘色刺柳珊瑚18S rRNA基因序列(AY962532)。BLAST软件进行序列比对表明橘色刺柳珊瑚与弱柳珊瑚(Leptogorgia chilensis)的18S rRNA基因(AF052928)同源性最高,为98.79%。     

企鹅珍珠贝非致死性DNA提取方法的研究

在企鹅珍珠贝遗传育种研究中,为保证在贝类存活的条件下获得其DNA信息,采用企鹅珍珠贝(Pteria penguin)贝壳边缘和足丝研究非致死性DNA提取方法。不同于贝壳获取过程中会对实验贝体产生一定损伤,足丝是无生命的细胞外纤维束,其获取方法简单且属于非损伤性取样,对实验贝几乎无伤害,是潜在的获取具足丝贝类基因组DNA的优良材料。本研究采用脱钙与未脱钙两种处理方式,并结合海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒法及有机溶剂萃取法(OSE)提取贝壳及足丝DNA,对获得的贝壳DNA及足丝DNA进行PCR扩增。结果显示,足丝有机溶剂法(OSE法)提取效率显著高于贝壳DNA提取方法,脱钙足丝与未脱钙足丝的DNA提取效率无显著差异,分别为(0.016 7±0.002 9)μg/mg和(0.016 1±0.003 1)μg/mg。未脱钙足丝的OSE法获得的DNA产物纯度最优, A260/280值为1.400 0±0.040 0,A260/230值显著高于贝壳DNA及足丝DNA的其他提取方法,为0.910 0±0.080 0。除脱钙贝壳OSE法外,其他所有DNA提取方法均可用于后续PCR扩增,测序结果表明...     

马氏珠母贝DNA快速一步法(ROSE)提取及ISSR-PCR应用

以马氏珠母贝(Pinctada martensii)为材料，采用一步法(ROSE)提取DNA，并将提取的DNA应用于ISSR扩增。结果表明：ROSE法提取DNA比常用的SDS法简易，快捷，无污染物产生，节省费用99％，DNA提取效率相当。ROSE法和常用的SDS法提取的DNA分别用于ISSR分析．可以获得一致性很好的扩增效果。因此，ROSE法提取DNA是一种适合于海洋贝类大规模提取DNA的有效方法。     

海绵动物保存及DNA提取方法的研究

海绵标本长期、完整的保存是开展海绵分类学及分子进化研究的重要前提, 本研究以建立通用的海绵动物标本的保存方法及快速、完整的基因组DNA 提取方法为主要目的, 通过对硅质的山海绵(Mycale sp.)和钙质的白枝海绵(Leucosoleniidae sp.)为材料进行–20℃冰冻、乙醇固定、冰冻后风干和乙醇固定后风干等4 种保存方法进行研究, 同时采用酚-氯仿法、高盐法、CTAB 法等3 种基因组DNA提取方法, 测试了4 种保存方法的DNA 提取效率。实验结果显示, 海绵样品的4 种保存方法以及3 种DNA 提取方法对于硅质海绵以及钙质海绵虽然在提取的DNA 得率上有差异, 但都能获得较高纯度基因组DNA。从经济成本、方便性、潜在的污染等因素考虑, 高盐法是首选的提取海绵基因组DNA 的方法; 乙醇固定保存的海绵样品DNA 得率最高, 冰冻的海绵样品得率最低, 推荐采用乙醇固定保存海绵样品的方法。     

固定标本的DNA提取及PCR扩增

报道福尔马林、酒精固定的日本绒螯蟹标本的 DNA提取及 PCR扩增 ,并与冷冻、煮沸标本进行了比较。结果表明 ,福尔马林固定标本与酒精固定标本一样可以提取 DNA,加入的蛋白酶 K量越多 ,DNA的回收率越高。以提取的 DNA为模板 ,进行了线粒体 DNA12 S r RNA和 D- loop基因片段的 PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物后均得到了与期待的碱基长度相一致的清晰谱带。     

大弹涂鱼基因组DNA两种提取法的比较

采用传统的饱和酚提取法和上海生物工程公司的UN IQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒法对大弹涂鱼的总DNA进行了提取。琼脂糖凝胶电泳结果表明,得到的DNA片段分子量在21 kb以上;通过PCR扩增实验,证明了用两种方法提取的DNA均可直接用于随机扩增的DNA多态性(RAPD)遗传标记;试剂盒法具有简单、快速、高效的优点,是一种值得推荐的DNA提取方法。     

几种海洋微藻基因组DNA的分离提取及PCR检测

用改良CTAB法分别提取6种海洋微藻的基因组DNA,发现提取的DNA纯度、产率高(>100μg.g-1鲜重),DNA完整性好。以6种海洋微藻的基因组DNA为模板,并以5'TTCGAGCCAG3'(OPC-01)为随机引物,对PCR反应条件进行研究。结果表明,25μl反应体系中,Mg2 、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA和dNTP 5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:2.0mmol.L-1、1.6U、20pmol.L-1、50ng和2.5mmol.L-1。扩增程序优化为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,循环45次,最后于72℃再延伸10min。酶切实验结果表明,6种海洋微藻的基因组DNA都能被EcoRⅠ酶切,酶切图谱呈弥散状,满足分子水平操作的要求,可直接应用于进一步的分子生物学实验。     

海湾扇贝样品不同保存条件下DNA的提取及RAPD扩增比较

以海湾扇贝为材料，研究了鲜活样品以及采用冷冻保存、70％乙醇固定和10％福尔马林固定等方法保存的闭壳肌样品用于DNA提取的不同效果，并分析了不同保存条件下所提得DNA用于RAPD扩增的结果，研究表明，鲜活样品以及采肜冷冻保存和70％乙醇固定的样品可以得到很好的DNA，其质量和得率没有显著差异，利用上述DNA模板进行RAPD分析，可以获得一致性很好的扩增结果。10％福尔马林休固定样品则没有得到可用的DNA模板。采用70％乙醇固定保存海洋生物组织，是用于DNA提取及相关的分子生物学研究的快速、简易和有效的方法。     

海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究

沉积物成分复杂,腐殖酸等物质含量较高,这些杂质在DNA提取过程中不易除去,可能会对后续的PCR扩增等产生抑制作用。因此,高质量DNA的获得是海洋微生物分子生态学研究的基础和前提。本研究采用6种不同的方法,分别提取同一来源海洋沉积物样品中的微生物基因组DNA。对DNA纯度、得率、16SrRNA基因拷贝数和微生物群落特征等多方面进行比较,结果表明:方法1(QIAamp DNA Stool Mini Kit)、方法2(PowerSoil~DNA Isolation Kit)和方法3(RNA PowerSoil~DNA Elution Accessory Kit)得到的DNA产量较低,纯度却较高,可以直接用于后续分子生物学分析;与方法2相比,方法3得到的细菌16SrRNA基因拷贝数和单位质量DNA中可扩增细菌16SrRNA基因模板量较低;方法4(SDS高盐法)得到的DNA虽然产量高,但杂质含量也高,抑制了后续PCR反应的进行;方法5(方法4得到的DNA经QIAamp DNA Stool Mini Kit纯化)和方法6(方法4得到的DNA经PowerSoil~DNA Isolation Kit纯化),虽然纯度有所提高,但DNA大量损失,且耗时长,花费高。另外,方法2在提取过程中可以最大程度裂解菌体细胞壁,能更好反映微生物群落特征。综合以上结果,方法2(PowerSoil~DNA Isolation Kit)提取海洋沉积物微生物基因组DNA效果最佳。本研究可为海洋微生物分子生态学研究提供一种有效的技术手段。     

深海沉积物中微量DNA的提取及应用

采用化学裂解和酶解相结合的方法，进行了深海沉积物中微量DNA的提取，并采用DNA吸附树脂进行纯化。结果表明，该方法能有效地去除沉积物中的腐殖酸等抑制剂，每克湿重沉积物样品可得到DNA约16μg，回收率可达95％，所得到的DNA分子片段均在23kb左右，纯化后的DNA可直接应用于各种分子生物学操作。利用细菌16SrDNA通用引物对所提取的深海沉积物DNA进行了PCR—RRJ及系统发育分析，各主要细菌类群均能检出，证实该方法可以应用于深海等极端环境中微生物的多样性调查、系统发育分析以及特殊功能基因的筛选，同时还可应用于环境样品中生物量的半定量估计。     

DNA/RNA提取及处理方法对评价沉积物中纤毛虫分子多样性的影响

环境DNA(eDNA)技术结合高通量测序已广泛应用于评价微型生物多样性与群落构成。相较于eDNA,RNA在环境中易降解,环境RNA(eRNA)可更准确地反映群落近期生命活性状态。理论上,基于eRNA检获的生物多样性要低于eDNA检获的总体多样性。但前期已发表研究显示同一站点eDNA获得的多样性低于eRNA检获量,推测可能原因包括:1)样本量不同;2)RNA中存在DNA污染。为验证假设,本研究以陆架区2个站位沉积物中的纤毛虫为实验对象,系统性比较4种DNA/RNA提取方法:DNA直接提取(0.9 g沉积物),大样本量DNA直接提取(2 g), DNA洗脱法(2 g), RNA直接提取法(2g);以及3种RNA提取后的处理方法:无DNA酶反转录,含DNA酶反转录,先纯化RNA再反转录。研究结果表明,大样本量(2 g)DNA直接提取法所检获的可操作分类单元(OTUs)约为小样本量(0.9 g)的2倍。相同样本量下, DNA洗脱法检获的OTUs最多,而DNA直接提取检获的OTUs低于有/无DNA酶反转检获的数量,先纯化再反转录所获得OTUs最少。就群落构成而言, DNA洗脱法和RNA纯化可有效...     

单条固定线虫基因组DNA提取及18S rRNA基因PCR扩增

根据线虫18S核糖体RM基因PCB扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇 0．05mol／L FDTA(pH8．0)和5％海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备RR模板DNA,而5％海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。结果有助于分子生物学方法在海洋线虫分类、多样性和生态学研究中的应用。     

HUMIC SUBSTANCES IN SEDIMENTS

In this paper the chemical characteristics of humic substances (humic acid and fulvic acid) from East China Sea surficial sediment are studied through combination of chemical and physical methods. Results show that humic acids have less aromatic hydrocarbon and more alkane structure.The contents of amino acids from hydrolyzate of humic substances are different. The amount of various amino acids (such as acidic, neutral or basic amino aicd) of fulvic acid is higher than that of humic acid. The distribution order of amino acid abundance in various kinds of sediments is neutral amino acid>aromatic amino acid> basic amino acid.In addition, mathematical statistic method is also used to study their distribution. All samples show similar regularities, i. e., the contents of glycine, alanine, aspartic and glutamic are very high and those of cystine and methionine are very low or even disappear.The above results further confirm that humic acid and fulvic acid have similar composition and structure.     

Distribution of oxygen-containing functional groups and elements in humic acids from marine sediments

The elemental composition and oxygen-containing functional groups contents in the marine humic acids from the five sediment samples from Sagami Bay and Suruga Bay were determined. Kumada's method of classification of soil humic acids was applied to the marine humic acids. The carbon, nitrogen, hydrogen, oxygen and sulfur contents of the marine humic acids were, on average, 52.96, 5.12, 5.79, 34.99 and 1.13%, respectively, without wide variation. In comparison with terrestrial humic acids, the marine ones had relatively lower carbon content and higher hydrogen and nitrogen contents. It is suggested that the marine humic acids have more aliphatic and less aromatic character, as expected from their possible origins, e.g., phytoplankton. The total acidity, carboxyl, phenolic and alcoholic hydroxyl, carbonyl and methoxyl group contents in the marine humic acids were, on average, 5.80, 3.27, 2.53, 2.53, 3.09 and 0.41 milliequivalents per gram of dry ash-free humic acid (me g^–1), respectively. From quantitative data on the elemental composition and functional groups of the average marine humic acid, its empirical formula was calculated to be C₁₀₇H₁₃₈O₂₀(COOH)₉(OH)₇ ^phenolic (OH)₇ ^alcoholic (CO)₉(OCH)₃N₁₀S. The marine humic acids were similar to the so-called B type of soil humic acids with regard to the distribution of functional groups and spectroscopic properties.     

高效非损伤性扇贝DNA提取方法的建立及效果评价

本研究建立了一种高效、经济的非损伤性扇贝DNA提取方法,在不影响扇贝个体生存状态的前提下,采用擦拭法和室温裂解相结合的方式在20 min内即可获得个体基因组DNA。以虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)为实验对象,研究了不同擦拭材料(棉签、滤纸)和不同擦拭部位(外套膜、鳃丝、内脏团)的核酸提取效果,评估了本方法在贝类基因分型领域应用的可行性。研究表明,用棉签、滤纸2种材料擦拭扇贝的鳃丝、内脏团或外套膜组织均能获得主带清晰完整的基因组DNA,且不影响扇贝的存活状态。在3种扇贝中采用棉签擦拭法的DNA得率均高于滤纸法,以这2种方式获得的DNA为模板进行SSR和SNP标记分析,能获得均一稳定的扩增条带,SSR标记分型结果准确可靠。本研究建立了简便、快速进行扇贝基因型分析的非损伤性DNA提取方法,为贝类全基因组选育和珍稀贝类资源的种质保护开发提供了新的技术手段。     

Characterization of humic and fulvic acids isolated from marine sediments of Sagami and Suruga Bays with C-13 and proton nuclear magnetic resonance

The C-13 and proton NMR spectra of marine humic and fulvic acids isolated from sediments of Sagami and Suruga Bays and Aldrich humic acid were obtained using pulse Fourier transform mode. The C-13 and proton NMR spectra, which clarified the differences in chemical characteristics among the various humic substances, showed that the marine humic acids had more aliphatic and less aromatic character than the Aldrich humic acid, and the marine fulvic acids had polysaccharide-like character. The C-13 NMR spectra of the marine humic substances, in particular, had many relatively well-resolved peaks with significant intensities, indicating the presence of variously bonded carbon atoms in them.